טכניקות הכנת רקמות להדמיית טומוגרפיה ממוחשבת מיקרו משופרת ניגודיות של מודלים לבביים של יונקים גדולים עם מחלות כרוניות

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לקבלת תמונות טומוגרפיה ממוחשבות מיקרו ברזולוציה גבוהה של לבבות שלמים של יונקים גדולים בריאים ופתולוגיים עם שיפור ניגודיות סלקטיבית של קולגן.

Abstract

שיפוץ מבני הוא תוצאה שכיחה של לחצים פתולוגיים כרוניים המוטלים על הלב. הבנת התכונות האדריכליות וההרכביות של רקמות חולות היא קריטית כדי לקבוע את האינטראקציות שלהם עם התנהגות קצבית. שיפוץ רקמות בקנה מידה זעיר, מתחת לרזולוציה הקלינית, מתגלה כמקור חשוב להפרעת קצב קטלנית, עם שכיחות גבוהה בקרב מבוגרים צעירים. עדיין נותרו אתגרים בהשגת ניגודיות הדמיה גבוהה ברזולוציה מיקרוסקופית מספקת עבור מודלים פרה-קליניים, כגון לבבות שלמים של יונקים גדולים. יתר על כן, שיפור הניגודיות הסלקטיבית של הרכב הרקמות להדמיה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה עדיין חסר. הדמיה לא הרסנית באמצעות טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת מראה הבטחה להדמיה ברזולוציה גבוהה. המטרה הייתה להקל על הסבל מצילום רנטגן על הנחתת יתר בדגימות ביולוגיות גדולות. לבבות הופקו מחזירים בריאים (N = 2), וכבשים (N = 2) עם אוטם שריר הלב כרוני המושרה והיווצרות צלקת פיברוטית או פרפור פרוזדורים כרוני. לבבות שנכרתו הודבקו ב: תמיסת מלח בתוספת חומר מרווה של יון סידן ומרחיב כלי דם, אתנול בהתייבשות סדרתית והקסמתילדיזליזיאן תחת ואקום. זה האחרון חיזק את מבנה הלב במהלך ייבוש האוויר במשך שבוע. רקמה דומיננטית של קולגן נקשרה באופן סלקטיבי על ידי חומר משפר ניגודיות של קרני רנטגן, חומצה פוספומוליבדית. קונפורמציית הרקמה הייתה יציבה באוויר, ואיפשרה רכישות טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבות ארוכות טווח כדי לקבל תמונות ברזולוציה גבוהה (איזוטרופיות של 20.7 מיקרומטר). העמסת חומר ניגוד אופטימלי על ידי דיפוזיה הראתה שיפור ניגודיות סלקטיבי של שכבת האפיתל וסיבי Purkinje תת-אנדוקרדיאליים בחדרי חזירים בריאים. לבבות פרפור פרוזדורים (AF) הראו הצטברות ניגודיות מוגברת בדפנות האחוריות ובנספחים של האטריה, המיוחסת לתכולת קולגן גבוהה יותר. לבבות אוטם שריר הלב הראו ניגודיות מוגברת באופן סלקטיבי באזורים של פיברוזיס לבבי, מה שאיפשר זיהוי של סיבי שריר הלב ששרדו. תכשירי רקמות מיובשות באוויר, המשופרות בניגודיות, אפשרו הדמיה בקנה מידה זעיר של לב היונקים הגדולים השלם ושיפור הניגודיות הסלקטיבית של מרכיבי המחלה הבסיסית.

Introduction

מחלות לב מבניות מהוות את רוב התמותה הקשורה ללב ברחבי העולם¹. שיפוץ מבנה הלב משפיע על סביבת שריר הלב ועל המרחב הבין-משרדי. מכיוון שגם התפקוד החשמלי וגם התפקוד המכני של הלב תלוי בארגון המיוציטים, הפרעה עלולה להוביל להפרעות קצב לב בלתי נסבלות, לפגיעה בפעולות שאיבת הדם ולאי ספיקת לב 2,3,4,5,6,7,8,9. ההתפתחויות של טיפולים מרפאים למחלות לב מבניות עולות בהרבה על שכיחות המחלה ^2,5. ככזה, מספר גדל והולך של מודלים פרה-קליניים של מחלות לב מבניות מתגלים כדי להבין טוב יותר את הפרופילים האנטומיים-מורפולוגיים ואת הפתוגנזה הנובעת מכך של הפרעות קצב לב 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23. נצפתה על פני ספקטרום המחלות המבניות היא ויסות של פיברוזיס אינטרסטיציאלי, ובאופן נפוץ יותר במקרים הקשורים לאיסכמיה, החלפת שריר הלב בפיברוזיס ורקמת שומן¹⁸. הבנה מורפולוגית של רכיבים חוץ-תאיים פתולוגיים יכולה לאפשר זיהוי של מצעים פוטנציאליים של הפרעות קצב. התפלגותה והיקפה של המחלה מספקים אינדיקטורים חזקים לסיכון קצבי. עם זאת, עדיין נותרו אתגרים לצילום מקיף של פרופילי מחלות על ידי שילוב מאקרו ומיקרו-קנה מידה בלב שלם.

טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (microCT), המבוססת על צילומי רנטגן, מתגלה ככלי רב עוצמה לחקר מיקרו-מבנה של רקמות ביולוגיות רכות באמצעות חומרי ניגוד. מפות אנטומיות מפורטות ביותר התקבלו עבור לבבות ממכרסמים קטנים ^24,25,26 ודגימות קטנות שנותחו מלבבות יונקים גדולים ^27,28. עם זאת, הדמיה ברמת האיבר השלם של לבבות יונקים גדולים מציגה אורכי נתיב מוגזמים שעליהם מוחלשים פוטונים של קרני רנטגן באמצעות טכניקות הכנה קונבנציונליות של רקמות. זה כרוך בהעמסת ניגודיות של הרקמה וטבילת הדגימה בממס סוכן ניגוד במהלך הרכישה. הגדלת גודל המדגם והרזולוציה מטילה הארכה של זמן הרכישה הכולל. לכן יציבות הרקמה הופכת להיות חיונית לשחזור תמונה שמיש, כלומר יש למנוע עיוות רקמות כתוצאה מייבוש. עם זאת, לשימוש בנוזל טבילה יש חסרונות: (i) עוצמת אות הרקע הכוללת הופכת לבלתי זניחה ו-(ii) מקדמת דילול של מולקולות ניגוד הקשורות לרקמות. שני גורמים אלה תורמים להורדת ניגודיות התמונה.

מחקר זה מפרט צינור עיבוד רקמות חדשני כדי להקל על הנחתת הפוטונים ברקע ולמטב את הטווח הדינמי שמעניקים סוכני שיפור הניגודיות. מומלץ להשתמש בגישה של ייבוש אוויר ברקמות עם חיזוק רקמות כימיות כדי להגביל את עיוות הרקמה²⁹. לכן דגימות רקמות יכולות להישאר יציבות באוויר למשך רכישות ארוכות ולהשמיט תרומות רקע מנוזלי טבילה. צינור מתודולוגיה זה מספק: (1) פרוטוקול עיבוד והדמיה מקיף של רקמות הממוטב באמצעות לבבות חזירים שלמים; (ii) הערכה של טכניקות ריכוז וטעינה של ניגודיות, ו-(3) יישום של צינור זה בשני מודלים שונים של מחלות כרוניות של פרפור פרוזדורים ואוטם שריר הלב בלב כבשים. התפתחות המודלים של מחלות כרוניות תוארה במקום אחר עבור כל מודל של מחלת לב כרונית, אוטם שריר הלב המושרה על ידי אמבוליזציה של עורקים כליליים מלעוריים¹³ ופרפור פרוזדורים המקיים את עצמו³⁰.

Protocol

כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות של דירקטיבה 2010/63/EU של הפרלמנט האירופי בנושא הגנה על בעלי חיים המשמשים למטרות מדעיות. פרוטוקולים של בעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית (CEEA50) באוניברסיטת בורדו. הלבבות מקורם בשלושה מודלים של יונקים גדולים, כולל (i) חזירים לבנים גדולים ובריאים (N = 2, 2 חודשים); (ii) כבשים (N = 1, 2 שנים) עם אוטם שריר הלב המושרה¹³ ו- (iii) כבשים (N = 1, 7 שנים) עם פרפור פרוזדורים מושרה³⁰.

1. הכנת פתרון:

1. תמיסה לב-ריאה: מכינים 3 ליטר מים מזוקקים ומוסיפים נתרן כלורי (110 מ"מ), אשלגן כלורי (16 מ"מ), נתרן ביקרבונט (10 מ"מ), D-(+)-גלוקוז (9 מ"מ), תמיסת סידן כלורי (1.2 מ"מ) ותמיסת מגנזיום כלוריד (16 מ"מ). בסוף, הוסיפו 500 μL/L של נתרן הפרין. שמור על פתרון זה ב 4 °C (76 °F).
2. מלח ביציאת פוספט - תמיסת EDTA (PBS-EDTA).
   1. ראשית, יש להוסיף חומצה אתילנדיאמינט-אצטית (EDTA) ל-1 ליטר מים מזוקקים לריכוז סופי של 10 מ"מ. הגדל ושמור על pH של תמיסה של 12 באמצעות תמיסת נתרן הידרוקסיד (1 M) כדי להמיס את ה- EDTA.
   2. לאחר שה-EDTA מומס במלואו, הורידו את ה-pH ל-7.4 באמצעות חומצה הידרוכלורית. הוסיפו שקית רדיד אלומיניום אחת של מי מלח עם מאגר פוספט כדי לקבל תמיסה ב-0.01 מ' (נתרן כלורי, 0.138 מ'; אשלגן כלורי, 0.0027 מ') ו-pH 7.4. שמור פתרון זה בטמפרטורת החדר (RT).
3. אתנול - תמיסת סוכן הניגוד חומצה פוסופומוליבדית (PMA): מכינים 1 ליטר של אתנול מוחלט ומוסיפים את ה-PMA כדי לקבל תמיסה בריכוז של 1%. שמור על פתרון זה ב- RT.

2. מקור הרקמה

1. המתת חסד את החיה ומיצוי הלב על פי הנחיות אתיות מקומיות. השקיעו במהירות את הלב בתמיסה אירו-ריאה קרה ועסו בעדינות את החדרים לשטיפה ראשונית.
2. הקפידו לחתוך את אבי העורקים מתחת לקשת אבי העורקים ולהדק שני צדדים של דופן העורקים באמצעות מחזיקי מחט.
3. השהיית הלב על ידי מחזיקי המחט, החדרת צינורית אבי העורקים לשורש אבי העורקים, תוך הקפדה שלא ליצור קשר עם המסתמים אבי העורקים או לבלוט דרכם. עוטפים תפר של 0 מדים סביב קשת אבי העורקים בגובה הצינורית וקושרים היטב את הצינורית למקומה.
4. באמצעות מזרקים של 50 מ"ל, להזריק 200 מ"ל של תמיסה לב-ריאה קרה (4 מעלות צלזיוס). הסר את עודפי הצטברות הדם בחללים על ידי הטיית הלב על צדו האחורי כדי להתנקז דרך הוורידים הריאתיים.
5. יש לטבול את הלב השטופה ולשמור על תמיסה קרדיופלגית קרה המאוחסנת על קרח עד שהיא מוכנה לנתיחה.

3. הכנת רקמות:

1. מכינים מאגר של 1 ליטר הנתמך 80 ס"מ מעל צלחת דיסקציה. הצמידו צינור תרמופלסטי באורך 80 ס"מ וקוטר פנימי של 3.2 מ"מ וקוטר חיצוני של 4.8 מ"מ ליציאת ניקוז של המאגר.
2. קבעו ברז תלת-כיווני לצינורות הניקוז והצמידו צינורות תרמופלסטיים נוספים (20 ס"מ, קוטר פנימי של 1.6 מ"מ וקוטר חיצוני של 3.2 מ"מ) לכל יציאה חופשית על הברז התלת-כיווני. תקן ברזים דו-כיווניים לקצות התשלום של הצינורות.
3. מלאו את המאגר בתמיסה לב-ריאה בתוספת הפרין (2500 יחידות). פתחו את הברזים כדי לאפשר לתמיסה האירובית לנקז ולהסיר את כל בועות האוויר, ואז סגרו את הברזים הדו-כיווניים.
4. הכינו צינוריות לאוסטיה כלילית שמאלית וימנית באמצעות צינורות Polytetratrafluoroethylene (PTFE) (קוטר פנימי של 1 מ"מ וקוטר חיצוני של 2 מ"מ).
   1. חותכים 5 ס"מ של צינורות ומחממים קצה אחד על ידי הנחת הקצה ליד להבה עירומה. ברגע ש-1 מ"מ מהקצה מתחיל להתמוסס והופך שקוף, לחצו את הקצה על משטח עמיד בחום קשה כדי ליצור רכס בקצה הצינורית כדי למנוע מהצינוריות להחליק החוצה מהכלים.
   2. הכנס 1 ס"מ של הקצה הלא מחומם של כל צינורית לשני הקצוות של צינורות הניקוז של מאגר הניקוז.
5. יש להסיר את צינורית אבי העורקים. תחת תמיסה קרדיופלגית קרה, למקם את האוסטיה השמאלית והימנית של העורקים הכליליים.
6. באמצעות מספריים מחודדים, מפרידים בזהירות את שורש אבי העורקים מהרקמה הסובבת מעל ומתחת לאוסטיה הכלילית כדי לאפשר השחלה של תפר משי 0 גרם מתחת לכלי הכלילית.
7. פתחו את הברזים הדו-כיווניים והכניסו את קצות הצינוריות לאוסטיה הכלילית. עם קצות הצינוריות הנמתחות 1-2 ס"מ לתוך האוסטיה ומעבר למיקום התפר, קושרים את הצינוריות.
8. יש לשטוף את הלב תוך עיסוי עדין של החדרים במשך 15 דקות עד שהלב מתנקה מדם.
9. לאחר השטיפה, סגרו את הברזים הדו-כיווניים וניתקו אותם מהברז התלת-כיווני. העבירו את הלב למיכל פלסטיק 1 ליטר עמיד בפני כימיקלים המכיל 500 מ"ל של תמיסת PBS-EDTA.
10. שחזרו את תמיסת PBS-EDTA בצינורות התרמופלסטיים מתחת למכסה אדים באמצעות משאבה פריסטלטית עם שני ערוצים. מקבעים את צינורות המשאבה עד שהצינורות נעדרים בועות אוויר, ואז מנקבים כל צינורית עורק כלילי על ידי סירקולציה ב-RT למשך 2 שעות ב-80 מ"ל/דקה.
11. ודא שמכסה המנוע של האדים פועל. עצרו את המשאבה, נקזו את התמיסה מהמיכל והחליפו אותה בפורמלין (10%) לקיבוע למשך שעה אחת ב-RT ב-80 מ"ל לדקה.
12. החלף את תמיסת הפורמלין ב- PBS כדי לשטוף את המקבע שלוש פעמים במשך 15 דקות כל אחת ב- 80 מ"ל לדקה.

4. התייבשות וייבוש רקמות:

הערה: השתמש באותו קצב זלוף (80 מ"ל לדקה) ותן לרקמה להישאר ב- RT לאורך כל הדרך.

1. החלף את תמיסת PBS באתנול ב-20%, מדולל במים טהורים במיוחד, ונקב במשך 3 שעות לפחות.
2. מנקבים את הלב באמצעות סדרה של ריכוזי אתנול מצטברים.
   1. התחילו בהחלפת תמיסת האתנול של 20% באתנול מדולל ל-30% ופרפוזה למשך שעתיים.
   2. חזרו על פרפוזיה על ידי הגדלת ריכוז האתנול בכל איטרציה עד 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 95%, 90%, 95%, 99%, ו-100% למשך זמן מינימלי של שעה אחת בכל שלב(ריכוז).
      הערה: דגימות לב עשויות לנוח ללא זרימת פרפוזיה במהלך הלילה בכל דילול אתנול אם התרחשה זלוף מינימלי של 15 דקות עבור ריכוז זה.
3. אופציונלי: אם תפעילו חומרי ניגוד באמצעות זלוף, יש להחדיר ללב 100% אתנול בתוספת חומר הניגוד PMA, 1% למשך 48 שעות. יש לשטוף את חומר הניגודיות על ידי פרפוזיה עם 100% אתנול למשך שעתיים.
4. כדי לחזק את רקמת הלב לפני ייבוש האוויר, יש לשחזר תערובת של 50:50 של אתנול והקסמתילדיזלאזאן (HMDS) במשך 10 דקות. לאחר מכן על ידי 100% HMDS למשך 2 שעות נוספות.
   אזהרה: HMDS הוא חומר רעיל ומזיק ביותר. ריח חזק של אמוניה משתחרר במגע עם האוויר. יתר על כן, הצורה הנוזלית של HMDS היא נדיפה מאוד ומזרזת על ידי חומרים המכילים יוד.
5. נתקו את הצינורית מהצינוריות ותלו את הלב מתופר אבי העורקים בתוך מכסה המנוע של האדים.
6. החליקו בזהירות שקית רוכסן על הלב וסגרו את חותם השקית מעל התפר כדי להפחית את החשיפה של הלב לאוויר המסתובב. אפשרו ללב להתייבש באמצעות אידוי במשך שבוע.
7. אופציונלי: עבור חומרי ניגוד להעמסת דיפוזיה, שטפו את הלב ב-100% אתנול למשך 15 דקות תוך כדי תסיסה. יש לטבול את הלב ב-100% אתנול בתוספת PMA, 1%, למשך 48 שעות תחת ואקום. חזור על שלב 4.6.

5. מיקרו-CT:

הערה: מערכת מיקרו-CT של קרני רנטגן שולחנית שימשה להדמיית לבבות חזירים.

1. הרכיבו את הלב המיובש באוויר על מחזיק דגימה מתאים. מנעו כל תנועה במהלך מדידות המיקרו-CT של קרני הרנטגן באמצעות מהדק המעוגן למחזיק הדגימה ואבטחו את הלב באמצעות אבי העורקים המיובש והנוקשה.
2. יישרו בקפידה את מרכז דגימת הלב לאורך ציר האורך שלה עם מרכז שדה הראייה של ההדמיה עבור זוויות סיבוב של 0° ו-90°. כדי להשיג זאת בכל הכיוונים, להשעות את הלב באוויר באמצעות מהדק אבי העורקים הקבוע לתמיכת הדגימה.
3. לאחר פתיחת התוכנה וייזום מערכת המיקרו-CT של קרני רנטגן, החל את מסנן קרני הרנטגן אלומיניום, 1 מ"מ, מתח מקור קרני רנטגן ל-60 קילו-וולט וזרם ל-120 μA. הגדר את מידות התמונה ל-2016 x 1344 פיקסלים וגודל פיקסלים ל-20 מיקרומטר.
4. הוציאו את בעל הדגימה משדה הראייה וכיילו את תמונת הרקע ואת זמן החשיפה לקרני רנטגן על ידי קבלת תיקון שדה שטוח. ודא שתמסורת הרנטגן הממוצעת ברקע גדולה מ-80%.
5. תמונות שידור רנטגן של סקאוט לאורך התמיכה כדי לקבוע את שדה ההדמיה הכולל בציר האורך של הלב. לצורך סריקה, השתמש בשלב סיבוב של 0.18°, מסגרת ממוצעת של 5 וסיבוב מדגם של 180°. בחר את מצב סריקת ההסטה כדי לצלם את הרוחב המלא של התמיכה לדוגמה.
   הערה: פרמטרי הרכישה המצוינים בסעיף זה נבחרו כדי לייעל את איכות התמונה של קומפוזיציית הלב של האנסמבל.
6. לאחר הסריקה, השתמש בתוכנה לשחזור טומוגרפי של נפח תמונה תלת מימדי איזוטרופי. עבור היישום של תוכנת NRecon, השתמש בתיקון ממצאים הקשורים לרכישה, כולל השפעות התקשות קרן של 10% והפחתת חפץ טבעתי של 8.
7. כדי למטב את מגבלות אחסון הנתונים, החל את אזור העניין המלבני המינימלי הכולל את הווקסלים הספציפיים ללב. ייצא את התמונות בתבנית מפת סיביות של 8 סיביות כערימה של תמונות.
8. הצג באופן חזותי את מחסנית הנתונים המשוחזרת באמצעות תוכנת DataViewer. כוון באופן דיגיטלי את הדגימה בתוך גבולות התמונה כדי להתאים מחדש את הצירים הארוכים והקצרים של הדגימה עם שלושת הצירים העיקריים של נפח התמונה.
9. גזור את עוצמת הקול של התמונה בכל שלושת הצירים כדי להסיר את שכבות הרקע החיצוניות של התמונה, כדי להקטין באופן מרבי את גודל התמונה הכולל.

תוצאות

הכנת לבבות יונקים גדולים בשיטת ההתייבשות וייבוש האוויר מסירה את כל תכולת המים מהדגימה. ניתן לראות עדויות להחלפת מים לא מספקת על ידי אתנול במהלך העמסת HMDS (ראו פרוטוקול, שלב 4.4). נוכחות של מים תחת HMDS תיצור בועות העולות מהרקמה. במקרה של רמות מים מוגזמות, עלייה בטמפרטורה של נוזל הטבילה יכולה להתרחש. שמירה על תא הטבילה מוקף בקרח במהלך העמסת HMDS ראשונית יכולה להפחית את ההשפעות השליליות של חימום רקמות. לאחר ייבוש לבבות באוויר בהיעדר חומרי ניגוד, הדגימה תיראה בצבע לבן (ראו פרוטוקול, שלב 4.6). המשטח החיצוני היה לעתים קרובות מיובש ויציב מבחינה מבנית לפני השכבות הפנימיות. שטיפה באתנול לפני העמסת חומר הניגוד הסירה את הפיקדון הלבן (ראו פרוטוקול, שלב 4.7). חיתוך דרך רקמה באמצעות להב חד חושף סיבי שריר בודדים באופן מקרוסקופי עם הפרדה ברורה. העמסת ניגודיות על ידי טבילת דגימות לב במדיום חומר ניגוד סבלה מממצאי גבול דיפוזיה באזורים עבים ושריריים מאוד של הדגימה. טעינת ניגודיות דיפוזיה תחת ואקום סיפקה צבע הומוגני יותר בשריר (דגימת לב מס' 1, ראו טבלה 1 לזמני טעינה של חומרי ניגוד). באופן מקרוסקופי, התפלגות חומר הניגודיות על פני השטח הראתה כתמים הומוגניים בין שריר הלב לאזורים המורכבים בעיקר מרכיבים חוץ-תאיים, בעיקר שומן ורקמת חיבור. דגימות רקמה מיובשות באוויר, לפני או אחרי העמסת חומרי ניגוד, שמרו על שלמות מבנית יציבה.

הזמן הדרוש כדי לסרוק את מלוא רוחב הדגימה ברזולוציה של 20 מיקרומטר תחת microCT באמצעות פרמטרי הסריקה הנ"ל וזמן חשיפה של 1700 אלפיות השנייה היה 6 שעות 34 דקות. בהתאם לגודל המדגם בציר הגנטרי של הסורק, משך זמן זה הוכפל במספר המיקומים הדרושים כדי ללכוד את מלוא אורך הדגימה. עבור לבבות חזירים וכבשים במחקר זה, נעשה שימוש בשלוש עד ארבע עמדות. תוכנת NRecon ריצפה את סריקות ריבוי המיקומים וההיסט כדי ליצור תמונת הקרנת רנטגן אחת עבור כל שלב סיבוב של מקור קרני הרנטגן והגלאי. בסך הכל, 1000 הקרנות מאוחסנות כתמונות של 16 סיביות, ומייצרות נתונים של 30-40 GB. תמונות נפחיות משוחזרות היו 52-70 GB.

ציוני דרך אנטומיים עיקריים, כולל חללי החדרים, המחיצה והקירות החופשיים של החדרים, היו ניתנים לזיהוי בקלות מהדמיית שידורי רנטגן של לבבות חזירים מיובשים באוויר המוכתמים בחומר ניגוד על ידי העמסת דיפוזיה (איור 1A). יתר על כן, אזורים בעלי מרקם גבוה המצביעים על ארגון מיקרו-סטרוקטורלי, כגון כיוון סיבי שריר הלב, נצפו גם הם עקב הנחתה/העברה רגישה של קרני רנטגן (איור 1B). שחזורים טומוגרפיים של נפחי תמונה תלת-ממדיים הראו הפרדה ברורה בין רקמה לרקע הן בגבולות אפיקרדיאליים והן בגבולות האנדותל (איור 1D). באופן תוך-מילולי, נצפו ניגודיות נמוכה ושיפוע דיפוזיה של עוצמת ווקסל בכל האזורים הטרנסמורליים העבים של הרקמה. למרות זאת, עדיין ניתן היה לזהות בקלות סיבי כלי דם וסיבי שריר הלב המופרדים על ידי מישורי מחשוף. רוחב פס שני בעוצמה גבוהה יותר של ניגודיות נצפה בשכבה האפיקרדיאלית ביותר ובאזורים תת-אנדוקרדיאליים נוקבים. שיפור הניגודיות היה הגדול ביותר באתרים שבהם הצטברו רכיבים חוץ-תאיים, במיוחד רקמת חיבור אפיקרדיאלית, שומן אפיקרדיאלי ומעטפת רקמת החיבור של רשת הסיבים Purkinje. התפלגויות עוצמת האותות של Voxel הראו הפרדה גבוהה מהרקע בעוצמה אפסית (אוויר) ומשתי אוכלוסיות דומיננטיות של רקמת ניגודיות נמוכה וגבוהה (איור 1D).

כדי לאמת את שיפור הניגודיות של שחזורי תמונות microCT ואת הסלקטיביות לתאי הקולגן של דגימות הלב, נעשה שימוש בהיסטולוגיה, במיקרוסקופיה של שדה בהיר ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית (איור 2). גוש טרנסמורלי של רקמה חדרית מלב מיובש באוויר ללא העמסה מוקדמת של חומר ניגוד הוכן להטבעת פרפין ולחתך אותו. פרוסות רקמה סמוכות שהורכבו על מגלשות מיקרוסקופ טופלו על ידי צביעת הטריכרום של מאסון, ללא טיפול, או 48 שעות של PMA (1%). טבילה של מקטעי רקמה המותקנים על החלקה ביטלה את ההשפעות של שיפוע הדיפוזיה של תהליך ההכתמה שנצפה בדגימות לב שלמות. צביעת הטריכרום של מייסון הראתה כתמים חיוביים לקולגן בשכבות האפיתל והאנדותל, באופן פריווסקולרי ברקמה התת-אפיקרדיאלית, ומעטפת רקמת חיבור המקיפה סיבי Purkinje הפועלים בחופשיות הבולטים לתוך חלל החדר השמאלי (איור 2A). תאורת שדה בהיר הראתה צבע כהה יותר במבנים קולגן לאחר צביעת PMA, מה שתומך בהצטברות המועדפת של PMA (איורים 2B,C). יתר על כן, בעבר הוכח כי טיפול PMA מרווה את האוטו-פלואורסצנציה של קומפלקסים מקרומולקולריים של קולגן³¹. בתמונות פלואורסצנטיות של מקטעי רקמות חדריים נגרמה אובדן פלואורסצנציה כתוצאה מ-PMA באתרים של קולגן (איור 2D לעומת 2E, איור 2D' לעומת 2E' ואיור 2D'' לעומת 2E''). הן בהדמיה בשדה הבהיר והן בהדמיה פלואורסצנטית, התאים התאים לא שונו על ידי הטיפול ב-PMA, ולקולגן הייתה הצטברות סלקטיבית של צביעת PMA ומרווה של אוטופלואורסצנציה.

דגימת לב מס' 2 הוכתמה בחומר ניגוד באמצעות זלוף לפני ייבוש האוויר. שחזור התמונה חשף כתמים מטושטשים מאוד בתוך תא שריר הלב (איור 3A). שיפור הניגודיות נראה לא סלקטיבי של הרכב הרקמה, ללא שיפור נוסף בעוצמת האות באזורים האפיקרדיאליים או התת-אנדוקרדיאליים. יתר על כן, רקמת ניגודיות נמוכה הראתה הפרדה לקויה מעוצמת הרקע (איור 3B).

פיברוזיס חדרי הושרה על ידי אוטם שריר הלב ואיסכמיה כרונית (דגימת לב #3). צלקת אנטרו-אפית נוצרה על ידי החלפת מיוציטים במרבצי פיברו-שומן ברקמה במורד הזרם לאתר אמבוליזציה של כלי הדם. דגימת לב מס' 3 הוכנה והוכנה מתוך טריז חדרי מנותק המכסה את החדר השמאלי הקדמי, את המחיצה ואת הקיר החופשי מהחדר הימני. הכנת תצורת טריז חדרית זו תוארה בעבר³² והיישום של טריזים להדמיית לב נבדק בפירוט³³. המורפולוגיה של הצלקת הייתה טרנסמורלית אך הטרוגנית (איור 4). נגע פיברוטי צפוף מרכזי היה מוקף באזור גבול רופף והטרוגני (איור 4A). ההכנה לחדר הייתה מוכתמת על ידי העמסת דיפוזיה לאחר ייבוש האוויר ובאקום. איור 4B-E מראה את עוצמות האות הגדולות ביותר של נפחי תמונות microCT משוחזרים בגבולות הרקמה ובאזורי הצלקת. חומרי הניגוד הכתימו בצורה גרועה את שריר הלב הבריא, אך הניגודיות המיקרו-סטרוקטורלית נשמרה (איור 4C). באזור הגבול, רקמת הצלקת הייתה שזורה בשריר הלב ששרד (איור 4D). פיברוזיס צפוף נראה טרנסמורלי אך בעל מרקם, מה שמעיד על שונות בהרכב (איור 4E). מקטעי רקמות של אזור חדר שמאל טרנסמורלי של הכנת הרקמה המיובשת באוויר ומוכתמת ב-PMA שימשו לאימות סלקטיביות PMA עבור קולגן ברקמה פתולוגית על ידי השוואה מול צביעת הטריכרום של מאסון (איור 4F). צביעת PMA הייתה סלקטיבית עבור קולגן (תת-אפיקרדיום ותת-אנדוקרדיום) ונעדרת באזורים של שריר הלב ששרד (איור 4G).

דגימת לב מס' 4 עם פרפור פרוזדורים מתמשך מושרה יובשה באוויר תוך שמירה על הצורה הטבעית של חלל הפרוזדורים. קריסת נספח פרוזדורים לא נצפתה. ניתן היה לזהות את ציוני הדרך האנטומיים העיקריים באופן מורפולוגי מתמונות משוחזרות (מחיצת הפרוזדורים, שרירי הפקטינט, סינוסים כליליים, אוסטיה של ורידים ריאתיים, ונה קאווה וקריסטה טרמינליס). צביעת דיפוזיה תחת ואקום הביאה לשיפור הניגודיות בשורש אבי העורקים ובסתומים האטריו-חדריים ובאזורים בדידים של שריר הלב הפועל. שיפור צביעת השרירים הוגבל לתוספות הפרוזדורים ולקירות האחוריים של אטריה השמאלית והימנית (איור 5).

איור 1: הדמיית MicroCT של לב חזיר מיובש באוויר שטופל בחומר ניגוד PMA על ידי דיפוזיה תחת ואקום. (B) פרופיל שידור שחולץ מהקו האדום ב- A. (C) פרוסה בעלת צירים קצרים של החדרים מנפח תלת-ממדי משוחזר טומוגרפית. חיצים צהובים מציינים אזורי ניקוב של ניגודיות המיוחסים לסיבי Purkinje תת-אנדוקרדיאליים. חצים כחולים מצביעים על כלי דם. (D) התפלגות עוצמת האות של פרוסת התמונה המשוחזרת המוצגת ב- C. LV: חדר שמאלי ו- RV: החדר הימני. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2: אימות של סלקטיביות PMA עבור קולגן. שריר הלב מוכתם באדום וקולגן מוצג בצבע ירוק. מקטעי רקמה סמוכים (B) ללא צביעה או (C) מוכתמים ב-PMA (1%) צולמו עם תאורת שדה בהירה כדי להעריך את אחידות הצבעים. (ד) חלקי רקמות הנעדרים צביעה או (E) מוכתמים על ידי PMA צולמו על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. לוחות D' (תיבה אדומה מוצקה) ו-E' (תיבה אדומה מקווקווית) הם תצוגות מוגדלות של תת-האפיקרדיום עבור מקטעים לא מוכתמים ומוכתמים ב-PMA. לוחות D'' (קופסה כחולה מוצקה) ו- E'' (תיבה כחולה מקווקווית) הם תצוגות מוגדלות תואמות של תת-אנדוקרדיום וסיבי Purkinje הפועלים בחופשיות. חצים מציינים אתרים של תכולת קולגן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3: העמסת זלוף של PMA לפני ייבוש האוויר והדמיית MicroCT. (A) פרוסה בעלת ציר קצר של נפח תמונה משוחזר של החדרים מלב חזיר. חצים כחולים מצביעים על כלי דם. (B) התפלגות עוצמת האות של פרוסת התמונה מחלונית A. LV: חדר שמאלי ו- RV: חדר ימני. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 4: הדמיית MicroCT של לב כבש הסובל מאוטם שריר הלב כרוני. (A) צלקת צפופה נוצרה באזור האפי (ראו תצלום משובץ). עיבוד נפח של האזור האפי מנקודת מבט אנדוקרדיאלית הוקצה לצביעה על סמך עוצמת התמונה (אדום המתאים לרקמת צלקת ולשריר הלב בירוק). פרוסות אורתוגונליות של עוצמת גווני האפור מראות את התפלגות הצלקת הצפופה ואת גבול שריר הלב ששרד. ההפרדה בין רקמה פיברוטית לבין שריר הלב מתאימה לאזורים של רקמת השומן. (B) תצלום של הכנת טריז חדרי מיובש באוויר מכבשה עם צלקות אפיות בעקבות אוטם שריר הלב. פרוסות אלכסוניות של נפח התמונה המשוחזרת של microCT חוצות את החדרים ברמה האמצעית שבין הבסיס לאפקס ופרוקסימליות לאתר של (C) חסימה וסקולרית (C- קו אדום בלוח B), (D) אזור הפרי-אוטם הגובל בצלקת צפופה וקרם שריר הלב בריא (D- קו כחול בלוח B) ו-(E) אזור של פיברוזיס צפוף (E - קו ירוק בלוח B). (ג') תצוגה מורחבת של אזור המחיצה המתוארת על-ידי תיבה מקווקו אדומה ב- C. (ד') תצוגה מורחבת של אזור האוטם בקצה החדר הימני (תיבה מקווקו כחולה בלוח D). (ה') תצוגה מורחבת של אזור האוטם בנקודת השיא של החדר השמאלי (תיבה מקופלת ירוקה בלוח E). LV: חלל החדר השמאלי; RV: חלל החדר הימני; MB: רצועת מנחה; פאפ: שריר פפילרי. חץ צהוב מציין עורק יורד קדמי שמאלי. (F) צביעת הטריכרום של מאסון של קטע היסטולוגי שנחתכה מהחדר השמאלי המיובש באוויר של PMA. קולגן מוכתם בכחול וקריר הלב מוכתם בוורוד/סגול. (G) מקטע רקמה מקביל של התפלגות צביעת PMA. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 5: תמונת MicroCT של לב כבשה בעקבות פרפור פרוזדורים כרוני המושרה. (A) עיבוד נפח של האטריה עם צביעה שהוקצתה כמו באיור 4A. (B) פרוסת תמונת microCT דו-פרוזדורית בציר הארוך של הלב. פרוסות בעלות צירים קצרים הוצאו ברמה של (C) שסתומים אטריו-חדריים (C- קו אדום בלוח B), (D) שורש אבי העורקים (D- קו כחול בלוח B) ו-(E) גג פרוזדורים שמאלי (E- קו ירוק אינפנל B). לוס אנג'לס: אטריה שמאלית; RA: אטריה ימנית; LAA: תוספת פרוזדורים שמאלית; RAA: תוספת פרוזדורים ימנית; LV: חדר שמאלי; RV: החדר הימני; LVOT: מערכת זרימה של החדר השמאלי; RVOT: מערכת זרימה בחדר הימני ו- PA: עורק ריאתי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

לדוגמה #	1	2	3	4
מינים	חזיר	חזיר	כבש	כבש
משקל גוף (ק"ג)	32.4	31.2	47.2	53.4
משקל הלב (ז)	191.2	186.2	202.4	207.6
פתולוגיה	-	-	MI כרוני	מיקוד אוטומטי כרוני
הכנה לדוגמה	לב שלם	לב שלם	טריז של לב קדמי	לב שלם
מצב טעינת הניגודיות	דיפוזיה	פרפוזיה	דיפוזיה	דיפוזיה
חשיפה לחומר ניגוד (h)	48	24	48	48

טבלה 1: דגימות לב וטיפול בחומרי ניגוד.

Discussion

פרוטוקול מפורט להכנת רקמות גדולות נקבע באמצעות לבבות שלמים מיונקים גדולים להדמיה מבנית ברזולוציה גבוהה לאחר מכן. גישת ייבוש האוויר הסירה השפעות של הנחתת קרני רנטגן ברקע ואופטימיזציה מקסימלית של רקמות: ניגודיות רקע²⁹. באמצעות גישה זו הושגה רזולוציה איזוטרופית בטווח של 20 מיקרומטר להדמיה נפחית על פני דגימות בקוטר של עד 7.2 ס"מ. עם זאת, MicroCT של רקמות רכות מסתמך בדרך כלל על שימוש בחומרי ניגוד לא ספציפיים כדי להקל על ספיגת קרני רנטגן ורגישות של מערכות microCT³⁴. אף על פי שחומרי הניגודיות של קרני רנטגן משפרים את הנחתת קרני הרנטגן הכוללת ואת שיפור ההדמיה של רקמות רכות, הפרדת מרכיבי הרקמות על בסיס הרכב ביוכימי נותרה מאתגרת. עם זאת, נצפה כי שימוש בלבבות מיובשים באוויר בשילוב עם חומר ניגוד קרני רנטגן נפוץ בסביבת המעבדה, PMA, הכתים באופן סלקטיבי רכיבים חוץ-תאיים. רקמת חיבור הקשורה לשריר הלב בריא ושיפוץ מבני פתולוגי במחלות כרוניות שופרו.

תהליך ייבוש הרקמה הביולוגית באוויר דורש התערבות כדי להתנגד לעיוות של הדגימה. להכנת דגימה למיקרוסקופיית אלקטרונים יש דרישות דומות. בדרך כלל, נעשה שימוש בשיטת ייבוש נקודתית קריטית, המשתמשת באיזון של מדיום טבילת רקמות, טמפרטורה ולחץ כדי למנוע מתח פנים של התוכן הנוזלי של הרקמה, מה שגורם לעיוות ברמה המולקולרית עם אידוי³⁵. גישה זו דורשת החלפה אחידה של תכולת המים של הדגימה בפחמן דו-חמצני נוזלי, שהוא אמין יותר בדגימות קטנות וקלות לפיזור. לחלופין, ניתן לשפר את השלמות המבנית של הרקמה ולייבש את האוויר, כלומר ניתן ליישם את שלב האידוי על פני תקופה ארוכה יותר כדי להפחית את העיוות הכולל. המולקולה HMDS עוברת סילילציה ליצירת פיגום מבוסס סיליקון כדי לחזק ולייצב את הארגון המולקולרי של דגימת הרקמה³⁶. האידוי מתארך עוד יותר על ידי הגבלת זרמי האוויר המסתובבים מהסביבה, גם כדי למנוע אידוי לא הומוגני, במיוחד בין פני השטח של הדגימה לשכבות התוך-גופיות.

חומרי ניגוד רבים שימשו בעבר להדמיית מיקרו-CT של רקמות רכות. הנפוצים ביותר הם יוד, חומצה פוספוטונגסטית (PTA) ו- PMA. יוד במיוחד הועסק בשל קצב דיפוזיה גבוה יותר של 34,37,38. עם זאת, יוד משמש כזרז לסילילציה של מגיב HMDS³⁶. התגובה המואצת היא אגרסיבית ואקסותרמית, עם סיכון גבוה להרס הדגימה וסיכון בטיחותי אם שאריות HMDS יישארו עקב ייבוש לא שלם של הדגימה. גם PTA וגם PMA המומסים באתנול יכולים לשמש בבטחה בשילוב עם HMDS. הודגם כי PTA ו-PMA מספקים כוח פתרון גדול יותר של מבנים עדינים בדיסקים בין-חולייתיים שאינם ממובנים בהשוואה לכתמי יוד³⁸. בהדמיית microCT של דגימות יונקים, PTA ו- PMA שימשו להכתמת עוברי עכברים³⁹, מערכת לב וכלי דם של עכבר³⁷, שריר ארנב ומוח⁴⁰, וורידים חזיריים⁴¹. ל-PTA יש מסה מולקולרית גבוהה יותר וצפיפות גבוהה יותר בתמיסה מאשר ל-PMA. זאת, בין היתר, בשל מסה אטומית גבוהה יותר של טונגסטן (המספר האטומי הוא 74 גרם/מול), היסוד המחליש העיקרי ב-PTA. לשם השוואה, ליסוד הכבד ביותר ב-PMA, מוליבדן, יש מספר אטומי של 42 גרם/מול. הן המסה האטומית והן צפיפות הדגימה עומדות בבסיס הנחתת קרני הרנטגן, בנוסף לעובי הדגימה⁴². הגדלת אורך נתיב הרנטגן על ידי הגדלת גודל המדגם, הנחתת קרני רנטגן הופכת רגישה יותר לצפיפות דגימה מוגברת. לכן, סוכן הניגודיות PMA בצפיפות נמוכה יותר נבחר כדי להפחית את הסיכון להנחתת יתר ולייעל את הטווח הדינמי של ניגודיות התמונה עבור לבבות בקנה מידה דמוי אדם. ראיות נוספות הראו כי העמסת דיפוזיה של PMA מעניקה יותר כתמים הומוגניים מאשר עבור המולקולה הגדולה יותר PTA ברקמת הלב⁴³.

השיטה של העברת חומרי ניגוד משפיעה על האחידות של התפלגות חומרי הניגוד ברקמת הלב (איור 3). זלוף של חומרי ניגוד בלב מיובש באתנול הראה רמות צביעת רקע מטושטשות של PMA עקב עמידות משתנה של כלי הדם. בלב המיובש באוויר, המבנה הלמינרי של השריר מודגש על ידי תהליך ההתייבשות לדוגמה, מה שמגדיל את ההפרדה הלמינרית של השרירים. זה שיפר בסופו של דבר את החדירות הכוללת של הרקמה להעמסה של חומר ניגוד מבוסס דיפוזיה. כתוצאה מכך, ייבוש האוויר הקל על רקמות: ניגודיות אוויר ברמה הלמינרית והתוך-למינרית (איור 4). יתר על כן, ניתן להקל עוד יותר על טעינת דיפוזיה על ידי יישום תחת ואקום. עוד הוכח כי התכווצות רקמות של דגימות לא מיובשות תלויה בריכוז חומר הניגוד⁴⁰. עם זאת, ייצוב מורפולוגי קודם של הדגימה על ידי ייבוש אוויר מעכב את השפעות התכווצות הרקמות²⁹.

תמונות microCT ברזולוציה גבוהה של איברים שלמים מייצרות מטבען נפחי נתונים גדולים. האופי של טכניקות הדמיה טומוגרפיות מאפשר הדמיה וטיפול בתמונות על בסיס פרוסה אחר פרוסה, מה שמקל על עיבוד המחשב ועל עומס הזיכרון. עם זאת, כדי להמחיש ערימות תמונה תלת-ממדיות, לדוגמה, כדי לעבד נפחי דגימה בייצוגים תלת-ממדיים, מפרטי המחשב המינימליים המומלצים הם זיכרון RAM של 128 GB ומהירות מעבד של 3 GHz. כוננים קשיחים במצב מוצק גם שיפרו מאוד את העברת הנתונים.

הופעתה של הדמיית microCT בתחום הלב מעניקה יתרונות רבים למחקרים תרגומיים ולאימות קליני. היתרונות של ההדמיה התלת-ממדית והמיקרומטרית שלה כבר הראו יישומים בקביעת הנטל הטרומבוטי של חולי איסכמיה שריר הלב בגובה ST^44,45. מיפוי מקורות פוטנציאליים של הפרעות קצב בחולי מחלות לב מבניות תלוי במידה רבה בקביעת התפלגות רקמת הצלקת הפיברוטית ובמיקום מסלולים שזורים של שריר הלב ששרד. גישות קו שני לאבחון הפרעות קצב חדריות משתמשות בהדמיית תהודה מגנטית⁴⁶. הוא יכול למקם בחוזקה פיברוזיס צפוף אך הוא מוגבל לאפיון מורפולוגי ברזולוציה נמוכה ומציע תובנה מוגבלת לגבי שיפוץ מיקרו-סטרוקטורלי והתפלגויות מפוזרות של נגעים פיברוטיים⁴⁷. לבחינה ברזולוציה גבוהה של הפצת צלקות ואפיון יש פוטנציאל עצום לשיפור ההבנה שלנו לגבי שיפוץ מבני לב והסיכון לפתח אי ספיקת לב. במיוחד, מחקרים בסיסיים או מחקרים שלאחר המוות ייהנו מתמונות מבניות מאומתות למיפוי חשמלי של הפרעות קצב לב.

לסיכום, לבבות מחוזקים בטיפול HMDS ובייבוש אוויר יכולים לאחר מכן להיות מוכתמים בחומר ניגוד רנטגן כדי לשפר את הנחתת קרני הרנטגן של רכיבים חוץ-תאיים. באופן ספציפי, בשריר הלב בריא, הצטברות PMA מתרחשת באפיתל, רקמה וולוולרית ותאים של מערכת ההולכה החדרית הנשענת על ידי רקמת חיבור וכתוצאה מכך הנחתת קרני רנטגן משופרת. יתר על כן, במחלה מבנית של שריר הלב, ניגודיות משופרת הייתה סלקטיבית עוד יותר עבור פיברוזיס.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% neutral buffered formalin	Diapath	F0043
Calcium chloride solution	Honeywell	21114
Canulation Tubing PTFE	VWR	DENE3400102
Constant Head 1L Reservoir	Harvard Apparatus	50-0496
D-(+)-Glucose	Sigma	G5767
Ethanol absolute	VWR	20821.330
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	796881
Heparin sodium (5000 U/mL)	Panpharma	3400891287301.
Hexamethyldisilazane (HMDS)	Sigma	440191-1L
Hydrochloric acid, ACS reagent, 37%	Sigma	258148
Magnesium chloride solution	Honeywell	63020
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma	P5368
Phosphomolybdic acid hydrate	Fisher Scientific	417895000
Potassium Chloride	Sigma	P5405
Pump Tubing, 3-Stop	Ismatec	FV-96328-48
SkyScan, 1276	Bruker		micro CT
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761
Sodium Chloride	Sigma	S3014
Sodium hydroxide solution 50% in H2O	Sigma	415413
Tube Connector Kits	Harvard Apparatus	72-1407
Tubing pump	Ismatec	ISM 1089
Tubing Tygon R-3603 1.6 mm 3.2 mm 0.8 mm	VWR	228-1279
Tubing Tygon R-3603 3.2 mm 4.8 mm 0.8 mm	VWR	228-1283
Two-part single-use syringes 50 mL	Norm-Ject	4850001000	Pyrogen-free, PVC-free