Modelando os efeitos do estresse hemodinâmico em células tumorais circulantes usando uma seringa e agulha

Resumo

Aqui demonstramos um método para aplicar o estresse da tesoura de fluido às células cancerosas em suspensão para modelar os efeitos do estresse hemodinâmico nas células tumorais circulantes.

Resumo

Durante a metástase, as células cancerígenas de tecidos sólidos, incluindo a epitélia, ganham acesso à circulação linfática e hemógena, onde são expostas ao estresse mecânico devido ao fluxo hemodinâmico. Uma delas salienta que a experiência das células tumorais circulantes (CTCs) é o estresse da tesoura de fluidos (FSS). Embora as células cancerígenas possam experimentar baixos níveis de FSS dentro do tumor devido ao fluxo intersticial, os CTCs são expostos, sem apego à matriz extracelular, a níveis muito maiores de FSS. Fisiologicamente, o FSS varia mais de 3-4 ordens de magnitude, com baixos níveis presentes em linfáticos (<1 dyne/cm²) e os níveis mais altos presentes brevemente à medida que as células passam pelo coração e ao redor das válvulas cardíacas (>500 dynes/cm²). Existem alguns modelos in vitro projetados para modelar diferentes faixas de estresse fisiológico de tesoura ao longo de vários períodos de tempo. Este artigo descreve um modelo para investigar as consequências de pulsos breves (milissegundos) de FSS de alto nível na biologia celular do câncer usando um simples sistema de seringa e agulha.

Introdução

A metástase, ou a disseminação do câncer para além do local inicial do tumor, é um fator importante na mortalidade por câncer¹. Durante a metástase, as células cancerígenas utilizam o sistema circulatório como uma rodovia para disseminar para locais distantes em todo o corpo^2,3. Enquanto estão a caminho desses locais, as células tumorais circulantes (CTCs) existem dentro de um microambiente dinâmico de fluidos diferente do tumor primário original^3,4,5. Foi proposto que esse microambiente fluido é uma das muitas barreiras à metástase⁴. Há ampla concordância no conceito de ineficiência metastática, ou seja, que a maioria dos CTCs que entram na circulação perecem ou não formem colônias metastáticas produtivas^6,7,8. No entanto, por que a metástase é ineficiente na perspectiva de um CTC individual é menos certa e continua sendo uma área ativa de investigação. Os CTCs são separados da matriz extracelular, privados de fatores solúveis de crescimento e sobrevivência que podem estar presentes no tumor primário, e expostos ao sistema imunológico e às forças hemodinâmicas de uma maneira muito diferente do tumor primário⁴. Cada um desses fatores pode contribuir para a má sobrevivência dos CTCs, mas suas contribuições relativas não são claras. Este artigo aborda a questão de como as forças hemodinâmicas afetam os CTCs.

Estudar os efeitos das forças hemodinâmicas nos CTCs é bastante desafiador. Atualmente, não existem sistemas in vitro projetados que possam replicar toda a dinâmica espostetemporal (coração para capilares) e propriedades reológicas do sistema vascular humano. Além disso, a forma como os CTCs experimentam o sistema circulatório não é totalmente clara. Evidências experimentais indicam que a maioria das células cancerígenas não circulam continuamente como células sanguíneas. Em vez disso, devido ao seu tamanho relativamente grande (10-20 μm de diâmetro), a maioria dos CTCs ficam presos em leitos capilares (6-8 μm de diâmetro) para períodos variáveis de tempo (s a dias) onde podem morrer, extravasar ou serem deslocados para o próximo leito capilar^8,9,10,11. No entanto, há algumas evidências de que o tamanho do CTC pode ser mais heterogêneo in vivo, e que ctcs menores são detectáveis¹². Portanto, com base na distância e na velocidade do fluxo sanguíneo, os CTCs só podem circular livremente por uma questão de segundos entre esses períodos de armadilha, embora falta uma descrição quantitativa desse comportamento¹³.

Além disso, dependendo de onde os CTCs entram na circulação, eles podem passar por vários leitos capilares no pulmão e outros locais periféricos e através do coração direito e esquerdo antes de chegar ao seu destino final. Ao longo do caminho, os CTCs são expostos a vários estresses hemodinâmicos, incluindo o estresse da cisalhamento de fluidos (FSS), forças compressivas durante sua armadilha na microcirculação e, potencialmente, forças de tração sob circunstâncias onde podem exibir rolamento semelhante a leucócitos ao longo das paredes dos vasos sanguíneos¹⁴. Assim, tanto a capacidade de modelar a circulação quanto a compreensão do comportamento do CTC a ser modelado é limitada. Por causa dessa incerteza, quaisquer achados de sistemas de modelos in vitro devem ser validados em um organismo experimental de vertebrados e, finalmente, em pacientes com câncer.

Com as ressalvas acima mencionadas, este artigo demonstra um modelo relativamente simples de aplicar FSS às células em suspensão para sondar os efeitos do FSS nos CTCs descritos pela primeira vez em 2012¹⁵. FSS resulta do atrito do fluxo sanguíneo contra a parede do vaso, que produz um gradiente de velocidade parabólica sob condições de fluxo laminar em vasos maiores. As células experimentam níveis mais altos de FSS perto de paredes de vasos e níveis mais baixos perto do centro do vaso sanguíneo. Viscosidade fluida, taxa de fluxo e dimensões do conduíte através do qual o fluxo ocorre influenciam FSS, como descrito pela equação de Hagen-Poiseuille. Isso se aplica aos fluxos sanguíneos comportando-se como fluidos newtonianos, mas não se sustenta para a microcirculação. O FSS fisiológico abrange várias ordens de magnitude com os níveis mais baixos nos linfáticos (<1 dyn/cm²) e o mais alto em regiões ao redor de válvulas cardíacas e placas ateroscleróticas (>500 dyn/cm²)⁵. O estresse médio da tesoura de parede nas artérias é de 10-70 dyn/cm² e 1-6 dyn/cm² nas veias^16,17.

No coração, as células podem ser expostas a fluxos turbulentos ao redor de folhetos de válvulas onde fss de alto nível, mas de curta duração pode ser experimentado^18,19. Embora o campo de bioprocessamento tenha estudado há muito tempo os efeitos da FSS sobre células mamíferas em suspensão, essas informações podem ser de valor limitado para entender os efeitos do FSS nos CTCs, pois geralmente se concentra em níveis muito mais baixos de FSS aplicados ao longo de uma longa duração^{de 20}. Como descrito abaixo, usando uma seringa e agulha, pode-se aplicar relativamente alto (dezenas a milhares de dyn/cm²) FSS para uma duração relativamente curta (milissegundos) a uma suspensão celular. Desde a descrição inicial deste modelo^15,outros o utilizaram para estudar os efeitos da FSS nas células cancerosas^21,22,23. Vários "pulsos" de FSS podem ser aplicados em suspensões celulares em um curto período de tempo para facilitar análises experimentais a jusante. Por exemplo, este modelo pode ser usado para medir a capacidade das células de resistir à destruição mecânica por FSS medindo a viabilidade celular em função do número de pulsos aplicados. Alternativamente, os efeitos da exposição da FSS na biologia das células cancerosas podem ser explorados coletando células para uma variedade de análises a jusante. É importante ressaltar que parte da suspensão celular é reservada como um controle estático para comparar os efeitos do FSS daqueles que podem estar associados ao descolamento celular e tempo mantido em suspensão.

Protocolo

1. Preparação celular

1. Libere células do prato de cultura tecidual quando 70-90% confluentes seguindo as diretrizes recomendadas para a linha celular em uso.
   1. Por exemplo, aspire o meio de crescimento para células PC-3, e lave o prato de 10 cm de células com 5 mL de soro fisco sem fosfato e 5 mL de salina tamponada sem cálcio e magnésio (PBS).
   2. Aspire o PBS antes de adicionar 1 mL de trippsina de 0,25% usando o protocolo do fabricante.
   3. Após observar o descolamento das células sob um microscópio invertido, adicione 5 mL de DMEM:F12 médio contendo 10% de soro bovino fetal para inibir a trippsina.
2. Coloque a suspensão da célula em um tubo cônico.
3. Determine a concentração celular e o número total da célula.
4. As células de pelotas por centrifugação (300 × g por 3 min), aspiram o supernasce, e resuspendam células em cultura tecidual livre de soro para 5 × 10⁵ células/mL.
   NOTA: É fundamental que o meio de ensaio contenha pelo menos 1,17 mM Ca⁺⁺ como ca⁺⁺ extracelular foi demonstrado ser necessário para resistência celular ao FSS¹⁵.

2. Exposição de estresse de calha de fluidos

1. Antes de expor células ao FSS, corte um tubo de poliestireno de 14 mL na linha de 7 mL. Misture a suspensão celular, coloque 5 mL da suspensão no tubo de corte e colete amostras de controle estático.
   NOTA: O volume necessário para coletar para a amostra estática depende do ensaio de viabilidade utilizado (ver etapa 3).
2. Desenhe a suspensão da célula em uma seringa de 5 mL e conecte uma agulha de 30 G 1/2". Despreste a agulha, coloque a seringa sobre uma bomba de seringa, proteja a seringa e defina a taxa de fluxo para atingir o nível desejado de FSS.
   NOTA: A Tabela 1 mostra o estresse máximo da cisalhamento da parede para diferentes agulhas e taxas de fluxo, bem como o nível mínimo de FSS dependendo do tamanho da célula (10, 15 e 20 μm). Inspecione a agulha antes de ser usada para garantir que ela não esteja dobrada; se incerto, substitua a agulha por uma nova. A integridade da agulha pode ter um impacto significativo no nível de FSS aplicado.
3. Execute a bomba de seringa e colete a amostra de corte no tubo de corte em um ângulo aproximado de 45° para reduzir a espuma. Colete uma amostra dependendo do tipo de ensaio de viabilidade ou das necessidades de ensaio a jusante.
   1. Remova cuidadosamente a seringa e a agulha da bomba de seringa e use um alicate para remover a agulha da seringa, tomando o cuidado de não tocar na agulha.
      NOTA: Agulhas não chanfradas podem ser usadas intercambiavelmente com agulhas chanfradas como medida de segurança adicional.
4. Desenhe a suspensão de corte de volta para a seringa, recoloque cuidadosamente a agulha usando alicate e coloque-a de volta na bomba de seringa.
5. Repita as etapas 2.3 e 2.4 até que a suspensão da célula tenha sido exposta ao número desejado de pulsos de FSS.
   NOTA: Para avaliar a capacidade das células de resistir à destruição mecânica da exposição ao FSS, a suspensão celular é tipicamente submetida a 10 pulsos de FSS. No entanto, foi demonstrado que as células começam a se submeter a adaptações biológicas em resposta ao FSS após 2 pulsos²⁴.

3. Medição de viabilidade

NOTA: A viabilidade pode ser avaliada utilizando ensaios enzimáticos (luciferase, resazurina e WST-1), contando células intactas, citometria de fluxo ou por ensaios clonogênicos.

1. Para todas as medidas de viabilidade, colete uma amostra antes de expor células à FSS.
   1. Para ensaios enzimáticos, pegue alíquotas duplicadas de 100 μL e coloque-as em uma placa de 96 poços.
   2. Para citometria de fluxo, pegue uma alíquota de 500 μL e coloque-a em um tubo de 1,5 mL.
   3. Para ensaio clonogênico, colete uma alíquota de 100 μL.
2. Ensaio enzimático
   1. Colete 100 amostras de μL após 1, 2, 4, 6, 8 e 10 pulsos de exposição fss e coloque-as em uma placa de 96 poços.
   2. Adicione o substrato desejado e siga o protocolo para o ensaio utilizado:
      1. Para resazurina, adicione 20 μL de uma solução de 0,15 mg/mL para cada poço. Adicione 20 μL de solução de resazurina de 0,15 mg/mL a poços que contenham 100 μL de meio sozinho. Incubar por 2 h em uma incubadora de cultura de tecido de 37 °C. Meça a absorvância utilizando um leitor de placas capaz de ler fluorescência (579 excitação/ 584 emissão).
      2. Para células que expressam luciferase, adicione 100 μL de 15 mg/mL D-luciferin a 5 mL de médio. Adicione 100 μL dessa solução a cada poço que contenha células. Aguarde 5 minutos e leia a placa usando um leitor compatível com luminescência.
      3. Para WST-1, adicione 10 μL de WST-1 a cada poço, incluindo poços contendo apenas meio. Incubar por 4h e, em seguida, ler a absorvância entre 420 e 480 nm usando um leitor de placas.
   3. Compare o sinal médio de cada uma das amostras expostas ao FSS com a amostra média de controle estático para obter a porcentagem de células viáveis.
3. Citometria de fluxo²⁴
   1. Colete 500 amostras de μL e coloque-as em tubos de centrífugas de 1,5 mL após 1, 2, 5 e 10 pulsos de FSS.
   2. Amostras centrífugas (500 × g por 3 min) e descartam os sobrenantes.
   3. Resuspengue as pelotas com 1 mL de PBS livre de cálcio e magnésio e centrífugue as amostras (300 × g por 3 min).
   4. Suspenda as pelotas com 500 μL de tampão de triagem celular ativado por fluorescência (FACS) (PBS com albumina de soro bovino de 0,5% e 0,1% de azida de sódio) com a contagem de contas e corantes de membrana impermeáveis ou viáveis, como iodeto de propidium (1,75 μg/mL).
   5. Determinar a viabilidade comparando a razão de células viáveis, normalizadas à contagem de contas, em amostras desarmadas com a da amostra estática.
4. Ensaio clonogênico
   1. Pegue 100 μL da amostra estática e adicione 900 μL de meio de crescimento para fazer uma diluição de 1:10.
   2. Pegue 100 μL da amostra diluída de 1:10 e adicione 900 μL de meio de crescimento para fazer uma diluição final de 1:100.
   3. Adicione 100 μL da amostra de diluição de 1:100 em cada um dos 3 poços de um prato de 6 poços contendo 2 mL de meio de crescimento.
   4. Repetição de passos 3.4.1-3.4.3 com amostras que foram submetidas a 10 pulsos de FSS.
   5. Deixe as células crescerem por 7-10 dias sem alterar o meio, e verifique se há formação de colônia. Uma vez formadas colônias de ≥50 células, aspirem o meio de crescimento, enxáguem cada poço com 1 mL de PBS, aspirem o PBS e fixem por 5 min usando 1 mL de etanol gelado de 70% (EtOH). Importante, fixar amostras de tesoura e estática ao mesmo tempo
   6. Depois de fixar as amostras, aspire o EtOH e adicione 1 a 2 mL de solução violeta cristalina (0,1% violeta cristalina em 90% H₂O, 10% EtOH) por 5 min.
   7. Enxágüe com um excesso de água, e deixe a placa secar
   8. Conte as colônias (aglomerados de ≥50 células) para as amostras estáticas e desarquivadas. Compare a razão do número médio de colônias da amostra de tesoura com o número médio de colônias da amostra estática para determinar a viabilidade.

Resultados

A resistência elevada à destruição mecânica induzida pelo FSS tem sido anteriormente demonstrada como um fenótipo conservado em múltiplas linhas de células cancerosas e células cancerígenas recém-isoladas de tumores relativos aos comparadores de células epiteliais não transformadas^15,24. Aqui, linhas adicionais de células cancerígenas de uma variedade de origens teciduais (Tabela 2) foram testadas para demonstrar que a maioria dess...

Discussão

Este artigo demonstra a aplicação de FSS às células cancerígenas em suspensão usando uma seringa e agulha. Usando este modelo, as células cancerígenas têm se mostrado mais resistentes a pulsos breves de FSS de alto nível em relação às células epiteliais não transformadas^15,22,24. Além disso, a exposição ao FSS usando este modelo resulta em um rápido aumento da rigidez celular, ativação de RhoA e aumento da c...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin	Gibco	25200-056
14 mL round bottom tubes	Falcon - Corning	352059
30 G 1/2" Needle	BD	305106
5 mL syringe	BD	309646
96-well black bottom plate	Costar - Corning	3915
Bioluminescence detector	AMI	AMI HTX
BSA, Fraction V	Sigma	10735086001
Cell Titer Blue	Promega	G8081
crystal violet	Sigma	C0775
D-luciferin	GoldBio	D-LUCK
DMEM	Gibco	11965-092
FBS	Atlanta Biologicals	S11150
PBS	Gibco	10010023
Plate Reader	BioTek	Synergy HT
Sodium Azide (NaN3)	Sigma	S2002
Syringe Pump	Harvard Apparatus	70-3005