注射器と針を用いた循環腫瘍細胞に及ぼす血行力学的ストレスのモデル化

要約

ここでは、懸濁液中の癌細胞に流体せん断応力を適用し、循環腫瘍細胞に及ぼす血行力学的ストレスの影響をモデル化する方法を示す。

要約

転移の間、上皮を含む固体組織からの癌細胞は、血行性の流れによる機械的ストレスにさらされるリンパおよび血球循環にアクセスする。これらのストレスの 1 つは循環腫瘍細胞 (CTC) 経験は流体せん断応力 (FSS) です。がん細胞は間質流のために腫瘍内で低レベルのFSSを経験する可能性がありますが、CTCは細胞外マトリックス付着なしで、はるかに大きなレベルのFSSに曝露されます。生理学的には、FSSは3〜4桁を超え、リンパ系(<1 dyne/cm²⁾に存在する低レベルと、細胞が心臓と心臓弁の周りを通過する時点で短時間存在する最高レベル(>500ダイン^/cm2)を有する。さまざまな時間枠にわたって生理学的剪断応力の異なる範囲をモデル化するように設計された いくつかのin vitro モデルがあります。本論文では、単純な注射器と針システムを用いて、がん細胞生物学における高レベルFSSの短い(ミリ秒)パルスの結果を調べるモデルについて説明する。

概要

転移、または初期腫瘍部位を超える癌の広がりは、癌死亡率の基礎となる主要な要因^である。転移の間、癌細胞は循環系を高速道路として利用して、身体^2、3を通して遠くの部位に広がる。これらの部位に向かう途中で、循環腫瘍細胞(CTC)は、元の原発腫瘍^3、4、5とは異なり、動的流体微小環境内に存在する。この流体微小環境は転移に対する多くの障壁の1つであると提案されている^。転移性非効率の概念には広く一致している、すなわち、循環に入るほとんどのCTCが滅びるか、または生産的な転移コロニーを形成しないこと^6、7、8。しかし、なぜ個々のCTCの観点から転移が非効率的なのかは、あまり確実ではなく、依然として活発な調査分野である。CTCは、細胞外マトリックスから剥離され、原発性腫瘍に存在し得る可溶性増殖および生存因子を奪われ、原発腫瘍⁴とは大きく異なる方法で免疫系および血行力力にさらされる。これらの要因のそれぞれは、CTCの貧しい生存に寄与するかもしれないが、その相対的な貢献は不明である。本稿では、血行力がCTCに与える影響について論じ合う。

CTCに対する血行力の影響を研究することは非常に困難です。現在、人間の血管系の全体の時空間的ダイナミクス(心臓から毛細血管)およびレオロジー特性を複製できる、設計されたインビトロシステムはありません。さらに、CTCが循環系をどのように経験するかを完全には明らかではありません。実験的証拠は、ほとんどの癌細胞が血液細胞のように連続的に循環しないことを示している。むしろ、比較的大きなサイズ(直径10〜20μm)のため、ほとんどのCTCは、キャピラリーベッド(直径6〜8μm)に閉じ込められ、死んだり、空入部を起用したり、次のキャピラベッド^{8、9、10、11}に変位したりする可能性があります。しかし、CTCサイズは生体内でより異種であり、より小さなCTCが検出可能な¹²であるといういくつかの証拠がある。従って、距離および血流速度に基づいて、CTCは、これらの捕捉期間間の数秒間だけ自由に循環し得るが、この挙動の定量的記述は¹³を欠いている。

さらに、CTCが循環に入る場所に応じて、肺および他の周辺部位の複数の毛細血管床を通過し、最終目的地に到達する前に左右の心臓を通過する可能性があります。途中、CTCは、流体せん断応力(FSS)、微小循環中の圧縮力、血管壁¹⁴に沿って白血球様転がりを示す可能性がある状況下での牽引力を含む様々な血行力学的ストレスにさらされる。したがって、循環をモデル化する能力と、モデル化するCTC挙動の理解の両方が制限される。この不確実性のために 、in vitro モデルシステムからの知見は、実験的な脊椎動物生物で、そして最終的には癌患者で検証されるべきである。

前述の注意点を用いて、この論文は、2012¹⁵年に最初に説明されたCTCに対するFSSの影響を調査するために、懸濁液中の細胞にFSSを適用する比較的単純なモデルを示している。FSSは血管壁に対する血流の摩擦に起因し、より大きな血管における層流の条件下で放物線速度勾配を生じる。細胞は、血管壁付近のFSSの高レベルおよび血管の中心付近の低レベルを経験する。流体粘度、流量、および流れが発生する導管の寸法は、ハーゲン・ポイズイユ方程式で説明されているようにFSSに影響を与えます。これは、ニュートン流体として動作する血液の流れに適用されますが、微小循環のために保持されません。生理学的FSSは、リンパ球の最低レベル(<1 dyn/cm²⁾と心臓弁およびアテローム硬化性プラーク(>500 dyn/cm²⁾周辺の領域で最も高いレベルの数桁にわたって及ぶ^5。動脈の平均壁せん断応力は、静脈^16、17の10-70 dyn/cm²および^1-6dyn/cm²である。

心臓では、細胞は非常に高レベルであるが、非常に短い期間のFSSが^18、19を経験することができる弁のチラシの周りの乱流の流れにさらされるかもしれない。バイオプロセシング分野は長い間、哺乳類細胞に対するFSSの懸濁液への影響を研究してきたが、この情報は、一般的に長期間²⁰回にわたって適用されるFSSのはるかに低いレベルに焦点を当てているため、CTCに対するFSSの影響を理解するための限られた価値がある可能性がある。後述するように、注射器および針を用いて、細胞懸濁液に比較的短い(ミリ秒)持続時間のために比較的高い(数十〜数千のdyn/cm2)FSSを適用することができる。このモデル¹⁵の最初の説明以来、他の人は癌細胞^21、22、23に対するFSSの影響を研究するためにそれを採用している。FSSの複数の「パルス」を短時間で細胞懸濁液に適用して、下流の実験分析を容易にします。例えば、このモデルは、適用されるパルス数の関数として細胞の生存率を測定することによって、FSSによる機械的破壊に抵抗する細胞の能力を測定するために使用することができる。あるいは、がん細胞の生物学に及ぼすFSS曝露の効果は、さまざまな下流分析のために細胞を採取することによって探索することができる。重要なことに、細胞懸濁液の一部は、細胞剥離および懸濁液に保持される時間に関連する可能性のあるFSSの効果を比較するために、静的制御として予約されている。

プロトコル

1. 細胞の調製

1. 使用している細胞株に推奨されるガイドラインに従うことによって、70〜90%コンフルエントの場合に組織培養皿から細胞を放出する。
   1. 例えば、PC-3細胞の増殖培地を吸引し、カルシウム及びマグネシウムフリーリン酸緩衝生理食塩水(PBS)の5mLで細胞の10cm皿を洗浄する。
   2. メーカーのプロトコルを使用して0.25%トリプシンの1 mLを追加する前にPBSを吸引してください。
   3. 逆顕微鏡下で細胞の剥離を観察した後、トリプシンを阻害するために10%のウシ胎児血清を含むDMEM:F12培地の5 mLを加える。
2. 細胞懸濁液を円錐管に入れる。
3. 細胞の濃度と総細胞数を決定します。
4. 遠心分離(3分間300×g)によるペレット細胞、上清を吸引し、5×5細胞/mLの無血清組織培養培地中の細胞を再懸濁した。
   注:細胞外Ca⁺⁺がFSS¹⁵に対する細胞抵抗性に必要であることが実証されているように、アッセイ媒体が少なくとも1.17 mM Ca⁺⁺を含むことが重要です。

2. 流体せん断応力暴露

1. FSSに細胞を露出させる前に、ラウンドボトム14 mLポリスチレンチューブを7 mLラインで切断した。細胞懸濁液を混合し、5mLの懸濁液をカットチューブに入れ、静電気制御サンプルを採取します。
   注:静的サンプルの収集に必要なボリュームは、使用される生存率アッセイによって異なります(ステップ3を参照)。
2. 5 mL のシリンジに細胞懸濁液を引き込み、30 G 1/2 インチの針を取り付けます。針の蓋を解除し、注射器をシリンジポンプに置き、シリンジを固定し、必要なレベルのFSSを達成するために流量を設定します。
   注: 表 1 は 、さまざまな針と流量の最大壁せん断応力と、セルサイズ(10、15、および 20 μm)に応じた FSS の最小レベルを示しています。使用前に針を点検して、曲がっていないか確認してください。不確かな場合は、針を新しいものに交換してください。針の完全性は適用されるFSSのレベルに大きな影響を与える可能性があります。
3. シリンジポンプを実行し、発泡を減らすために、カットチューブ内のシア付きサンプルをおよそ45°の角度で収集します。実行可能性アッセイの種類や下流アッセイのニーズに応じてサンプルを収集します。
   1. 注射器ポンプから注射器と針を慎重に取り出し、注射器から針を取り除くためにペンチを使用し、針に触れないように注意してください。
      注:ベベレ針以外は、追加の安全対策として、ベベ針と同じ意味で使用できます。
4. シリンジにシレの懸濁液を引き戻し、慎重にペンチを使用して針を取り付け直し、シリンジポンプに戻します。
5. FSSのパルスの所望の数に細胞懸濁液が露出されるまで、ステップ2.3と2.4を繰り返します。
   注:FSS暴露から機械的破壊に抵抗する細胞の容量を評価するために、細胞懸濁液は、通常、FSSの10パルスを受ける。しかし、細胞が2パルス²⁴後にFSSに応答して生物学的適応を開始することが実証されている。

3. 生存率測定

注:生存率は酵素アッセイ(ルシファーゼ、レサズリン、WST-1)、無傷細胞のカウント、フローサイトメトリー、またはクロノジェニックアッセイを使用して評価することができます。

1. すべての生存率の測定方法については、FSS に細胞を公開する前にサンプルを収集します。
   1. 酵素アッセイの場合は、100 μLのアリコートを複製し、96ウェルプレートに入れます。
   2. フローサイトメトリーの場合は、500 μL アリコートを 1 つ取り、1.5 mL チューブに入れます。
   3. クロノジェニックアッセイの場合は、100 μL アリコを収集します。
2. 酵素アッセイ
   1. FSSの露出の1、2、4、6、8、および10パルスの後に100 μLのサンプルを収集し、96ウェルプレートに入れます。
   2. 目的の基板を追加し、使用するアッセイのプロトコルに従ってください。
      1. レサズリンの場合は、0.15 mg/mL溶液を各ウェルに20 μL加えます。100 μLの培地を含むウェルに0.15 mg/mLレサズリン溶液を20 μL添加します。37°Cの組織培養インキュベーターで2時間インキュベートする。蛍光を読み取ることができるプレートリーダー(579励起/584発光)を用いて吸光度を測定します。
      2. ルシファーゼ発現細胞の場合は、15 mg/mL D-ルシフェリンを培地5 mLに100 μL添加します。細胞を含む各ウェルに、その溶液の100 μLを加えます。5分間待ってから、発光と互換性のあるリーダーを使用してプレートを読みます。
      3. WST-1の場合は、ミディアムのみを含むウェルを含め、各ウェルに10 μLのWST-1を追加します。4時間インキュベートし、プレートリーダーを用いて420〜480nmの間の吸光度を読み取る。
   3. 各 FSS 公開サンプルからの平均信号を、平均された静的制御サンプルと比較して、生存可能なセルの割合を取得します。
3. フローサイトメトリー²⁴
   1. 500 μL サンプルを収集し、FSS の 1、2、5、および 10 パルス後の 1.5 mL 遠心分離管に入れます。
   2. 遠心分離機サンプル(500×g3分間)を、上清を捨てる。
   3. ペレットをカルシウムおよびマグネシウムフリーPBSの1 mLで再懸濁し、サンプルを遠心分離します(300×g 3分間)。
   4. 500 μLの蛍光活性化細胞選別(FACS)バッファー(PBSはウシ血清アルブミン、0.1%は、アジ化ナトリウム)を含むピオジジウムヨウ化プロピジウム(1.75 μg/mL)などの膜不透過性または生活性染料でペレットを停止します。
   5. 生細胞の比率を、帯別サンプルと静的サンプルの増殖体でカウントビーズに正規化して比較することにより生存率を決定する。
4. クロノジェニックアッセイ
   1. 100 μLの静的サンプルを取り、900 μL の成長培地を加え、1:10 希釈します。
   2. 1:10希釈サンプルの100 μLを取り、900 μLの成長培地を加え、最終的な1:100希釈を行います。
   3. 1:100希釈サンプルの100 μLを、2 mLの成長培地を含む6ウェル皿の3つの井戸のそれぞれに加えます。
   4. FSS の 10 パルスを受けたサンプルで、手順 3.4.1 ~ 3.4.3 を繰り返します。
   5. 培地を変えずに細胞を7~10日間増殖させ、コロニー形成を確認します。≥50個の細胞のコロニーが形成されたら、成長培地を吸引し、PBSの1mLで各々をよくすすい、PBSを吸引し、1mLの氷冷70%エタノール(EtOH)を用いて5分間固定する。重要なのは、両方のサレと静的サンプルを同時に修正することです。
   6. 試料を固定した後、EtOHを吸引し、1〜2 mLの水晶紫色溶液(0.1%の水晶バイオレットを90%H2Oで、10%EtOH)5分間加えた。
   7. 余分な水ですすぎ、プレートを乾燥させる
   8. 静的およびシアレのサンプルの両方のコロニー(≥50細胞のクラスター)を数えます。サレドサンプルからのコロニーの平均数と静的サンプルからのコロニーの平均数を比較して、生存率を決定します。

結果

FSS誘発性機械的破壊に対する耐性の上昇は、非形質上皮細胞コンパラレータ^15,24に対して腫瘍から新たに単離された複数の癌細胞株および癌細胞にわたって保存された表現型であることが以前に示されている。ここでは、様々な組織起源からの追加の癌細胞株(表2)が、これらの細胞の大部分が250μL/sでFSSの10パルス後に20%≥生存率を示す...

ディスカッション

本論文では、注射器と針を用いた懸濁液中のがん細胞へのFSSの応用について説明する。このモデルを用いて、癌細胞は、非形質上皮細胞^15、22、24に対して高レベルFSSの短いパルスに対してより耐性であることが示されている。さらに、このモデルを用いたFSSへの暴露は、細胞剛性の急激な増加、RhoAの活性化、および皮質F-...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin	Gibco	25200-056
14 mL round bottom tubes	Falcon - Corning	352059
30 G 1/2" Needle	BD	305106
5 mL syringe	BD	309646
96-well black bottom plate	Costar - Corning	3915
Bioluminescence detector	AMI	AMI HTX
BSA, Fraction V	Sigma	10735086001
Cell Titer Blue	Promega	G8081
crystal violet	Sigma	C0775
D-luciferin	GoldBio	D-LUCK
DMEM	Gibco	11965-092
FBS	Atlanta Biologicals	S11150
PBS	Gibco	10010023
Plate Reader	BioTek	Synergy HT
Sodium Azide (NaN3)	Sigma	S2002
Syringe Pump	Harvard Apparatus	70-3005