Deniz Ahşap-Sıkıcı Kabuklular Tarafından Kerestenin Biyobozunurluk Direncinin Hızlı Test Edilmesi

Özet

Bu protokol, dışkı pelet üretimini ölçerek odun sıkıcı kabuklu Limnoria'nın beslenme oranını değerlendirmek için bir yöntem sunar. Bu yöntem uzman olmayan laboratuvarlarda kullanılmak üzere tasarlanmıştır ve deniz koşullarında gelişmiş ahşap dayanıklılığını değerlendirmek için standart test protokollerine dahil olma potansiyeline sahiptir.

Özet

Odun sıkıcı omurgasızlar, deniz kerestelerini ve ahşap kıyı altyapısını hızla yok ederek her yıl dünya çapında milyarlarca dolarlık hasara neden oluyor. Creosote ve kromlu bakır arsenat (CCA) gibi geniş spektrumlu biyositlere sahip ahşabın tedavileri artık mevzuat tarafından deniz kullanımında kısıtlandığı için, doğal olarak dayanıklı kereste türleri ve ahşabın yeni koruma yöntemleri gereklidir. Bu yöntemler, ahşap koruyucuların deniz borerlerine karşı test etmek için Avrupa standardı olan EN 275 gibi düzenleyici standartları karşılamak için testlerden geçer. Dayanıklı kereste türlerinin veya ahşap koruyucu tedavilerin ilk araştırması, tipik olarak maliyetli, uzun vadeli çabalar olan deniz sahası denemelerine göre birçok avantaj sunan laboratuvar testleri ile hızlı ve ucuz bir şekilde elde edilebilir. Birçok Limnoria türü (gribble) deniz odunu sıkıcı kabuklulardır. Limnoria , deniz odun borerleri tarafından ahşabın biyobozunurluğunun laboratuvar testlerinde, kovalarda yetiştirilmesinin pratikliği ve odundaki beslenme oranlarını ölçme kolaylığı nedeniyle kullanım için idealdir. Burada, kumlama kullanarak ahşap biyobozunurluğunu değerlendirmek için standart bir laboratuvar testi özetliyoruz.

Giriş

Ahşap borerler deniz savunması, iskeleler ve su ürünleri yapıları gibi deniz ahşap yapılarına büyük zarar verebilir; dünya çapında yılda milyarlarca dolara mal olan değiştirme veya restorasyon1,2,3. Bu yapıları korumak için, kereste genellikle biyobozunurluğunu azaltmak için tedavi edilir. Bununla birlikte, Avustralya, AB, İngiltere ve ABD'de geniş spektrumlu biyositlerin deniz ortamında kullanımının kısıtlanması nedeniyle, borerlere doğal olarak dayanıklı olan yeni modifikasyon teknikleri ve ahşap türleri ^4,5,6,7'den sonra aranmaktadır. Deniz ortamında ahşabın korunmasına yönelik yeni teknikler, düzenleyici standartları karşılamak ve herhangi bir kimyasal koruyucunun sızması gibi tehlikelerden kaynaklanan çevresel etkileri sınırlamak için kapsamlı testler gerektirir. Örneğin, 1992'den kalma mevcut Avrupa standardı olan EN 275, deniz odun-borer hasarına karşı ahşap koruma tedavilerini değerlendirmek için ^{kullanılır8,9}. Bu standart, CCA4,5,6,7 ve creosote10 gibi biyosidal bileşiklerin kullanımına karşı diğer mevzuatlarla birlikte, sürdürülebilir, toksik olmayan ahşap koruma yöntemlerini ve biyosidal tedavilerin yerini almak için doğal olarak dayanıklı kereste türlerinin kullanılmasını ^{gerektirir11,12} . EN 275'te belirtilenler gibi deniz denemeleri uzun pozlama süreleri gerektirir ve bu nedenle anlamlı sonuçlar vermek için pahalı ve yavaştır. Bununla birlikte, laboratuvar testleri, kereste ürünlerini deniz odun-borer saldırısına karşı koruma test yöntemlerine çok daha hızlı bir alternatif sunarak, tedavi programlarındaki ayarlamaların hızlı bir şekilde değerlendirilmesini ^sağlar13. Bu hızlı laboratuvar deneyinden elde edilen sonuçlar, ahşabın yeni modifikasyon süreçlerini bilgilendirmek ve doğal dayanıklılığı olan kereste türlerini borer hasarına belirlemek için tasarlanmıştır. Düşük bir beslenme oranı ve canlılık, potansiyel ürünlerde direncin arttığını gösterebilir ve bu bilgiler daha sonra tasarımları geliştirmelerine izin vermek için endüstri ortaklarına geri beslenebilir. Yöntemimiz, endüstride istenen çevik ve hızlı bir yanıt sağlar ve umut verici ürünler belirlendikten sonra, sonuçlar deniz denemelerinden elde edilenlerle desteklenebilir.

Gribbles (Limnoria), Limnoriidae familyasında bulunan bir izopod kabuklu cinsidir. İngiltere'de Limnoria lignorum, Limnoria tripunctata ve Limnoria quadripunctata16 olmak üzere üç yaygın tür bulunan dünya çapında ^13.14.15 Limnoria türü vardır. Deniz suyuna batırılmış ahşap yüzeyinde tüneller açtılar ve genellikle ekonomik olarak önemli hasara neden oldular. Gribbles kıyı İngiltere sularında oldukça boldur ve laboratuvar koşullarında bakımı kolaydır, bu da onları deniz odunu sıkıcı omurgasızlar tarafından ahşap biyobozunurluğunun incelenmesi için ideal organizmalar haline getirir. Gribbles'ın beslenme oranlarını ve canlılığını farklı kereste türleri ve ahşap koruma yöntemleri üzerinde değerlendirmek, biyobozunurluğa karşı dirençlerinin etkinliğini belirleyebilir. Aşağıdaki protokol, Borges ve meslektaşları tarafından açıklanandan geliştirilen gribble besleme oranlarını ölçmek için standart bir yöntem belirlemeye ^başlar12,17, ayrıca süreci uzman olmayan laboratuvarlarda çalıştırılamaz hale getirmek için görüntü analizinin başlatılmasını kolaylaştırır. Görüntü analizi, çok sayıda numunenin manuel olarak sayılmasının pratik sınırlamalarını azaltmak için de kullanılır. İngiliz EN350-1:1994 standardına göre uzun süreli deniz testlerinde dayanıklılık, Pinus sylvestris ^sapwood18'e atıfta bulunularak derecelendirilmektedir. Burada sunulan kısa süreli laboratuvar testinde, ekki (Lophira alata Banks ex C.F Gaertn), kayın (Fagus sylvatica L), tatlı kestane (Castanea sativa Mill) ve terebentin (Syncarpia glomulifera (Sm.) Nied) türlerinin kalp odunlarını test etmek için kontrol olarak İskoç çamı (Pinus sylvestris L) sapwood'u kullanıyoruz. Ortalama faekal pelet üretimi ve ahşap türleri başına sekiz kopya arasında canlılık dayanıklılığın bir göstergesi olarak kullanılmıştır. Limnoria quadripunctata gribble türleri ve doğal olarak dayanıklı kereste türleri kullanarak tipik bir değerlendirmeden toplanan açıklayıcı veriler sunuyoruz. Menzies (1951) tarafından sağlanan anahtarlar tarafından tanımlanan Limnoria quadripunctata, ailenin en iyi çalışılmış üyesi olması ve biyobozunurluk denemelerinde kullanılmak üzere bir model tür olarak iyi kurulmuş olması nedeniyle biyobozunurluk denemeleri için en uygun tür olarak seçildi. Bu protokol, kullanılan kontrolün aynı türün tedavi edilmemiş replikasyonları olması gerektiği halde, farklı tedavilerin ormanlarını test etmek için de geçerlidir.

Protokol

1. Test Çubuklarının Hazırlanması

1. Herhangi bir işlem işlemi tamamlandıktan sonra, kuru ahşabı 2 mm x 4 mm x 20 mm boyutlarında test çubukları halinde kesin (Şekil 1). Hava kuru, laboratuvar koşullarında sabit bir ağırlığa yapışır. Test edilen her ahşabın en az 5 çoğaltmasını kullanın.

Şekil 1: Gribble besleme oranlarını değerlendirmek için kısa süreli laboratuvar testlerinde kullanılan test çubukları.  2 mm x 4 mm x 20 mm boyutlarında test ahşap çubuklar. Soldan sağa: ekki, terebentin, tatlı kestane ve kayın kalp ağacı ve İskoç çam ağacı. Ölçek çubuğu 4 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Vakum Emprenye
   1. Ahşap hazırlama sonrası (yani, varsa kesme ve arıtma), çubukları gıda açısından güvenli bir plastik kapta, vakum kurutucunun içine bir ağın altına yerleştirin ve vakum yağı kaplaması ile kolaylaştırılan sıkı bir conta olmasını sağlayan kapağı değiştirin (Şekil 2).
   2. Kurutucu ve pompayı birbirine bağlayan boru arasına açık havaya giden üçüncü bir tüple üç yönlü bir vana takın (Şekil 2). Üç yönlü vananın havaya kapalı olduğundan emin olun ve vakum kurutucu içinde -0,75 ila -1,0 bar arasında bir vakum elde etmek için pompayı çalıştırın ve bu vakumu 45 dakika - 1 saat tutun.
   3. Üçüncü tüpün açık ucunun bir deniz suyu kabına batırın. Pompayı kapatın ve pompaya giden vanayı kapatın, ardından deniz suyu vakum tarafından kurutucuya çekilene kadar vanayı yavaşça açın. Suyun plastik kabı doldurana kadar akmasına izin verin, ağ seviyesinin üzerinde.
   4. Daha sonra tüpü konteynerdeki deniz suyundan çekin, kurutucu atmosferik basınca dönene kadar havanın girmesine izin verin. Çubukları plastik kabın dibine batana kadar ağın altına batırın.

Şekil 2: Laboratuvar besleme tahlilleri sırasında kum torbalarına beslenmeye hazırlık olarak ahşap çubukları deniz suyu ile emprenye etmek için kullanılan ekipman.  A) Vakum kurutucu; B) Pompa; C) Vakum kurutucu için basınç göstergesi; D) Vakum kurutucu, pompa ve açık hava veya deniz suyuna (turuncu tüp) giden üç yönlü vana. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Liç Ahşap
   1. Deniz suyuna doymuş test çubuklarını 50 mL tüplerde bulunan deniz suyuna batırın (Şekil 3). Suyu 20 günlük bir süre için düzenli olarak değiştirin.
      NOT: Liç işlemi, işlenmiş veya doğal ormanlar da dahil olmak üzere test edilen deneysel ahşaplar için geçerlidir.

Şekil 3: Laboratuvar besleme tahlilleri sırasında kumsallara beslenmeye hazırlanmak için ahşap çubuklardan liç.  Düzenli su değişimi (1-3 gün) ile 50 ml Falcon tüpünde bulunan deniz suyuna tamamen batırılmış ahşap, belirgin renkli liç üretti. Soldan sağa liç kalp ağacı; tatlı kestane, terebentin, ekki ve kayın ve İskoç çam sapwood. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Gribble Ayıklama

1. Istila edilmiş bir ahşap bloktan tek tek gribble örnekleri çıkarın. Bir çift ince tokmak ve ince (000/0,4 mm veya daha küçük boyut) bir boya fırçası kullanın. Kumlu yuvayı kümeslerle kaplayan herhangi bir ahşabı dikkatlice soyun
   NOT: Yuvalar ahşabın yüzeyinde bulunur ve küçük deliklerle tanımlanabilir (Şekil 4).
2. Kum dalaşı ortaya çıktıktan sonra, bireyleri alttan hafifçe almak ve deniz suyuyla dolu bir petri kabına biriktirmek için bir boya fırçası kullanın. Türleri tanımlamak ve ayıklanırken herhangi bir hasara yol açtığına emin olmak için mikroskop altında gribble'ı kontrol edin.
   NOT: Pleopodları dövmek canlılık belirtisidir.
   1. Gravid dişiler daha az beslenme kapasitesine sahip olduğu için yumurta kara düşünen dişileri atın.

Şekil 4: İki tipik havalandırma deliği ile bir gribble yuvası görüntüsü. L. Quadripunctata, 2 mm x 4 mm x 20 mm büyüklüğünde Radiata çam ağacının bir çubuğu üzerinde yuva. Yuva girişinin yanında iki küçük havalandırma deliği görülebilir. Ölçek çubuğu 2 mm. Bu şeklin daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.  

3. Limnoria quadripunctata'yı tanımlama
   1. Limnoria quadripunctata'yı stereomikroskop altında, beşinci ^{pleonit19'daki} X şeklindeki bir karineye ek olarak, kare desenli olarak düzenlenmiş dört farklı tüberkül tarafından tanımlayın (Şekil 5).

Şekil 5: Limnoria quadripunctata tanımlayıcı özellikler.  Dorsal yüzey Limnoria quadripunctata görüntüsü, x20 büyütmede stereomikroskop üzerine çekilmiştir. Kırmızı okla gösterilen özellikleri tanımlamak - X şeklindeki karina ve mavi oku gösterir - pleotelson üzerinde dört tüberkül gösterir. Ölçek çubuğu 1 mm. Bu şeklin daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Kuyu Plakalarının Hazırlanması

1. 20 mm çapında kuyulara sahip çok kuyulu plakalarda, kuyu başına 32-35 PSU arasında bir test çubuğu ve 5 mL filtresiz deniz suyu yerleştirin (Şekil 6).
2. Her ahşap türünün plaka başına en az bir kez temsil edildiği şekilde, kuyu plakası boyunca sistematik olarak ahşap tedavileri / türleri yerleştirin. Kuyu başına bir gribble ekleyin.
   NOT: Sıcaklık L türleri için 20 °C ± 2 °C'de bir inkübatörde sabit tutulmalıdır. quadripunctata, diğer Limnoria türleri, belirli türlere uyacak şekilde yapılan sıcaklık ayarlamaları ile kullanılabilir.
3. Fotoperiod'un gribble besleme oranı üzerinde bir etkisi olmadığı için plakaları sabit karanlık koşullarda ^tutun15.

Şekil 6: Gribble besleme tahlilleri için deneysel kurulum.  Gribble besleme oranının laboratuvar testinde kullanılan 12 çok kuyulu plaka örneği. Her kuyuda 5 ml deniz suyu ve farklı ahşap türlerinden bir test çubuğu (20 mm x 4 mm x 2 mm) bulunur; İskoç Çam sapwood ve ekki, kayın, tatlı kestane ve terebentin kalp ağacı. Ölçek çubuğu 20 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

4. Faecal Peletleri Toplamak ve Saymak ve Canlılığı Değerlendirmek.

1. Haftada iki kez, test çubuğunu ve her bir gribble'ı (kuyu başına bir) kuyu plakasından çıkarın ve taze önceden hazırlanmış bir kuyu plakasına yerleştirin (kuyu başına 5 mL deniz suyu içerir [32-35 PSU, 18-22 °C]).
2. Aktarmadan önce çubuktan herhangi bir faekal peletleri hafifçe fırçalamak ve faekal peletleri orijinal kuyuda tutmak için bir boya fırçası kullanın.
   NOT: Gribble'ı taze bir kuyu plakasına aktarmadan önce, canlılık 1-5 ölçeğinde değerlendirilebilir; 1= ölü, 2 = pasif, ahşap üzerinde değil, 3 = aktif olarak yüzen veya dövülen pleopodlar, ahşap üzerinde değil, 4 = ahşabın yüzeyinde sürünme, 5 = ahşaba göm.
3. Görüntü İşleme
   1. Herhangi bir topak ayırmak için ince bir boya fırçası kullanın, böylece tek tek peletler görülebilir ve peletleri kuyunun kenarlarından uzağa fırçalayın. Stereo mikroskop altında, büyütme x4'te ayrıntılı bir fotoğraf çekin ve bir bilgisayara yükleyin (Şekil 7).
      NOT: Peletlerin odakta olduğundan ve arka planın su yüzeyinde gölge veya ışık yansıması olmadan düzgün olduğundan emin olun.

Şekil 7: Gribble faecal peletlerin görüntüsü. L. quadripunctata faecal peletler (küçük, silindirik, kahverengi peletler) Radiata çam ağacı ile beslenmekten çok kuyulu bir tabakta. x4 büyütmede çekilmiş. Görüntü analizi için manipülasyondan önceki görüntüler (bkz. Şekil 7). A) ImageJ'de otomatik sayım için kullanılacak uygun bir görüntü örneği. Peletler yeterince yayılır ve kuyunun kenarlarından uzaklaşır. Kuyu ortalanmıştır ve herhangi bir engel veya yansıma yoktur. B) Görüntü analizi için uygun olmayan bir görüntü örneği. Kuyu ortadan kalkmış, alt yarısını kesiyor. Mavi (noktalı) daire, su yüzeyinden ışık yansımasını gösterir. Turuncu (katı) daire, birbirine çok yakın ve kuyunun kenarına çok yakın bir şekilde topaklanmış peletleri gösterir. Kırmızı (kesikli) daire, çıkarılmamış bir ahşap yonga gösterir. Ölçek çubuğu 10 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.  

2. ImageJ Kullanarak Faecal Pelet Sayısı Oluşturma İşlemi.
   1. ImageJ'i (03/08/21, 1.8.0_172 itibariyle en son sürüm) https://imagej.nih.gov/ij/download.html'den indirin veya bilgisayarın tarayıcısından çalıştırın.
   2. Sürükleyip bırakarak veya Dosya | seçerek görüntü yığınını karşıya yükleme | al Görüntü sırası | Göz atın. Parametreleri değiştirmeyin ve Tamam'ı seçin.
   3. Ardından, faekal peletleri içeren kuyunun alt bölümünü seçmek için daire aracını kullanın. Kuyu kenarlarını kaldırın, | Düzenle'yi seçin Dışarısı temiz. Görüntüyü ikili yap, İşlem |'nı seçin İkili yapın.
   4. Analiz | seçerek kalibre etme Ölçeği ayarlayın ve görüntü için milimetre başına piksel sayısını seçin (örneğin 10 piksel = 1 mm). Peletleri sayın, Analiz |'nı seçin Parçacıkları analiz edin.
   5. Boyut (^birim2) yanındaki kutuda, daha önce ayarlanan birim ölçeğini kullanarak en küçük boyutlu peletle aynı olan bir alt eşik seçin (örneğin, 10 piksel = 1 mm ve en küçük pelet 0,5 mm ise, 5 sonsuzluğu seçin).
   6. Göster açılan kutusunda Anahatlar'ı seçin ve Özetle'yi işaretleyip Tamam'a basın (Şekil 8).
      NOT: Daha fazla bilgi https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/index.html

Şekil 8: ImageJ'de faekal peletleri saymak için kullanılan işlemin akış şeması.  A) ImageJ'nin Dosya sekmesinde bir görüntü dizisi içe aktarma. B) Yerel bir cihazdan bir dizi görüntü almak için 'Görüntü Sırasını İçeri Aktar' iletişim kutusundaki gözat düğmesi. C) Faekal pelet içeren alanı seçmek için daire aracını kullanmak D) Seçili alanın dışını kaldırmak için düzenleme sekmesi alanındaki dış düğmeyi temizleyin. E) İşlem sekmesinde ikili düğme yapın. F) Analiz sekmesinde ölçek düğmesini ayarlayın. Piksel cinsinden uzaklık, piksel sayısının bir ölçü birimine (mm) eşdeğerdir. G) Analiz sekmesindeki parçacıkları analiz etme düğmesi. Boyut (birim^2), piksel cinsinden faecal pelet boyutunun alt eşiğine sonsuzluğa ayarlanır. 'Anahatları' göster ve 'özetle' seçilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

4. Veri Analizi
   1. Pelet sayılarını günde peletlere dönüştürün, bu da beslenme hızının dolaylı ve dolaylı ölçüsünü verir. Tüylenmenin meydana geldiği günlerde, herhangi bir ürküten kişiden gelen verileri atın (Şekil 9).
      NOT: Tüylenme 1-3 gün içinde gerçekleşir ve dış iskeletin tam bir tüylenme görüldüğünde tanımlanabilir.

Şekil 9: Bir gribble moult örneği.  Gribble (L. quadripunctata) tüylenme, 20 mm x 4 mm x 2 mm büyüklüğünde bir Radiata çam ağacı test çubuğu üzerinde. Moults kırmızı daireler tarafından gösterilir. Ölçek çubuğu 2 mm. Bu şeklin daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sonuçlar

L'nin beslenme deneyi. quadripunctata 20 gün boyunca gerçekleştirildi, Kasım 2020'de beş farklı ahşap türü (İskoç çamı (Pinus sylvestris L) sapwood ve kayın ağacı (Fagus sylvatica L), ekki (Lophira alata Banks ex C. F Gaertn), tatlı kestane (Castanea sativa Mil) ve terebentin (Syncarpia glomulifera (Sm.) Neid)) (Bkz. Malzeme Tablosu) kullanarak. Ahşap türleri başına sekiz çoğaltma çubuğu kullanıldı ve bir Limno...

Tartışmalar

Beslenme deneyinde kullanılacak gribble örneklerini seçmeden önce, bireyler uygunluklarını değerlendirmek için taranmalıdır. Boyut farklılıkları nedeniyle bireyler arasında beslenme oranında bazı farklılıklar olabilir, bu nedenle sadece tamamen yetişkin örnekler seçilmelidir. Borges ve ark., 200917 yılları arasında bireylerin beslenme oranı arasında 1,5 mm ile 3 mm uzunluğunda anlamlı bir fark saptanmıştır. Dişi Limnoria yumurtalarını kuluçkaya yakar, b...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-well cell culture plates	ThermoFisher Scientific	150200
50ml Falcon tubes	Fisher Scientific	14-432-22
Adjustable volume pipette	Fisher Scientific	FBE10000	1-10 ml
Beech	G. Sawyer (consultant in timber technology)	Fagus sylvatica	Taxonomic authority: L
Ekki	G. Sawyer (consultant in timber technology)	Lophira alata	Taxonomic authority: Banks ex C. F. Gaertn.
Forceps	Fisher Scientific	10098140
Incubator	LMS LTD	INC5009
Microporous specimen capsules	Electron Microscopy Sciences	70187-20
Petri dish	Fisher Scientific	FB0875713
Scots Pine	G. Sawyer (consultant in timber technology)	Pinus sylvestris	Taxonomic authority: L.
Size 00000 paintbrush	Hobby Craft	5674331001	Size 000 or 0000 also acceptable
Sweet Chestnut	G. Sawyer (consultant in timber technology)	Castanea sativa	Taxonomic authority: Mill
Turpentine	P. Evans (Professor, Dept. Wood Science, University of British Columbia)	Syncarpia glomulifera	Taxonomic authority: (Sm.) Nied.
Vacuum desiccator	Fisher Scientific	15544635