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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier demonstrieren wir eine Methode, um flüssigen Scherstress auf Krebszellen in Suspension anzuwenden, um die Auswirkungen von hämodynamischem Stress auf zirkulierende Tumorzellen zu modellieren.

Zusammenfassung

Während der Metastasierung erhalten Krebszellen aus festem Gewebe, einschließlich Epithelien, Zugang zum lymphatischen und hämatogenen Kreislauf, wo sie aufgrund des hämodynamischen Flusses mechanischem Stress ausgesetzt sind. Eine dieser Belastungen, die zirkulierende Tumorzellen (CTCs) erfahren, ist der Flüssigkeitsscherstress (FSS). Während Krebszellen aufgrund des interstitiellen Flusses niedrige FSS-Spiegel im Tumor erfahren können, sind CTCs ohne extrazelluläre Matrixbindung viel höheren FSS-Spiegeln ausgesetzt. Physiologisch liegt FSS über 3-4 Größenordnungen, wobei niedrige Konzentrationen in Lymphgefäßen vorhanden sind (<1 Dyne / cm2) und die höchsten Werte kurz vorhanden sind, wenn Zellen durch das Herz und um Herzklappen gehen (>500 Dynen / cm2). Es gibt einige In-vitro-Modelle, die entwickelt wurden, um verschiedene Bereiche physiologischer Scherspannung über verschiedene Zeiträume zu modellieren. Dieser Artikel beschreibt ein Modell zur Untersuchung der Folgen von kurzen (Millisekunden-) Pulsen von High-Level-FSS auf die Krebszellbiologie mit einem einfachen Spritzen- und Nadelsystem.

Einleitung

Metastasierung oder die Ausbreitung von Krebs über die ursprüngliche Tumorstelle hinaus ist ein Hauptfaktor, der der Krebsmortalitätzugrunde 1. Während der Metastasierung nutzen Krebszellen das Kreislaufsystem als Autobahn, um sich an entfernte Stellen im ganzen Körper zu verbreiten2,3. Auf dem Weg zu diesen Stellen existieren zirkulierende Tumorzellen (CTCs) in einer dynamischen flüssigen Mikroumgebung, die sich von der ihres ursprünglichen Primärtumors3,4,5 entiert. Es wurde vorgeschlagen, dass diese flüssige Mikroumgebung eine von vielen Barrieren für Metastasierungen ist4. Es besteht weitgehende Übereinstimmung im Konzept der metastatischen Ineffizienz, d.h. dass die meisten CTCs, die in den Kreislauf gelangen, entweder zugrunde gehen oder keine produktiven metastatischen Kolonien bilden6,7,8. Warum Metastasen aus Sicht eines einzelnen CTC ineffizient sind, ist jedoch weniger sicher und bleibt ein aktives Untersuchungsgebiet. CTCs werden von der extrazellulären Matrix losgelöst, von löslichen Wachstums- und Überlebensfaktoren beraubt, die im Primärtumor vorhanden sein können, und dem Immunsystem und den hämodynamischen Kräften auf eine ganz andere Weise ausgesetzt als im Primärtumor4. Jeder dieser Faktoren kann zum schlechten Überleben von CTCs beitragen, aber ihre relativen Beiträge sind unklar. Dieser Beitrag befasst sich mit der Frage, wie hämodynamische Kräfte CTCs beeinflussen.

Die Untersuchung der Auswirkungen hämodynamischer Kräfte auf CTCs ist eine ziemliche Herausforderung. Derzeit gibt es keine entwickelten In-vitro-Systeme, die die gesamte raumzeitliche Dynamik (Herz zu Kapillaren) und rheologischen Eigenschaften des menschlichen Gefäßsystems replizieren können. Darüber hinaus ist nicht ganz klar, wie CTCs das Kreislaufsystem erleben. Experimentelle Beweise deuten darauf hin, dass die meisten Krebszellen nicht kontinuierlich wie Blutzellen zirkulieren. Vielmehr werden die meisten CTCs aufgrund ihrer relativ großen Größe (10-20 μm Durchmesser) für variable Zeiträume (s bis Tage) in Kapillarbetten (6-8 μm Durchmesser) gefangen, wo sie sterben, extravasieren oder in das nächste Kapillarbett 8,9,10,11verschoben werden können . Es gibt jedoch Hinweise darauf, dass die CTC-Größe in vivo heterogener sein kann und dass kleinere CTCs nachweisbar sind12. Daher können CTCs basierend auf Entfernung und Blutflussgeschwindigkeit nur für eine Frage von Sekunden zwischen diesen Einklemmungsperioden frei zirkulieren, obwohl eine quantitative Beschreibung dieses Verhaltens fehlt13.

Darüber hinaus können CTCs je nachdem, wo SIE in den Kreislauf gelangen, mehrere Kapillarbetten in der Lunge und anderen peripheren Stellen sowie durch das rechte und linke Herz passieren, bevor sie ihr endgültiges Ziel erreichen. Auf dem Weg sind CTCs verschiedenen hämodynamischen Belastungen ausgesetzt, einschließlich Flüssigkeitsscherspannung (FSS), Druckkräften während ihres Einklemmens in der Mikrozirkulation und möglicherweise Zugkräften unter Umständen, unter denen sie leukozytenartiges Rollen entlang der Blutgefäßwände aufweisen könnten14. Somit ist sowohl die Fähigkeit, die Zirkulation zu modellieren, als auch das Verständnis des zu modellierenden CTC-Verhaltens begrenzt. Aufgrund dieser Unsicherheit sollten alle Erkenntnisse aus In-vitro-Modellsystemen in einem experimentellen Wirbeltierorganismus und letztendlich bei Krebspatienten validiert werden.

Mit den oben genannten Vorbehalten zeigt dieses Papier ein relativ einfaches Modell, um FSS auf Zellen in Suspension anzuwenden, um die Auswirkungen von FSS auf CTCs zu untersuchen, die erstmals 2012 beschriebenwurden 15. FSS resultiert aus der Reibung des Blutflusses gegen die Gefäßwand, die unter Bedingungen der laminaren Strömung in größeren Gefäßen einen parabolischen Geschwindigkeitsgradienten erzeugt. Zellen erfahren höhere FSS-Spiegel in der Nähe von Gefäßwänden und niedrigere Werte in der Nähe der Mitte des Blutgefäßes. Flüssigkeitsviskosität, Durchflussrate und Abmessungen der Leitung, durch die die Strömung erfolgt, beeinflussen FSS, wie in der Hagen-Poiseuille-Gleichung beschrieben. Dies gilt für Blutströme, die sich wie Newtonsche Flüssigkeiten verhalten, gilt jedoch nicht für die Mikrozirkulation. Physiologische FSS erstreckt sich über mehrere Größenordnungen mit den niedrigsten Werten in der Lymphe (<1 dyn/cm2) und den höchsten in Regionen um Herzklappen und atherosklerotische Plaques (>500 dyn/cm2)5. Die mittlere Wandscherspannung in den Arterien beträgt 10-70 dyn/cm2 und 1-6 dyn/cm2 in den Venen16,17.

Im Herzen können Zellen turbulenten Strömungen um Klappenblättchen ausgesetzt sein, wo sehr hohe, aber sehr kurze Dauer FSS auftreten kann18,19. Obwohl das Bioprozessfeld seit langem die Auswirkungen von FSS auf Säugetierzellen in Suspension untersucht, können diese Informationen für das Verständnis der Auswirkungen von FSS auf CTCs von begrenztem Wert sein, da sie sich im Allgemeinen auf viel niedrigere FSS-Spiegel konzentrieren, die über eine lange Dauer angewendet werden20. Wie unten beschrieben, kann man mit einer Spritze und einer Nadel relativ hohe (zehn bis tausend dyn/cm2)FSS für eine relativ kurze (Millisekunden) Dauer auf eine Zellsuspension auftragen. Seit der ersten Beschreibung dieses Modells15haben andere es verwendet, um die Auswirkungen von FSS auf Krebszellen21,22,23zu untersuchen. Mehrere "Impulse" von FSS können in kurzer Zeit auf Zellsuspensionen angewendet werden, um nachgelagerte experimentelle Analysen zu erleichtern. Zum Beispiel kann dieses Modell verwendet werden, um die Fähigkeit von Zellen zu messen, mechanischer Zerstörung durch FSS zu widerstehen, indem die Zelllebensfähigkeit in Abhängigkeit von der Anzahl der angewendeten Impulse gemessen wird. Alternativ können die Auswirkungen der FSS-Exposition auf die Biologie von Krebszellen untersucht werden, indem Zellen für eine Vielzahl von nachgelagerten Analysen gesammelt werden. Wichtig ist, dass ein Teil der Zellsuspension als statische Kontrolle reserviert ist, um die Auswirkungen von FSS mit denen zu vergleichen, die mit Zellablösung und Zeit in Suspension verbunden sein könnten.

Protokoll

1. Zellvorbereitung

  1. Setzen Sie Zellen aus der Gewebekulturschale frei, wenn 70-90% konfluent sind, indem Sie die empfohlenen Richtlinien für die verwendete Zelllinie befolgen.
    1. Zum Beispiel das Wachstumsmedium für PC-3-Zellen absaugen und die 10 cm große Zellschale mit 5 ml kalzium- und magnesiumfreier phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) waschen.
    2. Saugen Sie das PBS ab, bevor Sie 1 ml 0,25% Trypsin unter Verwendung des Herstellerprotokolls hinzufügen.
    3. Nachdem Sie die Ablösung der Zellen unter einem invertierten Mikroskop beobachtet haben, fügen Sie 5 ml DMEM: F12-Medium hinzu, das 10% fetales Rinderserum enthält, um das Trypsin zu hemmen.
  2. Legen Sie die Zellsuspension in ein konisches Rohr.
  3. Bestimmen Sie die Zellkonzentration und die Gesamtzellzahl.
  4. Pelletzellen durch Zentrifugation (300 × g für 3 min), saugen den Überstand an und resuspendieren Zellen in serumfreiem Gewebekulturmedium auf 5 × 105 Zellen/ml.
    HINWEIS: Es ist wichtig, dass das Assay-Medium mindestens 1,17 mM Ca++ enthält, da extrazelluläres Ca++ für die zelluläre Resistenz gegen FSS15nachgewiesen wurde.

2. Belastungsbelastung durch Flüssigkeitsscherung

  1. Bevor Sie die Zellen FSS aussetzen, schneiden Sie ein rundes 14-ml-Polystyrolrohr an der 7-ml-Linie. Mischen Sie die Zellsuspension, legen Sie 5 ml der Suspension in das geschnittene Rohr und sammeln Sie statische Kontrollproben.
    HINWEIS: Das für die statische Probe erforderliche Volumen hängt vom verwendeten Lebensfähigkeitstest ab (siehe Schritt 3).
  2. Ziehen Sie die Zellsuspension in eine 5-ml-Spritze und befestigen Sie eine 30 G 1/2"-Nadel. Entkappen Sie die Nadel, legen Sie die Spritze auf eine Spritzenpumpe, befestigen Sie die Spritze und stellen Sie die Durchflussrate ein, um das gewünschte FSS-Niveau zu erreichen.
    HINWEIS: Tabelle 1 zeigt die maximale Wandscherspannung für verschiedene Nadeln und Durchflussraten sowie den minimalen FSS-Gehalt in Abhängigkeit von der Zellgröße (10, 15 und 20 μm). Untersuchen Sie die Nadel vor dem Gebrauch, um sicherzustellen, dass sie nicht verbogen ist. Wenn Sie unsicher sind, ersetzen Sie die Nadel durch eine neue. Die Integrität der Nadel kann erhebliche Auswirkungen auf das Niveau des angewendeten FSS haben.
  3. Führen Sie die Spritzenpumpe aus und sammeln Sie die scherte Probe im geschnittenen Röhrchen in einem Winkel von etwa 45 °, um das Schäumen zu reduzieren. Sammeln Sie eine Probe, abhängig von der Art des Lebensfähigkeitstests oder den nachgelagerten Assay-Anforderungen.
    1. Entfernen Sie vorsichtig die Spritze und die Nadel aus der Spritzenpumpe und entfernen Sie die Nadel mit einer Zange aus der Spritze, wobei Sie darauf achten, die Nadel nicht zu berühren.
      HINWEIS: Nicht abgeschränkte Nadeln können als zusätzliche Sicherheitsmaßnahme austauschbar mit abgeschränkten Nadeln verwendet werden.
  4. Ziehen Sie die scherte Suspension zurück in die Spritze, befestigen Sie die Nadel vorsichtig mit einer Zange und legen Sie sie wieder in die Spritzenpumpe.
  5. Wiederholen Sie die Schritte 2.3 und 2.4, bis die Zellsuspension der gewünschten Anzahl von FSS-Impulsen ausgesetzt wurde.
    HINWEIS: Um die Fähigkeit der Zellen zu beurteilen, der mechanischen Zerstörung durch FSS-Exposition zu widerstehen, wird die Zellsuspension typischerweise 10 FSS-Impulsen ausgesetzt. Es wurde jedoch gezeigt, dass Zellen nach 2 Impulsen24als Reaktion auf FSS biologische Anpassungen durchlaufen.

3. Messung der Lebensfähigkeit

HINWEIS: Die Lebensfähigkeit kann mit enzymatischen Assays (Luciferase, Resazurin und WST-1), der Zählung intakter Zellen, der Durchflusszytometrie oder durch klonogene Assays beurteilt werden.

  1. Für alle Messungen der Lebensfähigkeit, sammeln Sie eine Probe, bevor Sie Zellen FSS aussetzen.
    1. Für enzymatische Assays nehmen Sie doppelte 100 μL Aliquoten und legen Sie sie in eine 96-Well-Platte.
    2. Für die Durchflusszytometrie nehmen Sie ein 500 μL Aliquot und legen Es in ein 1,5 ml Röhrchen.
    3. Für den clonogenen Assay sammeln Sie ein Aliquot von 100 μL.
  2. Enzymatischer Assay
    1. Sammeln Sie 100 μL-Proben nach 1, 2, 4, 6, 8 und 10 Impulsen FSS-Exposition und legen Sie sie in eine 96-Well-Platte.
    2. Fügen Sie das gewünschte Substrat hinzu und befolgen Sie das Protokoll für den verwendeten Assay:
      1. Für Resazurin werden 20 μL einer 0,15 mg/ml Lösung zu jeder Vertiefung hinzugefügt. 20 μL 0,15 mg/ml Resazurinlösung werden in Vertiefungen mit 100 μL Medium allein hinzugefügt. 2 h in einem 37 °C Gewebekultur-Inkubator inkubieren. Messen Sie die Absorption mit einem Plattenleser, der Fluoreszenz ablesen kann (579 Anregung / 584 Emission).
      2. Für Luciferase-exprimierende Zellen 100 μL 15 mg/ml D-Luciferin zu 5 ml Medium hinzufügen. Fügen Sie 100 μL dieser Lösung zu jeder Vertiefung hinzu, die Zellen enthält. Warten Sie 5 Minuten und lesen Sie dann die Platte mit einem Lesegerät, das mit Lumineszenz kompatibel ist.
      3. Für WST-1 fügen Sie 10 μL WST-1 zu jeder Vertiefung hinzu, einschließlich Vertiefungen, die nur Medium enthalten. 4 h inkubieren und dann die Absorption zwischen 420 und 480 nm mit einem Plattenleser ablesen.
    3. Vergleichen Sie das gemittelte Signal von jeder der FSS-exponierten Proben mit der gemittelten statischen Kontrollprobe, um den Prozentsatz der lebensfähigen Zellen zu erhalten.
  3. Durchflusszytometrie24
    1. Sammeln Sie 500 μL-Proben und legen Sie sie nach 1, 2, 5 und 10 FSS-Impulsen in 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen.
    2. Zentrifugenproben (500 × g für 3 min) und entsorgen Sie die Überstände.
    3. Die Pellets mit 1 ml calcium- und magnesiumfreiem PBS resuspendieren und die Proben zentrifugieren (300 × g für 3 min).
    4. Suspendieren Sie die Pellets mit 500 μL fluoreszenzaktiviertem Zellsortierpuffer (FACS) (PBS mit 0,5% Rinderserumalbumin und 0,1% Natriumazid) mit Zählperlen und membrandurchlässigen oder Lebensfähigkeitsfarbstoffen wie Propidiiumiodid (1,75 μg/ml).
    5. Bestimmen Sie die Lebensfähigkeit, indem Sie das Verhältnis von lebensfähigen Zellen, normalisiert auf Zählperlen, in gescherten Proben mit dem der statischen Probe vergleichen.
  4. Clonogener Assay
    1. Nehmen Sie 100 μL der statischen Probe und fügen Sie 900 μL Wachstumsmedium hinzu, um eine 1:10-Verdünnung herzustellen.
    2. Nehmen Sie 100 μL der 1:10 verdünnten Probe und fügen Sie 900 μL Wachstumsmedium hinzu, um eine endgültige 1:100-Verdünnung zu erzielen.
    3. 100 μL der 1:100-Verdünnungsprobe werden in jede der 3 Vertiefungen einer 6-Well-Schale mit 2 ml Wachstumsmedium geben.
    4. Wiederholen Sie die Schritte 3.4.1-3.4.3 mit Proben, die 10 FSS-Impulsen ausgesetzt wurden.
    5. Lassen Sie die Zellen 7-10 Tage lang wachsen, ohne das Medium zu wechseln, und überprüfen Sie die Koloniebildung. Sobald sich Kolonien von ≥50 Zellen gebildet haben, saugen Sie das Wachstumsmedium an, spülen Sie jedes Gut mit 1 ml PBS, saugen Sie das PBS an und fixieren Sie es für 5 minuten mit 1 ml eiskaltem 70% Ethanol (EtOH). Wichtig ist, dass Sie sowohl gescherte als auch statische Proben gleichzeitig reparieren
    6. Nach dem Fixieren der Proben das EtOH absaugen und 1 bis 2 mL kristallviolette Lösung (0,1% kristallviolett in 90%H2O, 10% EtOH) für 5 min hinzufügen.
    7. Mit einem Überschuss an Wasser abspülen und den Teller trocknen lassen
    8. Zählen Sie die Kolonien (Cluster von ≥50 Zellen) sowohl für die statischen als auch für die gescherten Proben. Vergleichen Sie das Verhältnis der durchschnittlichen Anzahl der Kolonien aus der gescherten Probe mit der durchschnittlichen Anzahl der Kolonien aus der statischen Probe, um die Lebensfähigkeit zu bestimmen.

Ergebnisse

Eine erhöhte Resistenz gegen FSS-induzierte mechanische Zerstörung hat sich zuvor als konservierter Phänotyp über mehrere Krebszelllinien und Krebszellen, die frisch aus Tumoren isoliert wurden, im Vergleich zu nicht transformierten Epithelzellkomparatorenerwiesen 15,24. Hier wurden zusätzliche Krebszelllinien aus einer Vielzahl von Gewebeursprüngen (Tabelle 2) getestet, um zu zeigen, dass die Mehrheit dieser Zellen nach 10 FSS-Pulsen bei 2...

Diskussion

Dieses Papier demonstriert die Anwendung von FSS auf Krebszellen in Suspension mit einer Spritze und einer Nadel. Mit diesem Modell wurde gezeigt, dass Krebszellen resistenter gegen kurze Pulse von High-Level-FSS im Vergleich zu nicht transformierten Epithelzellensind 15,22,24. Darüber hinaus führt die Exposition gegenüber FSS unter Verwendung dieses Modells zu einem schnellen Anstieg der Zellsteifigkeit, Aktivierung von RhoA...

Offenlegungen

MDH ist Mitbegründer, Präsident und Aktionär von SynderBio, Inc. DLM ist Berater für SynderBio, Inc.

Danksagungen

Die Entwicklung des hier gezeigten Modells wurde durch den DOD-Zuschuss W81XWH-12-1-0163, den NIH-Zuschüssen R21 CA179981 und R21 CA196202 sowie den Sato Metastasis Research Fund unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% TrypsinGibco25200-056
14 mL round bottom tubesFalcon - Corning352059
30 G 1/2" NeedleBD305106
5 mL syringeBD309646
96-well black bottom plateCostar - Corning3915
Bioluminescence detectorAMIAMI HTX
BSA, Fraction VSigma10735086001
Cell Titer BluePromegaG8081
crystal violetSigmaC0775
D-luciferinGoldBioD-LUCK
DMEMGibco11965-092
FBSAtlanta BiologicalsS11150
PBSGibco10010023
Plate ReaderBioTekSynergy HT
Sodium Azide (NaN3)SigmaS2002
Syringe PumpHarvard Apparatus70-3005

Referenzen

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