אימונופנוטיפינג ומיון תאים של חברי כנסת אנושיים ממקורות ראשוניים אנושיים או מובחנים במבחנה מאבות ההמטופיאטיים

Summary

כאן, אנו מציגים אסטרטגיית אימונופנוטיפינג לאפיון של בידול מגה-קריוציטים, ומראים כיצד אסטרטגיה זו מאפשרת מיון של מגה-קריוציטים בשלבים שונים באמצעות סדרן תאים המופעל על-ידי פלואורסצנטיות. המתודולוגיה יכולה להיות מיושמת על רקמות ראשוניות אנושיות, אלא גם על מגה-קריוציטים הנוצרים בתרבות במבחנה.

Abstract

התמיינות Megakaryocyte (MK) כוללת מספר מחזורים אנדומיטוטיים שתוצאתם פוליפלואידית מאוד (להגיע אפילו >64N) ותא גדול מאוד (40-60 מיקרומטר). בניגוד לידע הגדל במהירות במגה-קריופוסיס ברמה הביולוגית של התא וברמה המולקולרית, אפיון המגה-קריופוסיס על ידי ציטומטריית זרימה מוגבל לזיהוי חברי כנסת בוגרים באמצעות סמני פני שטח ספציפיים לשושלת, בעוד שלבי הבידול הח"כים המוקדמים עדיין לא נחקרו. כאן אנו מציגים אסטרטגיית אימונופנוטיפינג המאפשרת זיהוי שלבי בידול ח"כים עוקבים, עם מעמד של פלוידיה גוברת, במקורות ראשוניים אנושיים או בתרבויות במבחנה עם פאנל המשלב סמני שטח ספציפיים ולא ספציפיים של ח"כים. למרות גודלו ושבריריותו, חברי הכנסת יכולים להיות אימונופנוטיים באמצעות הפאנל הנ"ל ומועשרים על ידי מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות בתנאים מסוימים של לחץ וקוטר זרבובית. גישה זו מקלה על מחקרים רב-אומיקים, במטרה להבין טוב יותר את המורכבות של מגה-קריופוזיס וייצור טסיות טיס פנים בבני אדם. אפיון טוב יותר של megakaryopoiesis עשוי להוות יסוד באבחון או פרוגנוזה של פתולוגיות הקשורות לשושלת וממאירות.

Introduction

Megakaryocytes (חברי כנסת) לפתח מתאי גזע hematopoietic (HSCs) בעקבות תהליך מורכב בשם megakaryopoiesis, אשר מתוזמר בעיקר על ידי ההורמון תרומבופויאטין (TPO). התפיסה הקלאסית של megakaryopoiesis מתארת את המסע התאי מ- HSCs דרך רצף של שלבים היררכיים של אבות מחויבים ותאי קודמן, המוביל בסופו של דבר לח"כ בוגר. במהלך ההבשלה, חברי הכנסת חווים סבבים מרובים של אנדומיטוזיס, מפתחים מערכת קרום תיחום תאית מורכבת (DMS), המספקת מספיק משטח ממברנה לייצור טסיות דם, ומייצרים ביעילות ואורזים את שפע הגורמים הכלולים בגרגרים השונים שירשו טסיות הדם הבוגרות^1,2,3. כתוצאה מכך, חברי כנסת בוגרים הם תאים גדולים (40-60 מיקרומטר) המאופיינים בגרעין פוליפלואידי מאוד (המגיע אפילו >64N). מחקרים שנעשו לאחרונה מצביעים על דרכים חלופיות שבהן HSCs מבדילים בין חברי כנסת העוקפים את מחסומי המחויבות המסורתיים לשושלת בתגובה לתנאים פיזיו-פתולוגיים מסוימים^{4,5,6,7,8,9,10,11}. ממצאים אלה מדגישים כי ההבחנה ההמטופובית כלפי הח"כ הבוגר היא רצף ותהליך הסתגלותי הנותן מענה לצרכים ביולוגיים.

עם הידע הגובר על ביולוגיה של התא וההיבטים המולקולריים המאפיינים את megakaryopoiesis¹², רוב המחקר המוקדש לחקר התהליך על ידי cytometry זרימה מוגבלים לזיהוי של חברי כנסת בוגרים באמצעות סמני פני השטח ספציפיים לשושלת (כלומר, CD42A / B, CD41 / CD61), בעוד שלבי בידול ח"כים מוקדמים יותר נותרו לא נחקרו. תיעדנו בעבר אסטרטגיה לביים megakaryopoiesis במח עצם העכבר ומח העצם נגזר תרבויות MK^13,14, אשר הסתגלנו והחלנו על בני אדם¹⁵. במאמר הנוכחי אנו מראים אסטרטגיית אימונופנוטיפינג המאפשרת אפיון של מגה-קרויף, מ- HSCs לחברי כנסת בוגרים, במקורות ראשוניים אנושיים (מח עצם - BM - ודם היקפי - PB-) או בתרבויות במבחנה באמצעות פאנל המשלב סמני משטח ספציפיים ולא ספציפיים של MK (CD61, CD42B, CD49B, CD31, KIT ו- CD71, בין היתר). למרות גודלו הגדול ושבריריותו, חברי הכנסת יכולים להיות אימונופנוטיים באמצעות סמני פני התא הנ"ל ומועשרים על ידי מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות בתנאים מסוימים של לחץ וקוטר זרבובית כדי למזער את קרע התא ו /או נזק. טכניקה זו מקלה על גישות multi-Omics, במטרה להבין טוב יותר את המורכבות של megakaryopoiesis וייצור טסיות דם בבריאות האדם ומחלות. ראוי לציין, זה יהיה להוות כלי שימושי כדי לסייע אבחון ופרוגנוזה בהקשר קליני של ביקוש גובר.

בכתב יד זה אנו מתעדים אסטרטגיה לביים מגה-קריופוסיס אנושי עם פאנל המשלב סמני שטח ספציפיים ל- MK ולא ספציפיים ממקורות ראשוניים או שנוצרו במבחנה. בנוסף, אנו מספקים פרוטוקול למיון, עם סדרן תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות, השברים המועדפים וחברי הכנסת הבוגרים (איור 1). צעד זה אינו פופולרי, שכן מבחינה טכנית הוא קשה בשל גודלם הגדול ושבריריותם של חברי הכנסת. עם זאת, הוא הועסק הן בדגימות עכבר ומח עצם אנושי בעבר, והן בשל התקדמות טכנולוגית, עם תוצאה טובה יותר בכל פעם^16,17,18. מקורות עיקריים אנושיים שבהם ניתן ללמוד חברי כנסת או ח"כים כוללים בין היתר מח עצם, דם טבורי ודם היקפי. העיבוד המדגם הנכון כדי לבודד את שבר התא הרלוונטי לניתוח על כל מדגם הוא בעל חשיבות. נהלים סטנדרטיים משולבים, עם כמה שיקולים לקחת בחשבון כאשר מכוונים לחקר megakaryopoiesis.

Protocol

דגימות שלמות של דם ומח עצם התקבלו וטופלו בהתאם להצהרת הלסינקי משנת 1964. דגימות דם שלמות התקבלו מתורמים בריאים לאחר מתן הסכמה מדעת (ISPA), במסגרת מחקר שאושר על ידי ועדת האתיקה הרפואית המוסדית שלנו (בית החולים יוניברסיטריו סנטרל דה אסטוריאס -HUCA-). דגימות מח עצם התקבלו מח עצם לשאוף להשליך חומר של חולים המנוהלים על המחלקה להמטולוגיה של בית החולים Clínico סן קרלוס (HCSC).

איור 1: ייצוג סכמטי של הפרוטוקול המתועד בכתב יד זה. המקורות האנושיים העיקריים או תרבויות ראשוניות שבהן ניתן לביים את הבידול של ח"כים באמצעות אימונופנוטיפינג מסומנים. אסטרטגיה אימונופנוטיפינג זו יכולה להיות מיושמת על חקר התהליך בפתולוגיות שונות הקשורות לשושלת או ממאירות במקורות ראשוניים. בנוסף, היא מאפשרת מיון תאים של חברי כנסת ומבשרים באמצעות סדרן תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות, המאפשר ניתוח נוסף של שברים מועשרים. תמונות המשמשות הן חלק מאמנות Servier Medical Art (SMART) של Servier ומורשה תחת CC BY 3.0. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

1. עיבוד מח דם ועצמות שלם לפני אימונופנוטיפינג

1. בעת שימוש בדם שלם (WB) מתרומות כמקור עיקרי, באופן אופציונלי לבודד את המרכיב תא מונונוקולרי דם היקפי (PBMC). זה יכול להיות מושגת באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית סטנדרטית בשילוב עם הפרדת תאים הדרגתית צפיפות, כפי שתואר קודם לכן¹⁵.
   1. בקצרה, דם צנטריפוגה ב 193 x g במשך 15 דקות (בלם 3) בטמפרטורת החדר. השלך את שבר הפלזמה העליון ולאסוף את טבעת באפי. לדלל 1:1 עם מלוחים חיץ פוספט (PBS)/טריסודיום ציטראט דיהידראט (38 g/L, pH 7) מאגר פיפטה בזהירות נפח של 25 מ"ל על גבי 15 מ"ל של פתרון הדרגתי צפיפות (1.076 g/mL) ב 50 צינורות mL.
   2. צנטריפוגה במשך 20 דקות ב 1114 x גרם (מאיץ 3, בלם 3, טמפרטורת החדר). השלך את שבר הפלזמה ולאסוף את טבעת באפי המכילה PBMCs. לשטוף על ידי הוספת נפח זהה של PBS, צנטריפוגה ב 435 x g במשך 5 דקות, ו resuspend ב- PBS לשימוש נוסף.
2. לחלופין, השתמש מדגם WB (סביב 100 μL) עבור immunophenotyping לאחר lysing את כדוריות הדם האדומות (RBCs) ושטיפה יסודית.
   1. בקצרה, לדלל 1:1 במאגר קרח קר RBC lysing (4.15 גרם של NH₄Cl, 0.5 גרם של KHCO₃ ו 18.5 מ"ג של EDTA (טריפלקס III) כדי 500 מ"ל של H₂O, pH 7.1-7.4). המתן עד שהשעיית התא תהפוך לאדום שקוף (3-5 דקות).
   2. צנטריפוגה ב 435 x g במשך 5 דקות, ב 4 מעלות צלזיוס, ו resuspend התאים PBS. חזור על ההליך פעמים רבות ככל הנדרש כדי לקבל גלולה תא לבן.
3. באופן דומה, לעבד ישירות את הדגימות המתקבלות ממח העצם (שאיפה) עם חיץ lysing RBC (ראה נקודה 1.2) ושטיפה יסודית, כמו להתחיל עם השעיה ברורה של תא יחיד (איור 1).
   1. הימנעו משימוש במערבולת כדי לערבב דגימות במהלך העיבוד, שכן הדבר עלול לפגוע בחברי הכנסת השבירים.
      הערה: מעבר צבע של צפיפות להשגת מחשבי PCBM עלול לגרום לשבר תא עשיר ונקי יותר בהשוואה ל- WB בעל תווי RBC. עם זאת, יש לזכור כי חברי כנסת בוגרים בצפיפות גבוהה עלולים ללכת לאיבוד בשבר ה"נויטרופילים". זה יידונו בתוצאות הייצוגיות.

2. בידול MK במבחנה ממחשבי PC

הערה: ניתן להבדיל בין חברי כנסת במבחנה לבין סימנים מקדימים קודמים, כגון CD34⁺ תאים, הקיימים במקורות ראשוניים שונים(כלומר, WB/PBMCs, דם טבורי, מח עצם) ומ- iPSCs. קיימים פרוטוקולים שונים שהוחלו על מטרה זו. כאן, אנו משתמשים בשיטת תרבות שפותחה על ידינו המאפשרת בידול MK ממחשבים אישיים, ללא צורך בהעשרה עבור CD34⁺ סימנים מקדימים^{15,19,20,21,22}.

1. פרוטוקול זה מורכב משלושה שלבי תרבות, שבהם ריכוז הטרומבופויאטין (TPO) גדל בהדרגה על חשבון גורמי גדילה המעדיפים את התפשטותם של סימנים מקדימים קודמים (כלומר,SCF, EPO), אשר יורדים בהדרגה (איור 2)¹⁵.
   1. למדיום הבסיס, השתמש StemSpan SFEM בתוספת 0.4% של תערובת השומנים עשירים בכולסטרול ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין.
      1. למדיום שלב I, השתמש באמצעי הבסיס בתוספת SCF (100 ng/mL), אריתרופויאטין (EPO, 0.5 U/mL) וטרומבופיאטין (TPO, 30 ng/mL). המדיום שלב II הוא אמצעי הבסיס בתוספת SCF (50 ng/mL), EPO (0.25 U/mL) ו- TPO (50 ng/mL). למדיום שלב III, השתמש באמצעי הבסיס בתוספת TPO (100 ng/mL).
   2. מחשבי תרבות במדיום שלב I. ביום 6-8, מקם את המחשבים האישיים באמצעי שלב II וביום 9-12 מקם את המחשבים האישיים באמצעי שלב III.
   3. החלף בינוני על ידי תאים צנטריפוגה ב 435 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר משלב I לשלב II, ו ב 95 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר משלב II לשלב III, ו resuspending אותם במדיום טרי.
   4. תאי תרבות באינקובטור ב 37 °C (69 °F), 5% CO₂. בתרבויות הפריימריז הללו, הבידול בין ח"כים נמשך 10-14 ימים, וניתן לצייר דגימות בנקודות זמן שונות לאורך כל תקופת התרבות, בהתאם לבידול הח"כים.

איור 2: ייצוג סכמטי של שיטת התרבות MK הנגזרת מ- PBMC. מחשבים אישיים מתורמים בריאים היו מתורבתים על פי הפרוטוקול התלת פאזי שפותח על ידינו כדי ליצור MK במבחנה (תוכנית המותאמת מ Salunkhe ואח '). ¹⁵ תמונות שצולמו ביום 10 וביום 13 של תרבות מוצגות. תמונות נלקחות עם מטרה 20X. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

2. אוסף לדוגמה: לשטוף תאים על ידי החלת צנטריפוגה במהירות נמוכה במשך 5 דקות (95 x g) ולהזרים אותם מחדש PBS או PBS המכיל 1% של אלבומין סרום שור (BSA). עבור אימונופנוטיפינג, הצפיפות האידיאלית היא 10⁵-10⁶ תאים / 100 μL (ראה נקודה 3.1). בהתאם למצב של התרבויות(כלומר, נוכחות של תאים מתים, פסולת, וכו '), 1 או 2 שטיפות עשוי להיות נחוץ. לאסוף את התאים שלך בנקודות הזמן של עניין במהלך התרבות.

3. אימונופנוטיפינג של בידול MK - דגירה עם פאנל של נוגדנים מתויגים

1. דגירה דגימות התא עם פאנל של מתויגים-נוגדנים בעקבות נהלים סטנדרטיים, לשים לב צנטריפוגה במהירות נמוכה (95 x g) בעת עיבוד megakaryocytes. אנחנו בדרך כלל דגירה את הדגימות עם 1% BSA ב PBS בכמויות של 100 μL ב 4 מעלות צלזיוס, 20 דקות, עם טווח של 10⁵-10⁶ תאים.
2. התאם את קנה המידה בעת הצורך.
3. לאחר הדגירה, להוסיף 5 מ"ל של 1% BSA ב PBS, צנטריפוגה במהירות נמוכה (95 x g), לשאוף את supernatant ולהשתעלות מחדש את המדגם ב 2% BSA ב PBS כדי לשמר את הכדאיות MK (2 מ"ל). הוסף EDTA 1-5 mM כדי לשבש אגרגטים תאים (אשר נראים באופן טבעי בתרבויות MK).
4. העבר דגימות לתוך צינור תחתון עגול 12 x 75 מ"מ (צינור FACS) או צלחת, שמירה אותם בחושך עד ניתוח cytometry זרימה או מיון תאים.
5. הכנת הנוגדנים הבודדים ותערובות לוח הנוגדנים; הגדרת ציטומטר הזרימה:
   1. טיטר את הנוגדנים לפני השימוש בהם כדי לקבוע את הריכוז האופטימלי בלוחות הנוגדנים. הריכוז האופטימלי של נוגדנים הוא הריכוז הנמוך ביותר המפריד בין חיובי בבירור לתאים שליליים (ומאפשר הבחנה של רמות ביניים של ביטוי). לדוגמה, רוב הנוגדנים משמשים בדילול 1:200 (מלאי 100 מיקרוגרם / מ"ל) אלא אם כן צוין אחרת על ידי היצרן.
   2. לאחר שנקבעה טיטרציה הנוגדן, להכין דילול 10x של כל נוגדן. דילולים אלה משמשים לפקדים בצבע יחיד ולהכנת תערובות החלונית. הדילולים ותערובות החלונית הם בסדר לשימוש גם חודש לאחר ההכנה (מאוחסן ב 4 מעלות צלזיוס, אלא אם כן אינדיקציות היצרן למנוע תנאי אחסון אלה). זה מאפשר כתמים של דגימות עם אותו פאנל לאורך פרק זמן.
   3. השתמש 10 μL לכל 100 μL של דילול 10x הן עבור פקדים בצבע יחיד והן עבור תערובת הלוח.
      1. עבור פקדים בצבע יחיד, להשתמש חרוזי זיקה נוגדנים, אשר ניתן למדוד ישירות לאחר הוספת הנוגדן. יש למדוד את הפקדים בצבע יחיד בכל ניסוי, כדי לאפשר התאמת פיצוי נאותה (וכוונון עדין לאחר המדידה עם תוכנת הניתוח).
      2. לחלופין, בצע את הפקדים בצבע יחיד באמצעות דוגמאות תאים. עם זאת, החרוזים מאפשרים מדידה מהירה של מספר נתון של אירועים, אשר, בהתאם לסמן הנוגדן / פני השטח, לא ניתן להשיג על מקורות תאים ראשוניים או תרבותיים מורכבים. כמו כן, אנו ממליצים להפעיל דגימות תאים מוכתמות "פלואורסצנטיות מינוס אחד" (FMO) לוח מתערבב כדי להגדיר את הגדרות הפיצוי המתאימות (לפני הפעלת ניסויים). זה רלוונטי כדי לזהות בקפידה בעיות פיצוי, ובמיוחד, בחברי כנסת תרבותיים, כדי לזהות הפרעות שפעת אוטומטית (אשר יהיה נוכח אם באמצעות מדיום תרבות המכיל פנול אדום).
   4. הכינו מספיק נפח של תערובת הפאנלים, בהתאם למספר הדגימות, המכילות את הנוגדנים של הפאנל המתוכנן. רוב הלוחות שלנו כוללים שישה נוגדנים (לוחות 6 צבעים, ראה שולחנות 1-2).
   5. עבור לוחות אלה, להשתמש 488 ננומטר ו 633 ננומטר לייזרים של cytometer זרימה, עם זאת, לוחות ניתן להתאים תרחישים טכניים אחרים. יתר על כן, שיקולי הפיצוי ניתן לייתר בעת שימוש cytometry זרימה מבוססת ספקטרומטריה המונית או ציטומטרים עם טכנולוגיית מיקוד אקוסטית.
      1. צבעים למדידת כדאיות עשויים למסור מידע כוזב לגבי חברי הכנסת, במיוחד כאשר הם מתבגרים. חברי הכנסת הם תאים פעילים מאוד, וחיוביות עם הוכסט, 7-AAD או PE, לא תמיד משקפת מוות תאי בפועל. חלופה (אם נדרשת מדידת מוות של תאים) עשויה להיות שימוש בכתמי מיטוכונדריה (CMX Ros) או צבעים תגובתיים של אמין (צבעי זומבי או רוח רפאים).

טבלה 1: הערות על סמני פני התא של שושלת המגה-קריוציטי אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2: לוחות נוגדנים אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

4. ניתוח Ploidy בשילוב עם לוחות 6 צבעים

1. לניתוח ploidy, בשילוב עם פאנל נוגדנים 6 צבעים, להמשיך עם קיבוע וחמלה של תאים לאחר הדגירה עם פאנל הנוגדנים. אסטרטגיה זו תאפשר שימור של כתמי סמן פני השטח, תוך מתן הכתמת ה- DNA של התאים. אנו משתמשים Hoechst 33342 כדי להכתים DNA, כפי שניתן לדמיין עם לייזר סגול זמין 405 ננומטר.
2. עבור 10⁵-10⁶ תאים, לאחר הדגירה עם לוח הנוגדנים, תאי צנטריפוגה (95 x g במשך 5 דקות), resuspend ב 200 μL של מאגר קיבוע דגירה 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
3. תאי צנטריפוגה כפי שצוין לעיל, resuspended בפעם השנייה ב 200 מאגר קיבוע μL, ולהדגיר עוד 10 דקות ב RT.
4. הכן מאגר חדירות, המכיל 0.1% טריטון X-100, 200 מ"ג / מ"ל RNase ו 20 מ"ג / מ"ל Hoechst 33342 (ניקוב Hoechst MIX).
5. תאים צנטריפוגה כאמור לעיל, resuspend אותם ב 300 μL של פרמביליזציה Hoechst MIX ואת הדגירה 30 דקות ב 37 °C (69 °F). שלב זה חשוב מאוד, שכן, על מנת לקבל מדידה ploidy נקי, RNA יש להשפיל.
6. לאחר זמן הדגירה, למדוד דגימות ישירות עם ציטומטר זרימה. אחרת, לשמור את הדגימות ב 4 מעלות צלזיוס, בחושך. למדוד אותם מיד. עם זאת, מאז דגימות אלה קבועים, המדידה יכולה להתעכב אפילו 24-48 שעות. ודא שהדגימה מצליפה ביסודיות לפני המדידה, או מועברת דרך מסננת תאים, כדי להבטיח השעיה של תא בודד.
   1. פרמטרים מורפומטריים כגון פיזור קדימה וצד אינם נשמרים לאחר קיבוע תאים. ההתוויה פיזור קדימה/צדדי תציג התכווצות של התפלגות התאים לאחר הקיבעון. עם זאת, כתמי סמן פני השטח נשמרים ברובם, ואסטרטגיית הגטינג בקושי משתנה, ומאפשרת ניתוח של מצב הפלוידיה בשלבים השונים של הבידול המוגדרים על ידי שילובי סמן פני השטח.

5. ניתוח בידול ח"כים

הערה: ראינו כי השילוב של CD31/CD71 מאפשר להגדיר מספר שערים התואמים לשלבים שונים של בידול MK. חזרה נוספת עם סמנים ספציפיים לח"כים מאפשרת הפרדה בין חברי כנסת בוגרים ולא בוגרים. יתר על כן, בדגימות טריות, back-gating כדי לאמת את נוכחותם של סמנים אחרים בשימוש, או למקם את האוכלוסיות בצירים פיזור קדימה / צד, מזקק את ההערכה של שלבי בידול MK ומאפשר להשליך סוגי תאים אחרים שיכולים להיות נוכחים על אותן אוכלוסיות.

1. השתמש בפאנל של נוגדנים הכולל סמני הקדמה מוקדמים (KIT, CD34), סמני קודמן נפוצים (CD31, CD71) וסמני שושלת, חלקם ספציפיים (CD42A/CD42B, CD49B, CD41/CD61, CLEC2, GPVI וכו ') (ראה טבלאות 1-2). השימוש בקוקטייל שושלת (Lin) (CD3, CD14, CD16, CD19, CD20 ו- CD56), מאפשר גם "לסנן" תאים hematopoietic בוגרים שעשויים להוסיף רעש לניתוח (בעת בחירת לין^- אוכלוסייה). כדוגמה, נעבור על ניתוח של חברי כנסת במחשבים אישיים, במח עצם ובאמצעות תרביות תאים שמקורן ב- PBMC בתוצאות הייצוגיות.

6. מיון תאים מקדים של ח"כים וח"כים

הערה: התאים המוכתמים נותחו וממוינים על סדרן תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות FACS Aria IIu המצויד בלייזרים 488 ננומטר ו- 633 ננומטר סטנדרטיים במצב מוצק באמצעות תוכנת FACSDiva; הנתונים נותחו והוצגו בנוסף באמצעות תוכנת FlowJo ו- Cytobank (ניתוח viSNE). טוהר של שברים ממוינים אושר על ידי ניתוח cytometry זרימה של כל אחד מהשברים ממוינים (טוהר מעל 85%).

1. בצע מיון תאים בהקדם האפשרי או תוך שעה לאחר הדגירה נוגדן על מנת למנוע הידרדרות התא.
2. סנן את המדגם עם מסננת תאים 100 מיקרומטר כדי להבטיח השעיית תא יחיד ואת השלמות של MK גדול.
3. השתמש זרבובית קרמיקה 130-μm, לחץ נדן מוגדר 11 פאונד לאינץ ' מרובע (PSI) ותדר כונן טיפה להגדיר 12 kHz כדי לשבור את הזרם לתוך טיפות.
4. לפני המיון, לעקר את הזרבובית, נדן, ואת הקווים מדגם על ידי ביצוע רכישה 30 דקות עם פניצילין / סטרפטומיצין מדולל 1:5 במים סטריליים, ואחריו רכישה 10 דקות עם מים סטריליים כדי להסיר decontaminant הנותרים.
5. לאחר שהזרם התייצב, התאם את השהיית הירידה עם חרוזים מומלצים כדי למיין במצב כוונון עדין יותר מ-97.5% מהירידות המשתקפות בקצב זרימה של 400-1200 אירועים לשנייה.
6. הכינו צינורות FACS איסוף עם 500 μL של 2% BSA ב- PBS. אחוז BSA ניתן להגדיל עד 5-10%.
7. צור את תבנית הניסוי עם הפרמטרים המתאימים של מטריצת הפיצוי.
8. טען שפופרת FACS לסיטומטר.
9. בצע מדידה של המדגם כדי להגדיר את השערים הרצויים ואת הטוהר של אוכלוסיות תאי היעד. שמור את הרשומה מופעלת כדי להציג עד 200,000 אירועים בשערי האוכלוסייה שנבחרו במהלך מיון התאים.
10. FACS אריה IIu מאפשר הפרדה של עד 4 אוכלוסיות תאים שונות בו זמנית. צור פריסת מיון חדשה ובחר את התקן האיסוף (4 צינורות) ואת מצב הדיוק המתאים (מומלץ להשתמש במסיכת ביניים של טוהר ושחזור). לבסוף, הוסף את האוכלוסיה המעניינת לכל שדה מיקום מיון (איור 3).

איור 3: ייצוג סכמטי של עקרון מיון התאים המופעל על-ידי פלואורסצנטיות (FACS). החלקיקים עוברים את זרבובית 130 מיקרומטר ונאלצים להתפרק לזרם של טיפות רגילות עקב יישום של רטט לחרבובית. לאחר מכן, הטיפות נחקרות על ידי הלייזר (נקודת ניתוח) והאותות מעובדים כדי לתת את 'החלטת המיון' על ידי החלת חיוב על טיפות אלה. כאשר טיפת טעינה עוברת דרך שדה אלקטרוסטטי במתח גבוה (לוח זיהוי), היא מוטה ונאספת לתוך צינור האיסוף המתאים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

11. טען את צינורות האיסוף והתחל למיין את אוכלוסיות היעד.
12. צנטריפוגה צינורות האיסוף במשך 5 דקות ב 95 x g ו resuspend גלולת התא בנפח המתאים של 2% BSA ב PBS.
13. למדוד שוב שבריר של כל מדגם ממוין, כדי לחשב את הטוהר.
14. אחסן תאים כראוי לשימוש נוסף. תאים ממוינים יכולים לשמש לניתוחים ציטולוגיים ומולקולריים, או להיות מתורבתים מחדש במטרה לחקור את תהליך הבידול של אוכלוסיית תאים נבחרת.

7. הכנה לדוגמה לאחר המיון

1. הכנת ציטוספין לניתוח ציטולוגי עם ציטוצנטריפוגה
   1. הבא תאים ממוינים לנפח עבודה קל לטיפול של 100-200 μL. קח בחשבון כי צפיפות התא יהיה תלוי בתפוקת האוכלוסייה ממוינת בכל מקרה.
   2. הנח שקופית נקייה על מחזיק המתכת והנח מסנן עליון. זכור להוסיף תווית לשקופית ולמסנן כדי להימנע מערבוב דוגמאות.
   3. הוסף PBS של 100 μL על חור המסנן מול השקופית, כך שהמסנן מקבל לחות על שפת החור.
   4. מניחים את המשפך, סוגרים את מחזיק המתכת ומניחים אותו במקומו בצנטריפוגה.
   5. הוסף את המדגם (100-200 μL) בתוך המשפך.
   6. צנטריפוגה ב 36 x g במשך 5 דקות. שקופיות ציטוספין ניתן לאפשר אוויר יבש ב RT (מכוסה כראוי כדי למנוע אבק) והוא יכול להישמר ב RT במשך 1 שבוע לפני immunostaining או היסטוכימיה.
2. לחיסון
   1. לתקן שקופיות ב 2% paraformaldehyde (PFA) מדולל PBS ודגרת במהלך 5min.
      1. ניתן להשתמש בטווח של 0.5-4% PFA ב- PBS. בידיים שלנו, אנו משתמשים 4% כדי להשיג קיבוע נאות של רקמות או כמה סוגי תאים, ו 0.5% PFA ב PBS מספיק טסיות טיס. בעת הגדרת טכניקה זו, האחוז הנכון של PFA דורש מיטוב לכל סוג תא/מקור.
   2. דגירה 5 דקות ב- PBS.
   3. דגירה 5 דקות ב 50% אתנול (EtOH).
   4. דגירה 5 דקות ב 70% EtOH.
   5. יש לאחסן ב-70% EtOH ב-20ºC.
   6. בעת ביצוע האימונוסטיזציה, התפוררות מחדש ובצע נהלים סטנדרטיים (חדירות, כביסה, חסימה, דגירה ראשונית ומשנית של נוגדנים, שימור וכו ').
3. לציטוכימיה:
   הערה: ניתן להכתים את השקופיות בכתם מאי-גרינוולד גימסה או בכתמים הנוחים לכל מטרה.
4. לבדיקה מורפולוגית מיידית
   1. הוסף טיפה אחת של מדיום הרכבה על הנקודה המכילה תא של ציטוספין ומניחים כיסוי.
   2. שמור על שקופיות ב 4 °C (60 °F) לא יותר משבוע, אלא אם כן אטום, המאפשר אחסון לטווח ארוך גם ב RT. הרכבה קיבעון בינוני מאפשר אחסון לטווח ארוך ב RT.

תוצאות

מח עצם ופלוידי
באיור 4, אנו מראים ניתוח אימונופנוטיפינג מייצג של מגה-קרויפוזיס בדגימות BM (שאיפה) מחולים. בעת התוויית השבר התאי מול CD71 ו- CD31, יש לנו מגודר שש אוכלוסיות עיקריות: CD31^- CD71^- (אדום), CD31^- CD71⁺ (כחול), CD31⁺ CD71^- (כתום), CD31

Discussion

רוב המחקר המתמקד במחקר של megakaryopoiesis על ידי cytometry זרימה מוגבל עד כה לזיהוי של תת-קבוצות MK באמצעות סמני משטח ספציפיים לשושלת בלבד (כלומר,CD42A/CD42B, CD41/CD61), בעוד שלבי בידול ח"כים קודמים נבדקו בצורה גרועה. במאמר הנוכחי אנו מראים אסטרטגיה אימונופנוטיפינג כדי לטפל אפיון cytometry זרימה מקיפה של מגה-קר...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
130 micron Nozzle	BD	643943	required for MK sorting
5810R Centrifuge	Eppendorf		Cell isolation and washes
A-4-62 Swing Bucket Rotor	Eppendorf		Cell isolation and washes
Aerospray Pro Hematology Slide Stainer / Cytocentrifuge	ELITech Group		Automatized cytology devise, where slides are stained with Mat-Grünwald Giemsa
CO2 Incubator Galaxy 170 S	Eppendorf		Cell Incubation
Cytospin 4 Cytocentrifuge	Thermo Scientific		To prepare cytospins
FACSAria IIu sorter	BD		Lasers 488-nm and 633-nm
FACSCanto II flow cytometer	BD		Lasers 488-nm , 633-nm and 405-nm
Olympus Microscope BX 41	Olympus		Microphotographs
Olympus Microscope BX 61	Olympus		Microphotographs
Zoe Fluorescent Cell Imager	BioRad		Microphotographs
To obtain PBMCs
Lipids Cholesterol Rich from adult bovine serum	Sigma-Aldrich	L4646	or similar
Lymphoprep	Stem Cell Technologies	#07801	or similar
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	or similar
Recombinant human Erythropoietin (EPO)	R&D Systems	287-TC-500	or similar
Recombinant human stem cell factor (SCF)	Thermo Fisher Scientific, Gibco™	PHC2115	or similar
Recombinant human thrombopoietin (TPO)	Thermo Fisher Scientific, Gibco™	PHC9514	or TPO receptor agonists
StemSpan SFEM	Stem Cell Technologies	#09650
Flow Cytometry Analyses
Bovine Serum Albumin	Merck	A7906-100G	or similar
BD CompBead Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD	552843	Antibodies for human cells are generally from mouse.
BD Cytofix/Cytoperm	BD	554714	or similar
BD FACS Accudrop Beads	BD	345249
CD31 AF-647	BD	561654	Mouse anti-human
CD31 FITC	Immunostep	31F-100T
CD34 FITC	BD	555821	Mouse anti-human
CD41 PE	BD	555467	Mouse anti-human
CD41 PerCP-Cy5.5	BD	333148	Mouse anti-human
CD42A APC	Immunostep	42AA-100T	We observed unspecific binding... that needs to be assessed
CD42A PE	BD	558819	Mouse anti-human
CD42B PerCP	Biolegend	303910	Mouse anti-human
CD49B PE	BD	555669	Mouse anti-human
CD61 FITC	BD	555753	Mouse anti-human
CD71 APC-Cy7	Biolegend	334109	Mouse anti-human
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
Human BD Fc Block	BD	564219	Fc blocking - control
KIT PE-Cy7	Biolegend	313212	Mouse anti-human
Lineage Cocktail 2 FITC	BD	643397	Mouse anti-human
RNAse	Merck	R6513	or similar
Triton X-500	Merck	93443-500ML	or similar
Cell strainers for sorting
CellTrics Filters 100 micrometers	Sysmex	04-004-2328	Cell strainers
Note: we do not specify general reagents/chemicals (PBS, EDTA, etc) or disposables (tubes, etc), or reagents specified in previous published and standard protocols  - unless otherwise specified.