Modellazione degli effetti dello stress emodinamico sulle cellule tumorali circolanti utilizzando una siringa e un ago

Riepilogo

Qui dimostriamo un metodo per applicare lo stress da taglio fluido alle cellule tumorali in sospensione per modellare gli effetti dello stress emodinamico sulle cellule tumorali circolanti.

Abstract

Durante le metastasi, le cellule tumorali dei tessuti solidi, compresi gli epiteli, ottengono l'accesso alla circolazione linfatica ed ematogena dove sono esposte a stress meccanici dovuti al flusso emodinamico. Uno di questi sottolinea che le cellule tumorali circolanti (CTC) sperimentano è lo stress da taglio fluido (FSS). Mentre le cellule tumorali possono sperimentare bassi livelli di FSS all'interno del tumore a causa del flusso interstiziale, le CTC sono esposte, senza attaccamento della matrice extracellulare, a livelli molto maggiori di FSS. Fisiologicamente, la FSS varia su 3-4 ordini di grandezza, con bassi livelli presenti nei linfatici (<1 dyne/cm²) e i livelli più alti presenti brevemente mentre le cellule passano attraverso il cuore e intorno alle valvole cardiache (>500 dynes/cm^2). Esistono alcuni modelli in vitro progettati per modellare diverse gamme di stress da taglio fisiologico in vari intervalli di tempo. Questo documento descrive un modello per studiare le conseguenze di brevi impulsi (millisecondi) di FSS di alto livello sulla biologia delle cellule tumorali utilizzando un semplice sistema di siringhe e aghi.

Introduzione

Le metastasi, o la diffusione del cancro oltre il sito tumorale iniziale, sono un fattore importante alla base della mortalità per cancro¹. Durante le metastasi, le cellule tumorali utilizzano il sistema circolatorio come un'autostrada per diffondersi in siti distanti in tutto il corpo^2,3. Mentre sono in viaggio verso questi siti, le cellule tumorali circolanti (CTC) esistono all'interno di un microambiente fluido dinamico diverso da quello del loro tumore primario originale^3,4,5. È stato proposto che questo microambiente fluido sia una delle tante barriere alle metastasi⁴. C'è ampio accordo nel concetto di inefficienza metastatica, cioè che la maggior parte delle CTC che entrano in circolazione periscono o non formano colonie metastatiche produttive^6,7,8. Tuttavia, il motivo per cui le metastasi sono inefficienti dal punto di vista di un singolo CTC è meno certo e rimane un'area attiva di indagine. Le CTC sono staccate dalla matrice extracellulare, private dei fattori di crescita e sopravvivenza solubili che possono essere presenti nel tumore primario ed esposte al sistema immunitario e alle forze emodinamiche in modo molto diverso rispetto al tumore primario⁴. Ognuno di questi fattori può contribuire alla scarsa sopravvivenza dei CTC, ma i loro contributi relativi non sono chiari. Questo documento affronta la questione di come le forze emodinamiche influenzano le CTC.

Studiare gli effetti delle forze emodinamiche sulle CTC è piuttosto impegnativo. Attualmente, non esistono sistemi ingegnerizzati in vitro in grado di replicare l'intera dinamica spaziotemporale (dal cuore ai capillari) e le proprietà reologiche del sistema vascolare umano. Inoltre, il modo in cui le CTC sperimentano il sistema circolatorio non è del tutto chiaro. Prove sperimentali indicano che la maggior parte delle cellule tumorali non circolano continuamente come le cellule del sangue. Piuttosto, a causa delle loro dimensioni relativamente grandi (10-20 μm di diametro), la maggior parte dei CTC si intrappolano in letti capillari (6-8 μm di diametro) per periodi di tempo variabili (da s a giorni) dove possono morire, stravasare o essere spostati nel letto capillare successivo^8,9,10,11. Tuttavia, ci sono alcune prove che le dimensioni del CTC possono essere più eterogenee in vivo e che le CTC più piccole sono rilevabili¹². Pertanto, in base alla distanza e alla velocità del flusso sanguigno, le CTC possono circolare liberamente solo per una questione di secondi tra questi periodi di intrappolamento, sebbene manchi una descrizione quantitativa di questo comportamento¹³.

Inoltre, a seconda di dove le CTC entrano in circolazione, possono passare attraverso più letti capillari nel polmone e in altri siti periferici e attraverso il cuore destro e sinistro prima di raggiungere la loro destinazione finale. Lungo la strada, le CTC sono esposte a vari stress emodinamici tra cui lo stress da taglio del fluido (FSS), le forze di compressione durante il loro intrappolamento nel microcircolo e, potenzialmente, le forze di trazione in circostanze in cui potrebbero esibire un rotolamento simile a quello dei leucociti lungo le pareti dei vasi sanguigni¹⁴. Pertanto, sia la capacità di modellare la circolazione che la comprensione del comportamento CTC da modellare sono limitate. A causa di questa incertezza, qualsiasi risultato proveniente da sistemi modello in vitro dovrebbe essere convalidato in un organismo vertebrato sperimentale e, in definitiva, nei pazienti oncologici.

Con le avvertenze di cui sopra, questo documento dimostra un modello relativamente semplice per applicare FSS alle cellule in sospensione per sondare gli effetti di FSS sulle CTC descritte per la prima volta nel 2012¹⁵. FSS deriva dall'attrito del flusso sanguigno contro la parete del vaso, che produce un gradiente di velocità parabolica in condizioni di flusso laminare in vasi più grandi. Le cellule sperimentano livelli più elevati di FSS vicino alle pareti dei vasi e livelli più bassi vicino al centro del vaso sanguigno. La viscosità del fluido, la portata e le dimensioni del condotto attraverso il quale avviene il flusso influenzano FSS, come descritto dall'equazione di Hagen-Poiseuille. Questo vale per i flussi sanguigni che si comportano come fluidi newtoniani, ma non vale per la microcircolazione. La FSS fisiologica varia su diversi ordini di grandezza con i livelli più bassi nei linfatici (<1 dyn / cm²) e i più alti nelle regioni intorno alle valvole cardiache e alle placche aterosclerotiche (>500 dyn / cm²)⁵. Lo sforzo medio di taglio della parete nelle arterie è di 10-70 dyn/cm² e 1-6 dyn/cm² nelle vene^16,17.

Nel cuore, le cellule possono essere esposte a flussi turbolenti intorno ai lembi valvolari dove si può sperimentare FSS di livello molto alto, ma di brevissima durata^18,19. Sebbene il campo del bioprocessing abbia a lungo studiato gli effetti di FSS sulle cellule di mammifero in sospensione, queste informazioni possono avere un valore limitato per comprendere gli effetti di FSS sulle CTC in quanto generalmente si concentrano su livelli molto più bassi di FSS applicati per una lunga durata²⁰. Come descritto di seguito, utilizzando una siringa e un ago, si può applicare FSS relativamente alto (da decine a migliaia di dyn / cm²) per una durata relativamente breve (millisecondi) a una sospensione cellulare. Dalla descrizione iniziale di questo modello^15,altri lo hanno impiegato per studiare gli effetti della FSS sulle cellule^{tumorali21,22,23.} "Impulsi" multipli di FSS possono essere applicati alle sospensioni cellulari in un breve periodo di tempo per facilitare le analisi sperimentali a valle. Ad esempio, questo modello può essere utilizzato per misurare la capacità delle cellule di resistere alla distruzione meccanica da parte di FSS misurando la vitalità delle celle in funzione del numero di impulsi applicati. In alternativa, gli effetti dell'esposizione a FSS sulla biologia delle cellule tumorali possono essere esplorati raccogliendo cellule per una varietà di analisi a valle. È importante sottolineare che parte della sospensione cellulare è riservata come controllo statico per confrontare gli effetti di FSS da quelli che potrebbero essere associati al distacco cellulare e al tempo tenuto in sospensione.

Protocollo

1. Preparazione cellulare

1. Rilasciare le cellule dal piatto di coltura tissutale quando il 70-90% confluente seguendo le linee guida raccomandate per la linea cellulare in uso.
   1. Ad esempio, aspirare il mezzo di crescita per le cellule PC-3 e lavare il piatto di 10 cm di cellule con 5 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) priva di calcio e magnesio.
   2. Aspirare il PBS prima di aggiungere 1 ml di tripsina allo 0,25% utilizzando il protocollo del produttore.
   3. Dopo aver osservato il distacco delle cellule al microscopio invertito, aggiungere 5 ml di DMEM:F12 medio contenente il 10% di siero bovino fetale per inibire la tripsina.
2. Posizionare la sospensione cellulare in un tubo conico.
3. Determinare la concentrazione cellulare e il numero totale di cellule.
4. Le cellule a pellet per centrifugazione (300 × g per 3 min), aspirano il surnatante e sospendono le cellule in terreno di coltura tissutale privo di siero a 5 × 10⁵ cellule/mL.
   NOTA: È fondamentale che il mezzo di analisi contenga almeno 1,17 mM Ca⁺⁺ poiché è stato dimostrato che ca⁺⁺ extracellulare è necessario per la resistenza cellulare a FSS¹⁵.

2. Esposizione allo stress da taglio del fluido

1. Prima di esporre le celle a FSS, tagliare un tubo di polistirene da 14 mL a fondo tondo sulla linea da 7 mL. Mescolare la sospensione cellulare, posizionare 5 ml della sospensione nel tubo tagliato e raccogliere campioni di controllo statico.
   NOTA: il volume necessario da raccogliere per il campione statico dipende dal saggio di vitalità utilizzato (vedere il passaggio 3).
2. Aspirare la sospensione cellulare in una siringa da 5 ml e attaccare un ago da 30 G da 1/2". Aprire l'ago, posizionare la siringa su una pompa a siringa, fissare la siringa e impostare la portata per raggiungere il livello desiderato di FSS.
   NOTA: la Tabella 1 mostra lo sforzo massimo di taglio della parete per diversi aghi e portate, nonché il livello minimo di FSS a seconda delle dimensioni della cella (10, 15 e 20 μm). Ispezionare l'ago prima dell'uso per assicurarsi che non sia piegato; se incerto, sostituisca l'ago con uno nuovo. L'integrità dell'ago può avere un impatto significativo sul livello di FSS applicato.
3. Aeggiare la pompa della siringa e raccogliere il campione tranciato nel tubo tagliato con un angolo approssimativo di 45° per ridurre la formazione di schiuma. Raccogliere un campione a seconda del tipo di test di fattibilità o delle esigenze del test a valle.
   1. Rimuovere con cautela la siringa e l'ago dalla pompa della siringa e utilizzare le pinze per rimuovere l'ago dalla siringa, facendo attenzione a non toccare l'ago.
      NOTA: gli aghi non smussati possono essere utilizzati in modo intercambiabile con aghi smussati come ulteriore misura di sicurezza.
4. Riportare la sospensione tranciata nella siringa, ricollegare con cura l'ago con una pinza e ricommetterlo nella pompa della siringa.
5. Ripetere i passaggi 2.3 e 2.4 fino a quando la sospensione cellulare non è stata esposta al numero desiderato di impulsi di FSS.
   NOTA: Per valutare la capacità delle cellule di resistere alla distruzione meccanica dall'esposizione fSS, la sospensione cellulare è tipicamente soggetta a 10 impulsi di FSS. Tuttavia, è stato dimostrato che le cellule iniziano a subire adattamenti biologici in risposta a FSS dopo 2 impulsi²⁴.

3. Misurazione della redditività

NOTA: La vitalità può essere valutata utilizzando saggi enzimatici (luciferasi, resazurina e WST-1), contando cellule intatte, citometria a flusso o saggi clonogenici.

1. Per tutte le misure di vitalità, raccogliere un campione prima di esporre le cellule a FSS.
   1. Per i saggi enzimatici, prendere aliquote duplicate da 100 μL e metterle in una piastra a 96 pozzetti.
   2. Per la citometria a flusso, prendere un'aliquota da 500 μL e metterla in un tubo da 1,5 ml.
   3. Per il saggio clonogenico, raccogliere un'aliquota di 100 μL.
2. Saggio enzimatico
   1. Raccogliere campioni da 100 μL dopo 1, 2, 4, 6, 8 e 10 impulsi di esposizione FSS e metterli in una piastra a 96 pozzetti.
   2. Aggiungere il substrato desiderato e seguire il protocollo per il test utilizzato:
      1. Per la resazurina, aggiungere 20 μL di una soluzione da 0,15 mg/mL a ciascun pozzet. Aggiungere 20 μL di 0,15 mg/mL di soluzione di resazurina ai pozzi contenenti 100 μL di mezzo da solo. Incubare per 2 ore in un incubatore di colture tissutali a 37 °C. Misurare l'assorbanza utilizzando un lettore di piastre in grado di leggere la fluorescenza (579 eccitazione/ 584 di emissione).
      2. Per le cellule che esprimono luciferasi, aggiungere 100 μL di 15 mg/mL di D-luciferina a 5 mL di mezzo. Aggiungere 100 μL di quella soluzione a ciascun pozzo contenente cellule. Attendere 5 minuti, quindi leggere la piastra utilizzando un lettore compatibile con la luminescenza.
      3. Per WST-1, aggiungere 10 μL di WST-1 a ciascun pozzo, compresi i pozzi contenenti solo il mezzo. Incubare per 4 ore, quindi leggere l'assorbanza tra 420 e 480 nm utilizzando un lettore di piastre.
   3. Confrontare il segnale mediato da ciascuno dei campioni esposti a FSS con il campione di controllo statico medio per ottenere la percentuale di cellule vitali.
3. Citometria a^{flusso 24}
   1. Raccogliere campioni da 500 μL e metterli in tubi centrifughi da 1,5 mL dopo 1, 2, 5 e 10 impulsi di FSS.
   2. Centrifugare i campioni (500 × g per 3 min) ed eliminare i supernatanti.
   3. Spese di sospensione dei pellet con 1 mL di PBS privo di calcio e magnesio e centrifugare i campioni (300 × g per 3 min).
   4. Sospendere il pellet con 500 μL di tampone facS (fluorescence-activated cell sorting) (PBS con albumina sierica bovina allo 0,5% e azide di sodio allo 0,1%) con perle di conteggio e coloranti impermeabili o vitali a membrana come lo ioduro di propidio (1,75 μg/mL).
   5. Determinare la vitalità confrontando il rapporto tra cellule vitali, normalizzato al conteggio delle perle, nei campioni tranciati e quello del campione statico.
4. Saggio clonogenico
   1. Prendere 100 μL del campione statico e aggiungere 900 μL di terreno di coltura per effettuare una diluizione 1:10.
   2. Prendere 100 μL del campione diluito 1:10 e aggiungere 900 μL di terreno di coltura per effettuare una diluizione finale 1:100.
   3. Aggiungere 100 μL del campione di diluizione 1:100 in ciascuno dei 3 pozzeli di un piatto a 6 pozzene contenente 2 ml di terreno di coltura.
   4. Ripetere i passaggi 3.4.1-3.4.3 con campioni che sono stati sottoposti a 10 impulsi di FSS.
   5. Lascia che le cellule crescano per 7-10 giorni senza cambiare il mezzo e controlla la formazione della colonia. Una volta formate colonie di ≥50 cellule, aspirare il mezzo di crescita, risciacquare ogni pozzetti con 1 mL di PBS, aspirare il PBS e fissare per 5 minuti usando 1 mL di etanolo al 70% ghiacciato (EtOH). È importante sottolineare che fissare contemporaneamente sia i campioni tranciati che quelli statici
   6. Dopo aver fissato i campioni, aspirare l'EtOH e aggiungere da 1 a 2 ml di soluzione di cristallo viola (0,1% di viola cristallino in 90% H₂O, 10% EtOH) per 5 minuti.
   7. Risciacquare con un eccesso di acqua e lasciare asciugare la piastra
   8. Contare le colonie (gruppi di ≥50 cellule) sia per i campioni statici che per quelli tranciati. Confrontare il rapporto tra il numero medio di colonie dal campione tranciato e il numero medio di colonie dal campione statico per determinare la vitalità.

Risultati

L'elevata resistenza alla distruzione meccanica indotta da FSS ha precedentemente dimostrato di essere un fenotipo conservato su più linee cellulari tumorali e cellule tumorali appena isolate dai tumori rispetto ai comparatori di cellule epiteliali non trasformate^15,24. Qui, sono state testate ulteriori linee cellulari tumorali da una varietà di origini tissutali (Tabella 2) per dimostrare che la maggior parte di queste cellule mostra vitalità...

Discussione

Questo documento dimostra l'applicazione di FSS alle cellule tumorali in sospensione utilizzando una siringa e un ago. Utilizzando questo modello, le cellule tumorali hanno dimostrato di essere più resistenti a brevi impulsi di FSS di alto livello rispetto alle cellule epiteliali non trasformate^15,22,24. Inoltre, l'esposizione a FSS utilizzando questo modello si traduce in un rapido aumento della rigidità cellulare, attivazion...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin	Gibco	25200-056
14 mL round bottom tubes	Falcon - Corning	352059
30 G 1/2" Needle	BD	305106
5 mL syringe	BD	309646
96-well black bottom plate	Costar - Corning	3915
Bioluminescence detector	AMI	AMI HTX
BSA, Fraction V	Sigma	10735086001
Cell Titer Blue	Promega	G8081
crystal violet	Sigma	C0775
D-luciferin	GoldBio	D-LUCK
DMEM	Gibco	11965-092
FBS	Atlanta Biologicals	S11150
PBS	Gibco	10010023
Plate Reader	BioTek	Synergy HT
Sodium Azide (NaN3)	Sigma	S2002
Syringe Pump	Harvard Apparatus	70-3005