בדיקה מהירה של עמידות של עץ להתכלות על ידי סרטנים מעץ ימי משעמם

Summary

פרוטוקול זה מציג שיטה להערכת קצב ההאכלה של הסרטן משעמם העץ, לימנוריה, על ידי מדידת ייצור כדורי צואה. שיטה זו מיועדת לשימוש במעבדות שאינן מומחיות ויש לה פוטנציאל להשתלב בפרוטוקולי בדיקה סטנדרטיים, כדי להעריך עמידות עץ משופרת בתנאים ימיים.

Abstract

חסרי חוליות משעממים מעץ הורסים במהירות עצים ימיים ותשתיות חוף מעץ, וגורמים לנזק של מיליארדי דולרים ברחבי העולם מדי שנה. כמו טיפולים של עץ עם biocides ספקטרום רחב, כגון creosote ו כרומטי נחושת arsenate (CCA), מוגבלים כעת בשימוש ימי על ידי חקיקה, מינים עץ עמיד באופן טבעי ושיטות שימור חדשניות של עץ נדרשים. שיטות אלה עוברות בדיקות על מנת לעמוד בסטנדרטים רגולטוריים, כגון התקן האירופי לבדיקת חומרים משמרים מעץ נגד בורי ים, EN 275. חקירה ראשונית של מינים של עצים עמידים או טיפולים משמרים מעץ ניתן להשיג במהירות ובזול באמצעות בדיקות מעבדה, אשר מציע יתרונות רבים על פני ניסויי שדה ימי כי הם בדרך כלל יקר, משתדלים לטווח ארוך. מינים רבים של לימנוריה (גריבל) הם סרטנים משעממים מעץ ימי. לימנוריה אידיאלית לשימוש בבדיקות מעבדה של מתכלים של עץ על ידי בורי עץ ימיים, בשל המעשיות של גידולם באקוואריה וקלות מדידת שיעורי ההאכלה שלהם על עץ. להלן, אנו מתארים בדיקת מעבדה סטנדרטית להערכת מתכלה מעץ באמצעות גריבל.

Introduction

בורי עץ עלולים לגרום נזק נרחב למבני עץ ימיים, כגון הגנות ימיות, מזחים ומבני חקלאות ימית; החלפה או שיקום של אשר עולה מיליארדי דולרים לשנה ברחבי ^{העולם1,2,3}. על מנת להגן על מבנים אלה, עץ מטופל לעתים קרובות כדי להפחית את ההתכלות. עם זאת, בשל הגבלת השימוש בביוצידים רחבי טווח באוסטרליה, האיחוד האירופי, בריטניה וארה"ב, בסביבה הימית, טכניקות שינוי חדשות ומינים של עץ העמידים באופן טבעי עבור borers מבוקשים על 4,5,6,7. טכניקות חדשניות לשימור עץ בסביבה הימית דורשות בדיקה יסודית על מנת לעמוד בסטנדרטים הרגולטוריים ולהגביל את ההשפעות הסביבתיות מפני מפגעים כגון שטיפה של כל חומר משמר כימי. לדוגמה, התקן האירופי, EN 275, שהוא התקן האירופי הנוכחי משנת 1992, משמש להערכת טיפולים לשימור עץ נגד נזקי עץ ^{ימיים8,9}. תקן זה, יחד עם חקיקה אחרת נגד השימוש בתרכובות ביו-דידל, כגון CCA4,5,6,7 ו- creosote10, מחייב שיטות בנות קיימא ולא רעילות להגנה על עץ ושימוש במינים של עצים עמידים באופן טבעי כדי להחליף טיפולים ביוצידליים11,12 . ניסויים ימיים, כגון אלה שצוינו ב- EN 275, דורשים תקופות חשיפה ארוכות ולכן הם יקרים ואיטיים כדי להניב תוצאות משמעותיות. בדיקות מעבדה, לעומת זאת, מספקות חלופה מהירה בהרבה לבדיקת שיטות לשימור מוצרי עץ מפני התקפת עץ ימית, ומאפשרות הערכה מהירה של התאמות ללוחות הזמנים של ^{הטיפול13}. תוצאות מניסוי מעבדה מהיר זה נועדו ליידע תהליכי שינוי חדשניים של עץ ולזהות מינים של עצים עם עמידות טבעית לנזקי בורי. שיעור הזנה נמוך וחיוניות יכולים להצביע על התנגדות מוגברת במוצרים פוטנציאליים ואז ניתן יהיה להזין מידע זה בחזרה לשותפים בתעשייה כדי לאפשר להם לשפר את העיצובים. השיטה שלנו מאפשרת תגובה זריזה ומהירה, כי הוא רצוי בתעשייה, ולאחר מוצרים מבטיחים זוהו, ניתן להשלים את התוצאות עם אלה מניסויים ימיים.

גריבלים (Limnoria) הם סוג של סרטני איזופוד במשפחה לימנורידה. ישנם מעל 60 מינים של לימנוריה ברחבי העולם13,14,15, עם שלושה מינים נפוצים שנמצאו בבריטניה, לימנוריה ליגנורום, לימנוריה טריפונקטה ולימינוריה quadripunctata16. הם נשאו מנהרות על פני העץ השקוע במי ים, ולעתים קרובות גרמו לנזק כלכלי משמעותי. Gribbles הם בשפע רב במים בבריטניה החוף וקל לתחזוקה בתנאי מעבדה, מה שהופך אותם אורגניזמים אידיאליים לחקר מתכלים עץ על ידי חסרי חוליות עץ ימי משעמם. הערכת שיעורי ההאכלה והחיוניות של נבלים על מינים שונים של עצים ושיטות שימור עץ יכולה לקבוע את יעילות ההתנגדות שלהם להתכלות. הפרוטוקול הבא קובע שיטה סטנדרטית למדידת שיעורי האכלה סחוס, שפותחה מזו המתוארת על ידי בורחס ^{ועמיתיו12,17}, בנוסף לייעול כניסת ניתוח תמונה כדי להפוך את התהליך להפעלה במעבדות שאינן מומחים. ניתוח תמונה משמש גם כדי להפחית את המגבלות המעשיות של ספירה ידנית של מספר גדול של דוגמאות. עמידות במבחנים ימיים ארוכי טווח, על פי התקן הבריטי EN350-1:1994, מדורגים בהתייחס לפינוס סילבסטריס ^{סאפווד18}. בבדיקות המעבדה לטווח קצר המוצגות כאן, אנו משתמשים באורן הסקוטי (Pinus sylvestris L) סאפווד כפקד לבדיקת עץ הלב של המין אקקי (לופירה אלאטה בנקס לשעבר C.F Gaertn), אשור (Fagus sylvatica L), ערמון מתוק (קסטנה סאטיבה מיל) וטרפנטין (סינקרנפיה גלמוליפרה (Sm.) ניד). ייצור כדורים צואה ממוצע וחיוניות בקרב שמונה שכפולים לכל מינים עץ שימש כאינדיקטור לעמידות. אנו מספקים נתונים להמחשה שנאספו מהערכה טיפוסית, באמצעות מינים גריבל Limnoria quadripunctata ומגוון של מינים עץ עמידים באופן טבעי. Limnoria quadripunctata, שזוהתה על ידי המפתחות שסופקו על ידי מנזיס (1951), נבחרה כמין האופטימלי לניסויים בהתכלות בשל העובדה שהוא החבר הנחקר ביותר במשפחה והוא מבוסס היטב כמין מודל לשימוש בניסויים מתכלים. פרוטוקול זה ישים גם לבדיקת יערות של טיפולים שונים למרות הבקרה בשימוש צריך להיות שכפולים מטופלים של אותו מין.

Protocol

1. הכנת מקלות בדיקה

1. לאחר השלמת כל תהליכי הטיפול, חותכים עץ יבש למקלות בדיקה לגודל 2 מ"מ x 4 מ"מ x 20 מ"מ (איור 1). יובש באוויר נדבק למשקל קבוע, בתנאי מעבדה. השתמש לפחות 5 שכפולים של כל עץ נבדק.

איור 1: מקלות בדיקה המשמשים בבדיקות מעבדה לטווח קצר להערכת שיעורי האכלת גריבל.  מקלות עץ בדיקה בגודל 2 מ"מ x 4 מ"מ x 20 מ"מ. משמאל לימין: אקי, טרפנטין, ערמון מתוק ועץ לב אשור ואורן סאפווד סקוטי. סרגל קנה מידה 4 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

2. חדירת ואקום
   1. לאחר הכנת עץ (כלומר, חיתוך וטיפול, אם ישים), מניחים מקלות מתחת לרשת במיכל פלסטיק בטוח למזון, בתוך חיטוי הוואקום ומחליפים את המכסה ומבטיחים שיש חותם הדוק, המתאפשר על ידי ציפוי של שומן ואקום (איור 2).
   2. חברו שסתום משולש בין הצינור המחבר בין התסדן למשאבה, עם צינור שלישי המוביל לאוויר הפתוח (איור 2). ודא כי שסתום משולש סגור לאוויר ולהפעיל את המשאבה כדי להשיג ואקום של -0.75-1.0 בר בתוך חיטוי ואקום להחזיק את הוואקום הזה במשך 45 דקות - 1 שעה.
   3. שקוע בקצה הפתוח של הצינור השלישי לתוך מיכל של מי ים. לכבות את המשאבה ולסגור את השסתום המוביל למשאבה, ולאחר מכן לאט לפתוח את השסתום עד מי הים נמשך על ידי הוואקום לתוך התבשר. אפשר למים לזרום עד שהוא ממלא את מיכל הפלסטיק, מעל לרמת הרשת.
   4. לאחר מכן הסיג את הצינור ממי הים במיכל, ומאפשר לאוויר להיכנס, עד שהמתשן יחזור ללחץ אטמוספרי. שומרים את המקלות שקועים מתחת לרשת עד שהם שוקעים לתחתית מיכל הפלסטיק.

איור 2: ציוד המשמש לשאוב מקלות עץ מפזרים במי ים, כהכנה להאכלה לגריבלים במהלך בדיקת מעבדה.  A) חיטוי ואקום; ב) משאבה; ג) מד לחץ עבור חיטוי ואקום; ד) השסתום המשולש המוביל לחיטוי ואקום, משאבה ולאוויר הפתוח או מי ים (צינור כתום). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

3. עץ שטיפה
   1. שקועים במקלות בדיקה רוויים במי ים במי ים הכלולים בצינורות 50 מ"ל (איור 3). החלף מים באופן קבוע לתקופה של 20 יום.
      הערה: תהליך השטיפה חל על כל עץ ניסיוני בבדיקה, כולל יער מטופל או טבעי.

איור 3: שטיפה ממקלות עץ להכנה להאכלה לגריבלים במהלך מעבדה.  עץ שהיה שקוע לחלוטין במי ים הכלולים בצינור פלקון 50 מ"ל, עם החלפת מים רגילה (1-3 ימים), המיוצר ליטוש בצבעים מובהקים. משמאל לימין שטיפה מעץ הלב של; ערמון מתוק, טרפנטין, אקי, ואשור ואורן ספוטים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

2. חילוץ גריבל

1. לחלץ דגימות בודדות של גריבל מבלוק עץ שורץ. השתמש בזוג מלקחיים עדינים ובמברשת צבע דקה (בגודל 000/0.4 מ"מ או קטנה יותר). בזהירות לקלף בחזרה כל עץ שמכסה את מחילה gribble עם המלקחיים
   הערה: מחילות נמצאות על פני העץ וניתן לזהותן באמצעות חורים קטנים (איור 4).
2. לאחר חשיפת הגריבל, השתמשו במכחול כדי לאסוף בעדינות אנשים מלמטה ולהפקיד בצלחת פטרי מלאה במי ים. בדוק גריבל תחת מיקרוסקופ כדי לזהות מינים כדי לוודא שלא נגרם נזק בעת החילוץ.
   הערה: להכות pleopods הם סימן של חיוניות.
   1. יש להשליך את כל הנקבות המהורהרות ביצים כמו נקבות gravid יש יכולת האכלה מופחתת.

איור 4: תמונה של מחילה עם שני חורי אוורור טיפוסיים. ל. קוואדריפונקטה מחפרת על מקל עץ אורן רדיה, בגודל 2 מ"מ x 4 מ"מ x 20 מ"מ. שני חורי אוורור קטנים יותר ניתן לראות ליד הכניסה המחילה. סרגל קנה מידה 2 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.  

3. זיהוי לימנוריה קוואדריפונקטה
   1. זהה את לימנוריה קוואדריפונקטה מתחת לסטריאומיקוסקופ על ידי ארבעת הצינורות הייחודיים, המסודרים בתבנית מרובעת, על הפלוטלסון של החיה בנוסף לקרינה בצורת X בפלוניט ^{החמישי19} (איור 5).

איור 5: תכונות זיהוי קוואדריפונקטה של לימנוריה .  תמונה של משטח הגב לימנוריה quadripunctata, נלקח על סטריאומיקוסקופ בהגדלה x20. זיהוי תכונות המוצגות על ידי חץ אדום - מציין את קרינה בצורת X וחץ כחול - מציין ארבעה צינורות על pleotelson. סרגל קנה מידה 1 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

3. הכנת צלחות היטב

1. בלוחות מרובי בארות בקוטר 20 מ"מ, הניחו מקל בדיקה אחד ו-5 מ"ל של מי ים לא מסוננים, בין 32-35 PSU, לבאר (איור 6).
2. מניחים טיפולים / מינים של עץ באופן שיטתי לאורך צלחת הבאר, כך שכל סוג של עץ מיוצג לפחות פעם אחת לכל צלחת. הוסף גריבל אחד לכל באר.
   הערה: הטמפרטורה צריכה להישמר יציבה באינקובטור ב 20 °C (50 °F) ± 2 °C (50 °F) עבור המין L. quadripunctata, מינים אחרים של לימנוריה ניתן להשתמש עם התאמות לטמפרטורה שנעשו כדי להתאים את המינים הספציפיים.
3. שמור צלחות בתנאים כהים קבועים כמו photoperiod אין השפעה על שיעור האכלת ^גריבל15.

איור 6: מערך ניסיוני לבדיקת האכלה.  דוגמה ל-12 לוחות רב-באריים המשמשים בבדיקות המעבדה של שיעור האכלת הגריבל. כל באר מכילה 5 מ"ל מי ים ומקל בדיקה אחד (20 מ"מ x 4 מ"מ x 2 מ"מ) של מינים שונים של עץ; סקוטי פיין סאפווד ואקי, אשור, ערמון מתוק, ועץ לב טרפנטין. סרגל קנה מידה 20 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

4. איסוף וספירת כדורי צואה והערכה של חיוניות.

1. פעמיים בשבוע, להסיר את מקל הבדיקה וכל gribble (אחד לכל באר) מן צלחת הבאר ומניחים לתוך צלחת טובה מוכן מראש טרי (המכיל 5 מ"ל של מי ים לבאר [32-35 PSU, 18-22 °C (5 °F).
2. השתמש במכחול כדי לצחצח בעדינות את כל כדורי צואה מהמקל לפני ההעברה ולשמור על כדורי צואה בתוך הבאר המקורית.
   הערה: לפני העברת הגריבל לצלחת באר טרייה, ניתן להעריך חיוניות בסולם של 1-5; 1= מת, 2 = פסיבי, לא על העץ, 3 = שוחה באופן פעיל או מכה pleopods, לא על העץ, 4 = זוחל על פני השטח של העץ, 5 = התחפר לתוך העץ.
3. עיבוד תמונה
   1. השתמש במכחול עדין כדי להפריד בין כל גושים, כך גלולים בודדים נראים ומבריש כדורי הרחק מן הקצוות מאוד של הבאר. צלמו תמונה מפורטת תחת מיקרוסקופ סטריאו, בהגדלת x4 והעלו למחשב (איור 7).
      הערה: ודא שהכדורים נמצאים בפוקוס והרקע אחיד, ללא צללים או השתקפויות אור על פני המים.

איור 7: תמונה של כדורי צואה. ל. כדורי צואה quadripunctata (כדורים קטנים, גליליים, חומים) מהאכלה על עץ אורן רדיה בבאר אחת של צלחת רבת באר. צולם בהגדלת x4. תמונות לפני מניפולציה לניתוח תמונה (ראו איור 7). A) דוגמה לתמונה מתאימה לשימוש לספירה אוטומטית ב- ImageJ. כדוריות מפוזרות מספיק החוצה והרחק משולי הבאר. הבאר מרוכזת ואין מכשולים או השתקפויות. ב) דוגמה לתמונה שאינה מתאימה לניתוח תמונה. הבאר היא מחוץ למרכז, חיתוך החצי התחתון. עיגול כחול (מנוקד) מראה השתקפות אור מפני המים. עיגול כתום (מוצק) מראה כדורי מגובאות קרוב מדי זו לזו וקרובות מדי לקצה הבאר. עיגול אדום (מקווקו) מציג שבב עץ שלא הוסר. סרגל קנה מידה 10 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.  

2. תהליך ליצירת ספירת כדורי צואה באמצעות ImageJ.
   1. הורד את ImageJ (הגירסה העדכנית ביותר נכון ל- 03/08/21, 1.8.0_172) https://imagej.nih.gov/ij/download.html או הפעלה מדפדפן המחשב.
   2. העלה ערימת תמונות על-ידי גרירה ושחרור או על-ידי בחירת קובץ | יבא | | רצף תמונות עיון. אל תשנה פרמטרים ולאחר מכן בחר אישור.
   3. לאחר מכן, השתמש בכלי העיגול כדי לבחור את החלק התחתון של הבאר המכילה את כדורי הצואה. הסר את קצות הבאר, בחר ערוך | תפנה בחוץ. הפוך את התמונה לבינארית ובחר תהליך | הפוך בינארי.
   4. כייל על-ידי בחירת ניתוח | קבע קנה מידה ובחר את מספר הפיקסלים למילימטר עבור התמונה (לדוגמה 10 פיקסלים = 1 מ"מ). ספרו את הכדורים, בחרו 'ניתוח | ניתח חלקיקים.
   5. בתיבה לצד גודל (^יחידה2), בחר סף נמוך יותר זהה לכדור בגודל הקטן ביותר, באמצעות סולם היחידה שהוגדר קודם לכן (לדוגמה, אם 10 פיקסלים = 1 מ"מ והכדור הקטן ביותר הוא 0.5 מ"מ, בחר 5 אינסוף).
   6. בתיבה הנפתחת הצג , בחר קווי מתאר ולאחר מכן סמן סיכום ולחץ על אישור (איור 8).
      הערה: מידע נוסף ניתן למצוא https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/index.html

איור 8: דיאגרמת זרימה של התהליך המשמש ב- ImageJ לספירת כדורי צואה.  A) ייבוא רצף תמונות בכרטיסיה 'קובץ' של ImageJ. ב) לחצן העיון בתיבת הדו-שיח 'ייבוא רצף תמונות' כדי לייבא רצף תמונות מהתקן מקומי. ג) שימוש בכלי העיגול לבחירת אזור המכיל כדורי צואה D) נקה את הלחצן החיצוני באזור כרטיסיית העריכה כדי להסירו מחוץ לאזור שנבחר. ה) הפוך לחצן בינארי בכרטיסיית התהליך. ו) הגדר לחצן קנה מידה בכרטיסיה ניתוח. המרחק בפיקסלים שווה למספר הפיקסלים ליחידת מידה אחת (מ"מ). ז) לחצן ניתוח חלקיקים בכרטיסיה ניתוח. גודל (יחידה^2) מוגדר לסף התחתון של גודל גלולה צואה, בפיקסלים, לאינסוף. האפשרות 'חלוקה לרמות' ו'סיכום' נבחרו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

4. ניתוח נתונים
   1. להמיר ספירת גלולה לכדורים ליום, אשר נותן מידה עקיפה של קצב האכלה. יש למחוק נתונים מכל אדם נוצץ בימים שבהם אירעה ההשתמטות (איור 9).
      הערה: Moulting מתרחשת מעל 1-3 ימים וניתן לזהות כאשר moult מלא של השד החיצוני ניתן לראות.

איור 9: דוגמה לגריבל מול.  גריבל (L. quadripunctata) moulting, על מקל מבחן עץ אורן רדיה בגודל 20 מ"מ x 4 מ"מ x 2 מ"מ. מולים מסומנים על ידי עיגולים אדומים. סרגל קנה מידה 2 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

תוצאות

ניסוי האכלה של ל. quadripunctata נערך במשך 20 ימים, תוך שימוש בחמישה סוגי עץ שונים (פינוס סילבסטריס L) סאפאווד, ועץ לב של אשור (Fagus sylvatica L), אקקי (לופירה אלטה בנקס לשעבר C. F Gaertn), ערמון מתוק (Castanea sativa Mil), וטרפנטין (סינקרנפיה גלמוליפרה (Sm.) Neid)) (ראה שולחן חומרים), ב?...

Discussion

לפני בחירת דגימות גריבל לשימוש בניסוי האכלה, אנשים צריכים להיות מוקרנים כדי להעריך את התאמתם. יכולה להיות שונות מסוימת בשיעור ההאכלה בין אנשים בשל הבדלים בגודל, ולכן יש לבחור רק דגימות בוגרות בוגרות. אין הבדל משמעותי בין שיעור האכלה של אנשים בין 1.5 מ"מ ו 3 מ"מ אורך זוהה על ידי בורחס ואח ',

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-well cell culture plates	ThermoFisher Scientific	150200
50ml Falcon tubes	Fisher Scientific	14-432-22
Adjustable volume pipette	Fisher Scientific	FBE10000	1-10 ml
Beech	G. Sawyer (consultant in timber technology)	Fagus sylvatica	Taxonomic authority: L
Ekki	G. Sawyer (consultant in timber technology)	Lophira alata	Taxonomic authority: Banks ex C. F. Gaertn.
Forceps	Fisher Scientific	10098140
Incubator	LMS LTD	INC5009
Microporous specimen capsules	Electron Microscopy Sciences	70187-20
Petri dish	Fisher Scientific	FB0875713
Scots Pine	G. Sawyer (consultant in timber technology)	Pinus sylvestris	Taxonomic authority: L.
Size 00000 paintbrush	Hobby Craft	5674331001	Size 000 or 0000 also acceptable
Sweet Chestnut	G. Sawyer (consultant in timber technology)	Castanea sativa	Taxonomic authority: Mill
Turpentine	P. Evans (Professor, Dept. Wood Science, University of British Columbia)	Syncarpia glomulifera	Taxonomic authority: (Sm.) Nied.
Vacuum desiccator	Fisher Scientific	15544635