Иммунофенотипирование и сортировка клеток человеческих МК из первичных источников человека или дифференцированных in vitro от кроветворных прародителей

Резюме

Здесь мы представляем стратегию иммунофенотипирования для характеристики дифференцировки мегакариоцитов и показываем, как эта стратегия позволяет сортировать мегакариоциты на разных стадиях с помощью флуоресцентно-активированного сортировщика клеток. Методика может быть применена к первичным тканям человека, а также к мегакариоцитам, образуемым в культуре in vitro.

Аннотация

Дифференцировка мегакариоцитов (МК) охватывает ряд эндомитотических циклов, которые приводят к высокополиплоидной (достигающей еще >64N) и чрезвычайно большой клетке (40-60 мкм). В отличие от быстро растущих знаний о мегакариопоэсисе на клеточном биологии и молекулярном уровне, характеристика мегакариопоэтиса с помощью проточной цитометрии ограничивается идентификацией зрелых МК с использованием специфических для линии поверхностных маркеров, в то время как более ранние стадии дифференцировки МК остаются неисследованными. Здесь мы представляем стратегию иммунофенотипирования, которая позволяет идентифицировать последовательные стадии дифференцировки МК с возрастающим статусом плоидности в первичных источниках человека или культурах in vitro с панелью, объединяющей специфические и неспецифические поверхностные маркеры МК. Несмотря на свои размеры и хрупкость, МК могут быть иммунофенотипированы с использованием вышеупомянутой панели и обогащены флуоресцентно-активированной сортировкой клеток при определенных условиях давления и диаметра сопла. Этот подход облегчает мультиомические исследования с целью лучшего понимания сложности мегакариопоэтиса и производства тромбоцитов у людей. Лучшая характеристика мегакариопоэтиса может представлять собой фундаментальную в диагностике или прогнозе связанных с линией патологий и злокачественных новообразований.

Введение

Мегакариоциты (МК) развиваются из гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) после сложного процесса, называемого мегакариопоэзом, который управляется в основном гормоном тромбопоэтином (ТПО). Классический взгляд на мегакариопоэтизис описывает клеточное путешествие от ГСК через последовательность иерархических стадий преданных предшественников и клеток-предшественников, что в конечном итоге приводит к зрелому МК. Во время созревания МК испытывают множественные раунды эндомитоза, развивают сложную внутриклеточную демаркационную мембранную систему (ДМС), которая обеспечивает достаточную поверхность мембраны для производства тромбоцитов, и эффективно производят и упаковывают....

протокол

Образцы цельной крови и костного мозга были получены и обработаны в соответствии с Хельсинкской декларацией 1964 года. Образцы цельной крови были получены от здоровых доноров после предоставления информированного согласия (ISPA) в рамках исследования, одобренного нашим институциональным медицинским этическим комитетом (Hospital Universitario Central de Asturias -HUCA-). Образцы костного мозга были получены из материала отбрасывания аспирата костного мозга пациентов, управляемых в отделе гематологии больницы Clínico San Carlos (HCSC).

Результаты

Костный мозг и плоидия
Нарисунке 4показан репрезентативный иммунофенотипический анализ мегакариопоэтиса в БМ-образцах (аспирация) пациентов. При построении клеточной фракции против CD71 и CD31 мы определили шесть основных популяций: CD31^- CD71^- .......

Обсуждение

Большинство исследований, сосредоточенных на изучении мегакариопоэзиса с помощью проточной цитометрии, на сегодняшний день ограничены идентификацией подмножеств МК с использованием только специфических для линии поверхностных маркеров(т.е.CD42A / CD42B, CD41 / CD61), в то время как более р.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
130 micron Nozzle	BD	643943	required for MK sorting
5810R Centrifuge	Eppendorf		Cell isolation and washes
A-4-62 Swing Bucket Rotor	Eppendorf		Cell isolation and washes
Aerospray Pro Hematology Slide Stainer / Cytocentrifuge	ELITech Group		Automatized cytology devise, where slides are stained with Mat-Grünwald Giemsa
CO2 Incubator Galaxy 170 S	Eppendorf		Cell Incubation
Cytospin 4 Cytocentrifuge	Thermo Scientific		To prepare cytospins
FACSAria IIu sorter	BD		Lasers 488-nm and 633-nm
FACSCanto II flow cytometer	BD		Lasers 488-nm , 633-nm and 405-nm
Olympus Microscope BX 41	Olympus		Microphotographs
Olympus Microscope BX 61	Olympus		Microphotographs
Zoe Fluorescent Cell Imager	BioRad		Microphotographs
To obtain PBMCs
Lipids Cholesterol Rich from adult bovine serum	Sigma-Aldrich	L4646	or similar
Lymphoprep	Stem Cell Technologies	#07801	or similar
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	or similar
Recombinant human Erythropoietin (EPO)	R&D Systems	287-TC-500	or similar
Recombinant human stem cell factor (SCF)	Thermo Fisher Scientific, Gibco™	PHC2115	or similar
Recombinant human thrombopoietin (TPO)	Thermo Fisher Scientific, Gibco™	PHC9514	or TPO receptor agonists
StemSpan SFEM	Stem Cell Technologies	#09650
Flow Cytometry Analyses
Bovine Serum Albumin	Merck	A7906-100G	or similar
BD CompBead Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD	552843	Antibodies for human cells are generally from mouse.
BD Cytofix/Cytoperm	BD	554714	or similar
BD FACS Accudrop Beads	BD	345249
CD31 AF-647	BD	561654	Mouse anti-human
CD31 FITC	Immunostep	31F-100T
CD34 FITC	BD	555821	Mouse anti-human
CD41 PE	BD	555467	Mouse anti-human
CD41 PerCP-Cy5.5	BD	333148	Mouse anti-human
CD42A APC	Immunostep	42AA-100T	We observed unspecific binding... that needs to be assessed
CD42A PE	BD	558819	Mouse anti-human
CD42B PerCP	Biolegend	303910	Mouse anti-human
CD49B PE	BD	555669	Mouse anti-human
CD61 FITC	BD	555753	Mouse anti-human
CD71 APC-Cy7	Biolegend	334109	Mouse anti-human
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
Human BD Fc Block	BD	564219	Fc blocking - control
KIT PE-Cy7	Biolegend	313212	Mouse anti-human
Lineage Cocktail 2 FITC	BD	643397	Mouse anti-human
RNAse	Merck	R6513	or similar
Triton X-500	Merck	93443-500ML	or similar
Cell strainers for sorting
CellTrics Filters 100 micrometers	Sysmex	04-004-2328	Cell strainers
Note: we do not specify general reagents/chemicals (PBS, EDTA, etc) or disposables (tubes, etc), or reagents specified in previous published and standard protocols  - unless otherwise specified.