海洋木材ボーリング甲殻類による生分解に対する木材の耐性の迅速な試験

要約

このプロトコルは、孔子のペレットの生産を測定することにより、木材ボーリング甲殻類 、リムノリアの供給速度を評価するための方法を提示します。この方法は非専門の実験室で使用するために設計され、海洋条件の下で高められた木製の耐久性を評価するために標準的なテストの議定書に組み込まれる可能性がある。

要約

木材ボーリング無脊椎動物は、海洋木材や木製の沿岸インフラを急速に破壊し、毎年世界中で数十億ドルの損害を引き起こしています。クレオソートやクロマ加工銅アルセニオン(CCA)などの広いスペクトル殺生物剤を含む木材の処理は、現在、法律によって海洋使用に制限されているので、自然に耐久性のある木材種と木材の新しい保存方法が必要です。これらの方法は、海洋ボーラー、EN 275に対して木材防腐剤をテストするための欧州規格などの規制基準を満たすためにテストを受けます。耐久性のある木材種または木材防腐剤治療の最初の調査は、実験室試験を通じて迅速かつ安価に達成することができ、これは通常高価で長期的な努力である海洋界試験よりも多くの利点を提供する。 リムノリア (グリブル)の多くの種は、海洋木材ボーリング甲殻類です。 リムノリア は、水房で飼育する実用性と木材の供給率の測定の容易さのために、海洋木材ボーラーによる木材の生分解の実験室試験に使用するのに理想的です。ここでは、グリブルを用いて木材の生分解を評価するための標準化可能な実験室試験を概説する。

概要

木のボーラーは、海の防衛、桟橋、養殖構造物などの海洋の木造構造物に大きな被害を与える可能性があります。交換または復元は、世界中で年間数十億ドルの費用がかかります^1,2,3。これらの構造を保護するために、木材は、多くの場合、生分解を減らすために処理されます。しかし、オーストラリア、EU、英国、米国における広域生物生物剤の使用制限により、海洋環境において、ボーラーに自然に耐える新しい改変技術および木材の種が^4,5,6,7の後に求められています。海洋環境における木材の保存のための新しい技術は、規制基準を満たし、化学防腐剤の浸出などの危険から環境への影響を制限するために徹底的なテストを必要とします。例えば、1992年から現在の欧州標準である欧州規格EN 275は、海洋木材ボーラー損傷に対する木材保存処理を評価するために使用^{されます8,9}。この基準は、^CCA4、5,6,7およびクレオソーテ¹⁰のような殺生物化合物の使用に反対する他の法律と共に、持続可能で無毒な木材保護法と、生死的治療に代わる自然に耐久性のある木材種の使用を必要とします^11,12.EN 275で指定された海洋試験は、長時間露光期間を必要とするため、高価で、有意義な結果を得るのに時間がかかります。しかし、実験室試験は、海洋木材ボーラー攻撃に対して木材製品を保存する試験方法にはるかに迅速な代替手段を提供し、治療スケジュールの調整の迅速な評価を可能に^する13。この急速な実験室の実験からの結果は木の新しい修正プロセスを知らせ、ボーラー損傷に自然な耐久性を有する材木種を識別するように設計されている。低い供給率と活力は潜在的な製品の抵抗の増加を示し、この情報は、設計を改善できるように業界パートナーにフィードバックすることができます。我々の方法は、産業で望ましい迅速かつ迅速な対応を可能にし、有望な製品が同定されると、結果は海洋試験からそれらを補完することができる。

グリブル(リムノリア)は、リムノリダイ科のイソポッド甲殻類の属です。世界には60種以上のリムノリア^13,14,15種があり、英国、リムノリア・ニチノウム、リムノリア・トリプンクタータ、 リムノリア・クワッドリプンクタータ¹⁶で3種の一般的な種が見られます。彼らは海水に沈んだ木材の表面にトンネルを掘り起こし、しばしば経済的に大きな被害を引き起こしました。グリブルは、沿岸英国の海域に非常に豊富であり、実験室の条件下で維持することが容易であり、海洋木材ボーリング無脊椎動物による木材の生分解の研究に理想的な生物です。異なる木材種および木材保存方法におけるグリブルの摂食率と活力を評価することで、生分解に対する耐性の有効性を決定することができます。次のプロトコルは、ボルジェスと同僚^12,17によって記述されたから開発されたグリブル給餌率を測定するための標準的な方法を定め、非専門ラボでプロセスを操作可能にする画像分析の導入を合理化する。画像解析は、多数のサンプルを手動でカウントする際の現実的な制限を減らすためにも使用されます。英国規格EN350-1:1994によると、長期海洋試験における耐久性は、ピヌスシルヴェストリス^sapwood18を参照して採点されています。ここで発表された短期検査では、スコットランドの松(ピヌス・シルヴェストリスL)樹液樹木を対照として、種ekki(ロピラ・アラタ・バンクスex C.Fガートン)、ブナ(ファガス・シルバティカL)、甘い栗(カスタネア・サティバ・ミル)、ターペンタイン(シンパルペア・グロムロ・ミル)を使用します。木材種当たり8つの複製物の平均フェーカルペレット産生と活力は、耐久性の指標として使用された。我々は、グリブル種リムノリア四肢麻痺者と自然に耐久性のある木材種の範囲を使用して、典型的な評価から収集された例示的なデータを提供する。メンジーズ(1951)が提供する鍵によって同定されたリムノリア四重RIPUNCATAは、家族の中で最もよく研究されたメンバーであり、生分解試験で使用するためのモデル種として確立されているため、生分解試験に最適な種に選ばれた。このプロトコルは、使用されるコントロールは、同じ種の未処理の複製であるべきであるが、異なる治療の森をテストするためにも適用されます。

プロトコル

1. テストスティックの準備

1. 処理プロセスが完了したら、ドライウッドをテストスティックにカットして、サイズ2 mm x 4 mm x 20 mmにします(図1)。空気乾燥は実験室の条件の下で、一定の重量に付く。テストされている各木材の少なくとも5つの複製を使用してください。

図1:グリブル給餌率を評価するために短期の実験室試験で使用される試験棒。 テスト木製スティックサイズ2ミリメートル×4ミリメートル×20ミリメートル。左から、エコーキ、ターペンタイン、甘い栗とブナのハートウッドとスコットランドの松の樹液。スケールバー 4 mm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

2. 真空含浸
   1. ポストウッド調製(すなわち、必要に応じて切断および処理)、食品安全なプラスチック容器のメッシュの下にスティックを置き、真空デシケータの内側に置き、蓋を交換して密閉シールがあることを確認し、真空グリースのコーティングによって促進する(図2)。
   2. デシケータとポンプをつなぐチューブの間に3方向バルブを取り付け、3つ目のチューブを開いた空気に導きます(図2)。3ウェイバルブが空気に閉じられていることを確認し、真空デシケータ内の-0.75〜-1.0バーの真空を達成するためにポンプを実行し、この真空を45分間保持します。
   3. 第3のチューブの開いた端を海水の容器に沈めます。ポンプをオフにしてポンプに通じるバルブを閉じ、真空によって海水がデシケータに引き込まれるまでゆっくりとバルブを開きます。水がプラスチック容器を満たすまで、メッシュのレベルを上回るまで流れるようにします。
   4. その後、コンテナ内の海水からチューブを引き出し、デシケーターが大気圧に戻るまで空気が入ります。スティックがプラスチック容器の底に沈むまで、メッシュの下に沈んだままにします。

図2:実験室給餌アッセイ中にグリブルに給餌するための準備として、木材スティックを海水と吸入するために使用される装置。 A) 真空デシケーター;B)ポンプ;C)真空デシケーター用圧力計;D)真空デシケーター、ポンプ、および開いた空気または海水(オレンジチューブ)につながる三方弁。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

3. リーチングウッド
   1. 50mLチューブに含まれる海水中の海水飽和試験棒を水没(図3)。20日間の期間、水を定期的に交換してください。
      注:浸出プロセスは、処理された木材や自然林を含む試験中の実験木材に適用されます。

図3:実験室給餌アッセイ中にグリブルに供給するための準備のための木の棒からの浸出物。 50mlファルコンチューブに含まれる海水中に完全に沈められた木材は、定期的な水の変化(1〜3日間)で、明らかに着色された浸出液を作り出した。左から右に心臓の木から浸出します。甘い栗、ターペンタイン、エキ、ブナとスコットランドの松の樹液。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

2. グリブルの抽出

1. はびこる木のブロックからグリブルの個々の標本を抽出する。細い鉗子と薄い(サイズ000/0.4 mm以下)の絵筆を使用してください。慎重に鉗子でグリブル巣穴を覆っている任意の木材を剥がします
   注:バローズは木の表面に見られ、小さな穴で識別することができます(図4)。
2. グリブルが露出したら、ペイントブラシを使用して、下から優しく個人を拾い上げ、海水で満たされたシャーレに堆積させます。顕微鏡下でグリブルをチェックして種を特定し、抽出中に損傷が発生していないことを確認します。
   注:プレオポッドを打つことは活力の兆候です。
   1. グラビドメスは摂食能力が低下しているので、卵を吹き飛ばすメスを捨てます。

図4:2つの典型的な換気穴を有するバリブル巣穴の画像。  L.ラディアタ松材の棒の四肢穿 刺は 、2ミリメートル×4ミリメートル×20ミリメートルのサイズ。巣穴の入り口の隣に2つの小さな換気穴が見えます。スケールバー 2 mm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

3. リムノリア四肢麻痺の識別
   1. 5番目のプレオニテ¹⁹のX字型カリナに加えて、四角いパターンで配置された4つの異なる結核によって、立体顕微鏡下でリムノリア四肢穿刺を識別します(図5)。

図 5: リムノリア四重 RIPUNCATA 識別機能 x20倍率で実体顕微鏡で撮影した下面 リムノリア四重RIPATA の画像。赤い矢印で示される特徴を識別する - X字型のカリナと青い矢印を示す - プレオテルソン上の4つの結節を示す。スケールバー 1 mm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

3. ウェルプレートの準備

1. 直径20mmのウェルを備えたマルチウェルプレートでは、1本の試験棒と5mLの未濾過海水を、32~35 PSUの間、井戸ごとに配置します(図6)。
2. 各タイプの木材がプレートごとに少なくとも1回表されるように、ウェルプレート全体に体系的に木材の処理/種を配置します。井戸ごとに1つのグリブルを追加します。
   注:温度は、20 °Cで20 °C±2 °Cで、種Lのために安定に保たれるべきです。 四肢穿刺は、リムノリアの他の種は、特定の種に合わせて作られた温度の調整と使用することができる。
3. 光周期は、グリブルの供給率¹⁵に影響を与えないので、一定の暗い条件でプレートを保ちます。

図6:グリブル給餌アッセイ用に設定した実験。 グリブル給餌率の実験室試験で使用される12のマルチウェルプレートの例。各井戸は、5 ml の海水と 1 つのテストスティック (20 mm x 4 mm x 2 mm) 異なる木材の種類が含まれています。スコットランドパインサップウッドとエコー、ブナ、甘い栗、ターペンタインハートウッド。スケールバー20 mm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

4. フェカルペレットの収集とカウントと活力の評価

1. 週に2回、テストスティックと各グリブル(ウェルあたり1つ)をウェルプレートから取り出し、準備した新しいウェルプレート(井戸あたり5mLの海水を含む[32-35 PSU、18-22°C])に入れます。
2. ペイントブラシを使用して、スティックから任意の便ペレットを穏やかに払いのってから、元の井戸内のフェーカルペレットを保持します。
   注:新鮮なウェルプレートにグリブルを転送する前に、活力は1-5のスケールで評価することができます。1=死んだ、2=受動的、木材上にない、3=積極的に泳ぐか、または叩くプレオポッド、木材上ではなく、4 =木材の表面に這う、5 =木材に埋め込む。
3. 画像処理
   1. 細かいペイントブラシを使用して、個々のペレットが見えるように塊を分離し、井戸の端からペレットをブラシで取り除きます。ステレオ顕微鏡で詳細な写真を撮り、拡大率x4でコンピュータにアップロードします(図7)。
      注: ペレットがフォーカスされ、背景が均一で、水面に影や光の反射がないことを確認します。

図7:グリブル・フェーカルペレットの画像。  L.マルチウェルプレートの1つの井戸でラディアタ松の木に餌を与えることから 四肢穿刺フェ ーカルペレット(小さな、円筒形、茶色のペレット)x4倍率で撮影。画像解析の操作前の画像( 図7参照)。A) ImageJでの自動カウントに使用する適切な画像の例。ペレットは十分に広がり、井戸の端から離れています。井戸は中心にあり、障害物や反射はありません。B) 画像解析に適さない画像の例。井戸はオフセンターで、下半分を切り落とします。青い(点線の)円は、水面から光反射を示します。オレンジ(実線)の円は、あまりにも密接に束ねられ、井戸の端に近すぎるペレットを示しています。赤(破線)の円は、取り外されなかった木材チップを示しています。スケールバー 10 mm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

2. ImageJを使用してフェーカルペレット数を生成するプロセス。
   1. https://imagej.nih.gov/ij/download.html から ImageJ (最新バージョンの 03/08/21、 1.8.0_172) をダウンロードするか、コンピュータのブラウザから実行します。
   2. ドラッグ アンド ドロップまたは [ファイル] |を選択して、画像のスタック をアップロードします。インポート |画像シーケンス|参照します。パラメータを変更せず、[ 問題ありません] を選択します。
   3. 次に、円ツールを使用して、フェーカルペレットを含むウェルの下部セクションを選択します。ウェル エッジを削除し、[ 編集]|外をクリアします。イメージをバイナリにする場合は、[ 処理] |バイナリを作成します。
   4. [分析]|を選択して調整 するスケールを設定 し、画像のミリメートルあたりのピクセル数を選択します(例: 10 ピクセル = 1 mm)。ペレットを数え、[ 分析|パーティクルを分析します。
   5. [サイズ (単位 ²)] の横にあるボックスで、最小サイズのペレットと同じ下限のしきい値を選択し、先ほど設定した単位スケールを使用します(たとえば、10 ピクセル = 1 mm、最小ペレットが 0.5 mm の場合は、5-無限大を選択します)。
   6. [ 表示 ] ドロップダウン ボックスで 、[ アウトライン ] を選択し、[ 概要] にチェックマークを付け、[ 問題] をクリックします (図 8)。
      注: 詳細については、https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/index.html

図8:フェーカルペレットをカウントするためにImageJで使用されるプロセスのフロー図。 A) ImageJ の [ファイル] タブでイメージ シーケンスを読み込みます。B) [イメージ シーケンスのインポート] ダイアログ ボックスの参照ボタンをクリックして、ローカル デバイスからイメージのシーケンスをインポートします。C) 円ツールを使用して、フェカルペレットを含む領域を選択する D) 編集タブ領域の外側ボタンをクリアして、選択した領域の外側を削除します。E) プロセスタブでバイナリボタンを作成します。距離 (ピクセル単位) は、1 単位の測定単位 (mm) までのピクセル数に相当します。G) [解析]タブの[パーティクルを解析]ボタン。サイズ (単位 ^2) を、フェーカルペレットサイズの下限しきい値 (ピクセル単位) に設定し、無限大に設定します。「アウトライン」と「要約」を表示するが選択されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

4. データ分析
   1. ペレット数を1日あたりのペレットに変換し、供給速度の間接的な測定を行います。モールティングが発生した日に、すべてのモールティング個人からのデータを破棄します(図9)。
      注:モールティングは1〜3日にわたって発生し、外骨格の完全なモールトが見えるときに識別することができます。

図9:グリブルモールトの例。 グリブル(L. 四肢穿刺) モールティング、ラディアタ松の木のテストスティックサイズ20ミリメートル×4ミリメートルx 2ミリメートル。モールトは赤い円で示されます。スケールバー 2 mm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

結果

Lの摂食実験。 四肢穿刺は20日にわたって行われました。 5つの異なる木材タイプ(スコットランドの松(ピヌスシルヴェストリスL)樹液樹木、ブナのハートウッド(ファガスシルバティカL)、エクキ(ロピラアラタバンクスex C.Fガートン)、甘い栗(カスタネアサティバミル)、ターペンタイン(シンサーペアグロムライフラ(Sm.)ニード)を使用して、11月20日...

ディスカッション

摂食実験で使用するグリブル標本を選択する前に、個人は適合性を評価するためにスクリーニングされるべきである。サイズの違いにより、個体間の摂食率に多少のばらつきが生じ得るので、完全に成長した成体検体のみを選択する必要があります。200917年、ボルジェスら1.5mmと3mmの長さの間の個人の供給速度に有意な差は検出されなかった。女性のリムノリアは卵?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-well cell culture plates	ThermoFisher Scientific	150200
50ml Falcon tubes	Fisher Scientific	14-432-22
Adjustable volume pipette	Fisher Scientific	FBE10000	1-10 ml
Beech	G. Sawyer (consultant in timber technology)	Fagus sylvatica	Taxonomic authority: L
Ekki	G. Sawyer (consultant in timber technology)	Lophira alata	Taxonomic authority: Banks ex C. F. Gaertn.
Forceps	Fisher Scientific	10098140
Incubator	LMS LTD	INC5009
Microporous specimen capsules	Electron Microscopy Sciences	70187-20
Petri dish	Fisher Scientific	FB0875713
Scots Pine	G. Sawyer (consultant in timber technology)	Pinus sylvestris	Taxonomic authority: L.
Size 00000 paintbrush	Hobby Craft	5674331001	Size 000 or 0000 also acceptable
Sweet Chestnut	G. Sawyer (consultant in timber technology)	Castanea sativa	Taxonomic authority: Mill
Turpentine	P. Evans (Professor, Dept. Wood Science, University of British Columbia)	Syncarpia glomulifera	Taxonomic authority: (Sm.) Nied.
Vacuum desiccator	Fisher Scientific	15544635