Immunphänotypisierung und Zellsortierung von humanen MKs aus menschlichen Primärquellen oder differenziert in vitro von hämatopoetischen Vorläufern

Zusammenfassung

Hier stellen wir eine Immunphänotypisierungsstrategie zur Charakterisierung der Megakaryozytendifferenzierung vor und zeigen, wie diese Strategie die Sortierung von Megakaryozyten in verschiedenen Stadien mit einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer ermöglicht. Die Methodik kann auf menschliche Primärgewebe, aber auch auf Megakaryozyten angewendet werden, die in Kultur in vitroerzeugt werden.

Zusammenfassung

Die Differenzierung von Megakaryozyten (MK) umfasst eine Reihe endobiotischer Zyklen, die zu einer hochgradig polyploiden (sogar >64N reichenden) und extrem großen Zelle (40-60 μm) führen. Im Gegensatz zu dem schnell wachsenden Wissen über Megakaryopoese auf zellbiologischer und molekularer Ebene beschränkt sich die Charakterisierung der Megakaryopoese durch Durchflusszytometrie auf die Identifizierung reifer MKs mit linienspezifischen Oberflächenmarkern, während frühere MK-Differenzierungsstadien unerforscht bleiben. Hier präsentieren wir eine Immunphänotypisierungsstrategie, die die Identifizierung aufeinanderfolgender MK-Differenzierungsstufen mit zunehmendem Ploidiestatus in menschlichen Primärquellen oder In-vitro-Kulturen mit einem Panel ermöglicht, das MK-spezifische und unspezifische Oberflächenmarker integriert. Trotz ihrer Größe und Zerbrechlichkeit können MKs mit dem oben genannten Panel immunphänotypisiert und durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung unter bestimmten Druck- und Düsendurchmesserbedingungen angereichert werden. Dieser Ansatz ermöglicht Multi-Omics-Studien mit dem Ziel, die Komplexität der Megakaryopoese und der Thrombozytenproduktion beim Menschen besser zu verstehen. Eine bessere Charakterisierung der Megakaryopoese kann für die Diagnose oder Prognose von abstammungsbedingten Pathologien und Malignitäten von grundlegender Bedeutung sein.

Einleitung

Megakaryozyten (MKs) entwickeln sich aus hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) nach einem komplexen Prozess namens Megakaryopoese, der hauptsächlich durch das Hormon Thrombopoietin (TPO) orchestriert wird. Die klassische Sicht der Megakaryopoese beschreibt die zelluläre Reise von HSCs durch eine Abfolge von hierarchischen Stadien engagierter Vorläufer und Vorläuferzellen, die letztendlich zu einem reifen MK führen. Während der Reifung erleben MKs mehrere Runden der Endomitose, entwickeln ein kompliziertes intrazelluläres Demarkationsmembransystem (DMS), das genügend Membranoberfläche für die Thrombozytenproduktion bietet, und produzieren und verpacken effizient die Füll....

Protokoll

Vollblut- und Knochenmarkproben wurden gemäß der Deklaration von Helsinki von 1964 gewonnen und verarbeitet. Vollblutproben wurden von gesunden Spendern nach Erteilung der Einwilligung nach Aufklärung (ISPA) im Rahmen einer Studie gewonnen, die von unserem institutionellen medizinischen Ethikkomitee (Hospital Universitario Central de Asturias -HUCA-) genehmigt wurde. Knochenmarkproben wurden aus Knochenmarkabwurfmaterial von Patienten gewonnen, die in der Abteilung für Hämatologie des Krankenhauses Clínico San Carlos (HCSC) behandelt wurden.

Ergebnisse

Knochenmark und Ploidie
In Abbildung 4zeigenwir eine repräsentative Immunphänotypisierungsanalyse der Megakaryopoese in BM-Proben (Aspiration) von Patienten. Bei der Darstellung der Zellfraktion gegen CD71 und CD31 haben wir sechs Hauptpopulationen einbezahlt: CD31^- CD71^- (rot), CD31^- CD71⁺ (blau), CD31⁺ CD71^- (orange), CD31⁺ CD71^Mid (hellgrün), CD31⁺ CD7.......

Diskussion

Der größte Teil der Forschung, die sich auf die Untersuchung der Megakaryopoese mittels Durchflusszytometrie konzentriert, beschränkt sich bisher auf die Identifizierung von MK-Untergruppen, die nur linienspezifische Oberflächenmarker(d. H.CD42A / CD42B, CD41 / CD61) verwenden, während frühere MK-Differenzierungsstadien schlecht untersucht wurden. Im vorliegenden Artikel zeigen wir eine Immunphänotypisierungsstrategie, um eine umfassende durchflusszytometrische Charakterisierung der menschlichen Megakaryo.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
130 micron Nozzle	BD	643943	required for MK sorting
5810R Centrifuge	Eppendorf		Cell isolation and washes
A-4-62 Swing Bucket Rotor	Eppendorf		Cell isolation and washes
Aerospray Pro Hematology Slide Stainer / Cytocentrifuge	ELITech Group		Automatized cytology devise, where slides are stained with Mat-Grünwald Giemsa
CO2 Incubator Galaxy 170 S	Eppendorf		Cell Incubation
Cytospin 4 Cytocentrifuge	Thermo Scientific		To prepare cytospins
FACSAria IIu sorter	BD		Lasers 488-nm and 633-nm
FACSCanto II flow cytometer	BD		Lasers 488-nm , 633-nm and 405-nm
Olympus Microscope BX 41	Olympus		Microphotographs
Olympus Microscope BX 61	Olympus		Microphotographs
Zoe Fluorescent Cell Imager	BioRad		Microphotographs
To obtain PBMCs
Lipids Cholesterol Rich from adult bovine serum	Sigma-Aldrich	L4646	or similar
Lymphoprep	Stem Cell Technologies	#07801	or similar
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	or similar
Recombinant human Erythropoietin (EPO)	R&D Systems	287-TC-500	or similar
Recombinant human stem cell factor (SCF)	Thermo Fisher Scientific, Gibco™	PHC2115	or similar
Recombinant human thrombopoietin (TPO)	Thermo Fisher Scientific, Gibco™	PHC9514	or TPO receptor agonists
StemSpan SFEM	Stem Cell Technologies	#09650
Flow Cytometry Analyses
Bovine Serum Albumin	Merck	A7906-100G	or similar
BD CompBead Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD	552843	Antibodies for human cells are generally from mouse.
BD Cytofix/Cytoperm	BD	554714	or similar
BD FACS Accudrop Beads	BD	345249
CD31 AF-647	BD	561654	Mouse anti-human
CD31 FITC	Immunostep	31F-100T
CD34 FITC	BD	555821	Mouse anti-human
CD41 PE	BD	555467	Mouse anti-human
CD41 PerCP-Cy5.5	BD	333148	Mouse anti-human
CD42A APC	Immunostep	42AA-100T	We observed unspecific binding... that needs to be assessed
CD42A PE	BD	558819	Mouse anti-human
CD42B PerCP	Biolegend	303910	Mouse anti-human
CD49B PE	BD	555669	Mouse anti-human
CD61 FITC	BD	555753	Mouse anti-human
CD71 APC-Cy7	Biolegend	334109	Mouse anti-human
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
Human BD Fc Block	BD	564219	Fc blocking - control
KIT PE-Cy7	Biolegend	313212	Mouse anti-human
Lineage Cocktail 2 FITC	BD	643397	Mouse anti-human
RNAse	Merck	R6513	or similar
Triton X-500	Merck	93443-500ML	or similar
Cell strainers for sorting
CellTrics Filters 100 micrometers	Sysmex	04-004-2328	Cell strainers
Note: we do not specify general reagents/chemicals (PBS, EDTA, etc) or disposables (tubes, etc), or reagents specified in previous published and standard protocols  - unless otherwise specified.