만성 질환을 앓고 있는 대형 포유류 심장 모델의 콘트라스트 강화 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 이미징을 위한 조직 준비 기술

요약

여기에서, 우리는 콜라겐 선택적 조영 증진과 함께 건강하고 병리학적인 큰 포유동물 전심의 고해상도 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 이미지를 얻기 위한 프로토콜을 제시한다.

초록

구조 리모델링은 심장에 부과 된 만성 병리학 적 스트레스의 일반적인 결과입니다. 병든 조직의 건축 및 구성 특성을 이해하는 것은 부정맥 행동과의 상호 작용을 결정하는 데 중요합니다. 임상 해상도보다 낮은 마이크로 스케일 조직 리모델링은 젊은 성인에서 높은 유병률과 함께 치명적인 부정맥의 중요한 원천으로 부상하고 있습니다. 대형 포유류 전심과 같은 전임상 모델에 대해 충분한 마이크로 스케일 해상도로 높은 이미징 콘트라스트를 얻는 데 과제가 남아 있습니다. 더욱이, 조직 조성-입체 고해상도 이미징을 위한 선택적 콘트라스트 향상은 여전히 부족하다. 마이크로 컴퓨터 단층 촬영을 사용한 비파괴 이미징은 고해상도 이미징에 대한 약속을 보여줍니다. 목표는 대규모 생물학적 샘플에서 감쇠에 대한 X 선으로 인한 고통을 완화하는 것이 었습니다. 심장은 건강한 돼지(N=2)와 양(N=2)으로부터 추출되었으며, 만성 심근경색 및 섬유성 흉터 형성을 유도하거나 만성 심방세동을 유발하였다. 적출된 심장은 칼슘 이온 담금질제 및 혈관확장제로 보충된 식염수 용액, 연속 탈수의 에탄올, 진공 하에 헥사메틸디실리잔으로 관류되었다. 후자는 1 주 동안 공기 건조 중에 심장 구조를 강화했습니다. 콜라겐-우성 조직은 X선 조영증강제인 포스포몰리브덴산에 의해 선택적으로 결합되었다. 조직 입체 형태는 공기 중에서 안정하였고, 고해상도(등방성 20.7 μm) 이미지를 얻기 위해 장기간 마이크로컴퓨터 단층 촬영 획득을 허용하였다. 확산에 의한 최적의 조영제 로딩은 건강한 돼지 심실에서 상피층 및 심내막 이하 Purkinje 섬유의 선택적 조영제 증진을 나타냈다. 심방 세동 (AF) 심장은 더 큰 콜라겐 함량에 기인하여 심방의 후벽과 부속기에서 향상된 대조 축적을 보였다. 심근 경색 심장은 심장 섬유증의 영역에서 선택적으로 증가 된 대조를 보여 주었고, 이는 생존 한 심근 근육 섬유의 엮임새를 식별 할 수있게했습니다. 콘트라스트-강화된 공기-건조된 조직 제제는 무손상 대형 포유동물 심장의 마이크로스케일 이미징 및 기저 질환 구성성분의 선택적 콘트라스트 증진을 가능하게 하였다.

서문

구조적 심장 질환은 전 세계적으로 심장 관련 사망률의 대부분을 차지합니다¹. 심장 구조의 리모델링은 심근 환경과 간질 공간에 영향을 미칩니다. 심장 전기 및 기계적 기능 모두 근세포 조직에 달려 있기 때문에 혼란은 참을 수없는 심장 부정맥, 손상된 혈액 펌핑 작용 및 심부전 2,3,4,5,6,7,8,9로 이어질 수 있습니다. 구조적 심장 질환에 대한 치료 요법의 개발은 질병 유병률 ^2,5보다 훨씬 큽니다. 이와 같이, 심장 부정맥의 해부학 형태학적 프로파일과 그로 인한 발병기전을 더 잘 이해하기 위해 구조적 심장 질환의 전임상 모델의 증가가 증가하고 있다 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20^{, 21,22,23}. 구조적 질환 스펙트럼을 가로질러 관찰되는 것은 간질성 섬유증의 상향조절이고, 허혈 관련 경우에서, 섬유증 및 지방 조직에 의한 심근 치환(¹⁸)에서 더욱 흔하게 관찰된다. 병리학적 세포외 성분의 형태학적 이해는 부정맥의 잠재적 기질의 식별을 가능하게 할 수 있다. 질병의 분포와 정도는 부정맥 유발 위험에 대한 강력한 지표를 제공합니다. 그러나 손상되지 않은 심장에 매크로 및 마이크로 스케일을 통합하여 질병 프로파일을 종합적으로 이미지화하는 데는 여전히 과제가 남아 있습니다.

X선을 기반으로 한 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (microCT)은 조영제를 사용하여 연질 생물 조직 미세 구조를 조사하는 강력한 도구로 부상하고 있습니다. 작은 설치류 24,25,26 및 큰 포유류 심장으로부터의 작은 해부 샘플(^27,28)로부터의 심장에 대해 매우 상세한 해부학적 지도가 얻어졌다. 그러나, 큰 포유동물 심장의 전체 기관 수준에서의 이미징은 기존의 조직 준비 기술을 사용하여 X선 광자가 감쇠되는 과도한 경로 길이를 제시한다. 이것은 조직을 대조 로딩하고 획득 동안 조영제 용매에 샘플을 침지시키는 것을 포함한다. 표본 크기 및 분해능을 늘리면 총 수집 시간이 연장됩니다. 따라서 조직 안정성은 사용 가능한 이미지 재구성에 매우 중요하며, 이는 건조로 인한 조직 변형을 방지해야 함을 의미합니다. 그러나 침지 유체의 사용은 단점을 갖는다: (i) 전체 배경 신호 강도는 무시할 수 없게 되고, (ii) 조직-결합된 대조 분자의 희석을 촉진한다. 이 두 가지 요인 모두 이미지 대비를 낮추는 데 기여합니다.

이 연구는 배경 광자 감쇠를 완화하고 대조 강화제에 의해 제공되는 동적 범위를 최적화하는 새로운 조직 처리 파이프 라인을 자세히 설명합니다. 조직 변형(²⁹)을 제한하기 위해 화학적 조직 강화와 함께 조직 공기 건조 접근법을 사용하는 것이 제안된다. 따라서 조직 샘플은 긴 획득을 위해 공기 중에서 안정적으로 유지되고 침지 유체에서 배경 기여를 생략 할 수 있습니다. 이 방법론 파이프 라인은 다음을 제공합니다 : (i) 전체 돼지 심장을 사용하여 최적화 된 포괄적 인 조직 처리 및 이미징 프로토콜; (ii) 대조 농도 및 로딩 기술의 평가 및, (iii) 양 심장에서의 심방 세동 및 심근 경색의 두 가지 별개의 만성 질환 모델에서이 파이프 라인의 적용. 만성 질환 모델의 개발은 각각의 만성 심장 질환 모델, 경피 관상동맥 색전술(¹³ ) 및 자가지지 심방세동(³⁰)에 의해 유도되는 심근경색에 대해 다른 곳에서 설명되었다.

프로토콜

모든 실험은 과학적 목적으로 사용되는 동물 보호에 관한 유럽 의회의 지침 2010/63/EU의 지침에 따라 수행되었습니다. 동물 프로토콜은 보르도 대학의 지역 윤리위원회 (CEEA50)에 의해 승인되었습니다. 심장은 (i) 건강한 대형 흰 돼지(N=2, 2개월령)를 포함하는 세 개의 대형 포유동물 모델로부터 공급되었다; (ii) 심근경색이 유발된 양(N=1, 2세)¹³ 및 (iii) 심방세동이 유발된 양(N=1, 7세)(³⁰).

1. 솔루션 준비 :

1. 심흉 용액: 증류수 3L를 준비하고 염화나트륨(110mM), 염화칼륨(16mM), 중탄산나트륨(10mM), D-(+)-포도당(9mM), 염화칼슘 용액(1.2mM) 및 염화마그네슘 용액(16mM)을 첨가한다. 마지막에 500 μL / L의 헤파린 나트륨을 첨가하십시오. 이 용액을 4°C에서 보존하십시오.
2. 인산염 완충 식염수 - EDTA 용액 (PBS-EDTA).
   1. 먼저, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 증류수 1 L에 첨가하여 최종 농도 10 mM을 한다. EDTA를 용해시키기 위해 수산화나트륨 용액 (1 M)을 사용하여 용액 pH를 12로 증가시키고 유지한다.
   2. EDTA가 완전히 용해되면 염산을 사용하여 pH를 7.4로 낮춥니다. 인산염 완충 식염수의 호일 파우치 하나를 첨가하여 0.01 M (염화나트륨, 0.138 M; 염화칼륨, 0.0027 M) 및 pH 7.4에서 용액을 얻었다. 이 용액을 실온 (RT)에서 보존하십시오.
3. 에탄올 - 포스포몰리브덴산(PMA) 조영제 용액: 무수 에탄올 1 L를 준비하고 PMA를 첨가하여 1% 농도로 용액을 얻는다. RT에서 이 솔루션을 보존하십시오.

2. 조직의 근원

1. 동물을 안락사시키고 지역 윤리 지침에 따라 심장을 추출하십시오. 심장을 차가운 심흉막 용액에 빠르게 담그고 심실을 부드럽게 마사지하여 초기 헹굼을 하십시오.
2. 대동맥 아치 아래의 대동맥을 자르고 바늘 홀더를 사용하여 동맥 벽의 양면을 클램프하십시오.
3. 바늘 홀더에 의해 심장을 일시 중지하고, 대동맥 캐뉼라를 대동맥 뿌리에 삽입하고, 대동맥 판막과 접촉하거나 돌출되지 않도록주의하십시오. 캐뉼라 높이의 대동맥 아치 주위에 0 게이지 봉합사를 감싸고 캐뉼라를 단단히 묶습니다.
4. 50 mL 주사기를 사용하여 차가운 (4 °C) 심흉막 용액 200 mL를 주입하십시오. 폐정맥을 통해 배출되도록 심장을 후방으로 기울여 충치의 과도한 혈액 풀링을 제거하십시오.
5. 헹군 심장을 담그고 해부 준비가 될 때까지 얼음에 저장된 차가운 심흉막 용액에 보관하십시오.

3. 조직 준비 :

1. 해부 접시 위에 80cm 위에 지지된 1L 저장고를 준비합니다. 길이 80cm, 내부 직경 3.2mm, 외부 직경 4.8mm의 열가소성 튜브를 저장소의 드레인 포트에 연결합니다.
2. 배수 튜브에 3방향 탭을 고정하고 추가 열가소성 튜브(20cm, 1.6mm 내부 직경 및 3.2mm 외부 직경)를 3방향 탭의 각 자유 포트에 결합합니다. 튜브의 요금 끝까지 양방향 탭을 수정합니다.
3. 헤파린 (2500 단위)으로 보충 된 심막 용액으로 저수지를 채 웁니다. 심흉막 용액이 모든 기포를 배출하고 제거 할 수 있도록 탭을 연 다음 양방향 탭을 닫으십시오.
4. 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 튜브(내부 직경 1mm 및 외경 2mm)를 사용하여 왼쪽 및 오른쪽 관상동맥 오스티아용 캐뉼러를 준비합니다.
   1. 튜브 5cm를 자르고 팁을 벌거 벗은 불꽃 옆에 놓아 한쪽 끝을 가열하십시오. 팁의 1mm가 녹기 시작하고 반투명이되면 팁을 단단한 내열성 표면에 대고 눌러 캐뉼러 팁에서 능선을 형성하여 캐뉼러가 용기에서 미끄러지는 것을 방지하십시오.
   2. 각 캐뉼라의 가열되지 않은 끝 1cm를 배수 저장고 배수 튜브의 두 끝에 삽입하십시오.
5. 대동맥 캐뉼라를 제거하십시오. 차가운 심흉막 용액 아래에서 관상 동맥의 왼쪽 및 오른쪽 골수를 현지화하십시오.
6. 뾰족한 가위를 사용하여 관상 동맥 혈관 아래의 0G 실크 봉합사를 나사로 묶을 수 있도록 관상 동맥 타조 위아래의 주변 조직에서 대동맥 뿌리를 조심스럽게 분리하십시오.
7. 양방향 탭을 열고 캐뉼러 팁을 관상 동맥 골막에 삽입하십시오. 캐뉼러 팁이 ostia로 1-2cm를 뻗어 봉합사 배치를 넘어 캐뉼라를 묶습니다.
8. 심장이 혈액이 제거 될 때까지 15 분 동안 심실을 부드럽게 마사지하면서 심장을 헹구십시오.
9. 헹굼 후 양방향 탭을 닫고 세 방향 탭에서 분리하십시오. 심장을 PBS-EDTA 용액 500 mL가 들어있는 1 L 플라스틱 내화학성 용기로 옮긴다.
10. PBS-EDTA 용액을 흄 후드 하에서 열가소성 튜빙 내의 PBS-EDTA 용액을 두 개의 채널을 갖는 연동 펌프를 사용하여 재순환시킨다. 튜브에 기포가 없을 때까지 펌프 튜브를 프라임한 다음 RT에서 80mL/min에서 2시간 동안 재순환하여 각 관상동맥 캐뉼러를 관류합니다.
11. 흄 후드가 작동하는지 확인하십시오. 펌프를 멈추고 용기에서 용액을 배출 한 다음 포르말린 (10 %)으로 교체하여 RT에서 80 mL / min으로 1 시간 동안 고정하십시오.
12. 포르말린 용액을 PBS로 교체하여 고정제를 각각 80 mL/분으로 15분 동안 세 번 헹구었다.

4. 조직 탈수 및 건조:

참고: 동일한 관류 속도(80 mL/분)를 사용하고 조직이 전체적으로 RT에 유지되도록 하십시오.

1. PBS 용액을 20 %의 에탄올로 교체하고, 초순수에 희석하고, 최소 3 시간 동안 관류시킨다.
2. 일련의 에탄올 농도 증가를 사용하여 심장을 관류하십시오.
   1. 먼저 20% 에탄올 용액을 30%로 희석된 에탄올로 교체하고 2시간 동안 퍼퓨즈한다.
   2. 각 단계에서 1 h의 최소 지속기간 동안 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 95%, 90%, 95%, 99%, 및 100%를 통해 각 반복에서 에탄올 농도를 증가시킴으로써 관류를 반복한다.
      참고: 심장 샘플은 해당 농도에 대해 15분의 최소 관류가 발생한 경우 에탄올 희석액에서 하룻밤 사이에 관류 흐름 없이 휴식을 취할 수 있습니다.
3. 선택 사항: 관류를 통해 조영제를 바르는 경우, 조영제 PMA가 보충된 100% 에탄올, 48시간 동안 1%로 심장을 정류하십시오. 조영제를 2 시간 동안 100 % 에탄올로 관류하여 헹구십시오.
4. 공기 건조 전에 심장 조직을 강화하려면 에탄올과 헥사메틸디실라잔(HMDS)을 50:50 혼합하여 10분 동안 재순환시킨다. 이것을 100 % HMDS로 2 시간 더 수행하십시오.
   주의: HMDS는 독성이 강하고 독성이 강한 물질입니다. 암모니아의 강한 냄새가 공기와 접촉하여 방출됩니다. 더욱이, HMDS의 액체 형태는 고도로 휘발성이고 요오드 함유 제제에 의해 촉매된다.
5. 튜브에서 캐뉼라를 분리하고 흄 후드 내부의 대동맥 봉합사에서 심장을 일시 중단하십시오.
6. 지퍼 잠금 가방을 심장 위로 조심스럽게 밀고 봉합사 위에 가방 씰을 닫아 순환하는 공기에 심장이 노출되는 것을 줄입니다. 심장이 1 주 동안 증발을 통해 건조되도록하십시오.
7. 선택 사항: 확산 로딩 조영제의 경우, 교반하면서 100% 에탄올로 15분 동안 심장을 세척하십시오. 심장을 PMA가 보충된 100% 에탄올에 담그고, 1%, 진공 하에서 48시간 동안 담그십시오. 4.6단계를 반복합니다.

5. 마이크로 CT :

참고: 데스크탑 X선 microCT 시스템이 돼지 심장을 이미징하는 데 사용되었습니다.

1. 공기 건조된 심장을 적절한 샘플 홀더에 장착합니다. 시료 홀더에 고정된 클램프를 사용하여 X선 microCT 측정 중 어떠한 움직임도 방지하고 건조되고 단단한 대동맥을 통해 심장을 고정시킵니다.
2. 심장 샘플의 중심을 세로 축을 따라 0° 및 90° 회전 각도에 대해 이미징 시야각의 중심과 꼼꼼하게 정렬합니다. 모든 방향에서 이를 달성하려면 샘플 지지대에 고정된 대동맥 클램프를 통해 심장을 공기 중에 일시 중단하십시오.
3. 소프트웨어를 열고 X선 microCT 시스템을 시작한 후 X선 필터 알루미늄, 1mm, X선 소스 전압을 60kV, 전류를 120μA로 적용합니다. 이미지 치수를 2016 x 1344픽셀로, 픽셀 크기를 20μm로 설정합니다.
4. 샘플 홀더를 시야각에서 후퇴시키고 플랫 필드 보정을 얻어 배경 이미지 및 X선 노출 시간을 보정합니다. 평균 배경 X선 투과율이 80%보다 큰지 확인하십시오.
5. 지지대의 길이를 따라 스카우트 X선 전송 영상을 전송하여 심장의 세로축에서 전체 영상 촬영장을 결정한다. 스캔의 경우 0.18°의 회전 단계, 평균 5의 프레임 및 180°의 샘플 회전을 사용합니다. 오프셋 스캔 모드를 선택하여 샘플 지원의 전체 너비를 이미지화합니다.
   참고: 이 섹션에 표시된 획득 매개 변수는 앙상블 하트 컴포지션의 이미지 품질을 최적화하기 위해 선택되었습니다.
6. 스캔 후, 등방성 입체 이미지 볼륨의 단층 촬영 재구성을 위해 소프트웨어를 사용합니다. NRecon 소프트웨어를 적용하려면 10%의 빔 경화 효과와 8의 링 아티팩트 감소를 포함한 획득 관련 아티팩트 보정을 사용하십시오.
7. 데이터 저장 제한을 최적화하려면 하트별 이미지 복셀을 포함하는 최소 직사각형 관심 영역을 적용합니다. 이미지를 8비트 비트맵 형식으로 이미지 스택으로 내보냅니다.
8. DataViewer 소프트웨어를 사용하여 재구성된 데이터 스택을 시각화합니다. 이미지 경계 내에서 샘플의 디지털 방향을 지정하여 샘플의 긴 축과 짧은 축을 이미지 볼륨의 세 가지 주 축으로 다시 정렬합니다.
9. 세 축 모두에서 이미지 볼륨을 잘라내어 이미지의 외부 배경 레이어를 제거하여 전체 이미지 크기를 최대한 줄입니다.

결과

탈수 및 공기 건조 방법을 사용하여 큰 포유류 심장을 준비하면 샘플에서 모든 수분 함량이 제거됩니다. 에탄올에 의한 불충분한 물 대체의 증거는 HMDS 로딩 동안 관찰될 수 있다(프로토콜, 단계 4.4 참조). HMDS 아래에 물이 존재하면 조직에서 거품이 생깁니다. 과도한 수위의 경우, 침지 유체의 온도 상승이 발생할 수 있습니다. 초기 HMDS 로딩 동안 침지 챔버를 얼음으로 둘러싸여 유지하면 조직 가열의 부작용을 줄일 수 있습니다. 조영제가 없을 때 심장을 공기 건조시킨 후 샘플은 흰색으로 나타납니다 (프로토콜, 단계 4.6 참조). 외부 표면은 종종 교내 층 이전에 건조되고 구조적으로 안정하였다. 조영제 로딩 전에 에탄올로 헹구면 백색 침전물이 제거되었다(프로토콜, 단계 4.7 참조). 날카로운 칼날을 사용하여 조직을 통해 슬라이싱하면 거시적으로 개별 근육 섬유가 명확하게 분리되어 나타납니다. 심장 샘플을 조영제 매질에 침지함으로써 대조 로딩은 샘플의 두껍고 고도로 근육질의 영역에서 확산 한계 아티팩트로 고통 받았다. 진공 하에서의 확산 대조 로딩은 근육에서 보다 균질한 착색을 제공하였다(심장 샘플 #1, 조영제 로딩 시간에 대해서는 표 1 참조). 거시적으로, 표면 조영제 분포는 주로 세포외 성분, 특히 지방과 결합 조직으로 구성된 심장 근육과 영역 사이의 균질한 염색을 나타냈다. 조영제 로딩 전 또는 후에 공기 건조된 조직 샘플은 안정적인 구조적 무결성을 유지했습니다.

상기 언급된 스캐닝 파라미터 및 1700 ms의 노출 시간을 사용하여 microCT 하에서 20 μm 분해능에서 샘플의 전체 폭을 스캔하는데 필요한 시간은 6 h 34 분이었다. 스캐너의 갠트리 축에 있는 샘플의 크기에 따라 이 지속 시간에는 시편의 전체 길이를 캡처하는 데 필요한 위치 수를 곱했습니다. 이 연구에서 돼지와 양 심장의 경우, 서너 개의 위치가 사용되었습니다. NRecon 소프트웨어는 다중 위치 및 오프셋 스캔을 타일링하여 X선 소스 및 검출기의 각 회전 단계에 대해 단일 X선 프로젝션 이미지를 형성했습니다. 총 1000개의 프로젝션이 16비트 이미지로 저장되어 30-40GB의 데이터가 생성됩니다. 재구성 된 체적 이미지는 52-70GB였습니다.

심실 충치, 중격 및 심실의 자유 벽을 포함한 주요 해부학 적 랜드 마크는 확산 로딩에 의해 조영제로 염색 된 공기 건조 돼지 심장의 X 선 투과 영상에서 쉽게 식별 할 수있었습니다 (그림 1A). 또한, 심근 섬유 방향과 같은 미세 구조 조직을 나타내는 높은 질감 영역도 민감한 X선 감쇠/투과로 인해 관찰되었다(그림 1B). 입체 이미지 볼륨의 단층 구조 재구성은 심외막 및 내피 경계 모두에서 조직과 배경 사이의 뚜렷한 분리를 보였다 (그림 1D). 교내, 낮은 콘트라스트 및 복셀 강도 확산 구배가 조직의 두꺼운 교내 영역 전체에 걸쳐 관찰되었다. 그럼에도 불구하고, 절단 평면에 의해 분리 된 혈관 구조 및 심근 섬유는 여전히 쉽게 식별 할 수있었습니다. 콘트라스트의 두 번째 더 높은 강도 대역폭은 epicardial-most 층과 펑크가 있는 서브-심내막 영역에서 관찰되었다. 콘트라스트 향상은 세포외 성분이 축적된 부위, 특히 심외막 결합 조직, 심외막 지방 및 Purkinje 섬유 네트워크의 결합 조직 외피에서 가장 컸다. 복셀 신호 강도 분포는 제로 강도 배경(공기)과 저대비 및 고대비 조직의 두 우세한 집단으로부터 높은 분리를 보였다(도 1D).

microCT 이미지 재구성의 콘트라스트 향상 및 심장 샘플의 콜라겐 구획에 대한 선택성을 검증하기 위해, 조직학, 밝은 필드 현미경 및 형광 현미경이 채택되었다(도 2). 사전 조영제 없이 공기-건조된 심장으로부터의 심실 조직의 경막 블록-로딩을 위해 파라핀 임베딩 및 절편화를 위해 준비하였다. 현미경 슬라이드에 장착된 인접한 조직 조각은 Masson의 삼색 염색, 무처리 또는 48시간의 PMA(1%)에 의해 처리되었다. 슬라이드 장착형 조직 절편의 침지는 전심 샘플에서 관찰되었던 염색 과정의 확산 구배 효과를 제거하였다. Mason의 삼색 염색은 상피 및 내피층, 심외막 하위조직에서의 심혈관주위, 및 좌심실 내로 돌출된 자유 실행 Purkinje 섬유를 둘러싸는 결합 조직 시스에서 콜라겐 양성 염색을 나타냈다(도 2A). 밝은 장 조명은 PMA 염색 후 콜라겐 구조에서 더 어두운 착색을 보여 PMA의 우선적 인 축적을 지원했습니다 (그림 2B, C). 더욱이, PMA 처리는 이전에 콜라겐 거대분자 복합체(³¹)의 자가형광을 켄칭하는 것으로 나타났다. 심실 조직 절편의 형광 이미지는 콜라겐 부위에서 PMA 유도된 형광 손실을 가졌다(도 2D vs. 2E, 도 2D' 대 2E' 및 도 2D'' vs. 2E''). 밝은 필드 및 형광 이미징 둘 다에서, 세포 구획은 PMA 처리에 의해 변경되지 않았으며, 콜라겐은 PMA 염색 및 자가형광의 담금질의 선택적 축적을 가졌다.

심장 샘플 #2는 공기 건조 전에 관류를 통해 조영제로 염색되었다. 이미지 재구성은 심근 구획 내에서 매우 패치가 많은 염색을 나타냈다 (그림 3A). 콘트라스트 증진은 조직 조성의 선택적이지 않은 것으로 나타났고, 심외막 또는 심내막 하위에서의 신호 강도의 더 이상의 향상은 없었다. 더욱이, 낮은 콘트라스트 조직은 배경 강도로부터 불량한 분리를 보였다 (도 3B).

심실 섬유증은 심근 경색 및 만성 허혈에 의해 유도되었다(심장 샘플 #3). 전방 정점 흉터는 혈관 색전술 부위까지 조직 하류의 섬유질 지방 침착물로 근세포를 대체함으로써 형성되었다. 심장 샘플 #3을 제조하고 전방 좌심실, 중격 및 우심실 자유 벽을 덮는 해부된 심실 쐐기로부터 이미지화하였다. 이 심실 쐐기 구성의 준비는 이전에 설명되었으며(³²) 심장 영상화를 위한 쐐기의 적용이 상세히 검토되었다⁽³³). 흉터 형태학은 경막이지만 이질적이었다(도 4). 중앙 조밀한 섬유성 병변은 느슨하고 이질적인 경계 구역으로 둘러싸였다(도 4A). 심실 제제를 확산-로딩 후 공기 건조 및 진공에서 염색하였다. 도 4B-E는 조직 경계 및 흉터 영역에서 재구성된 microCT 이미지 부피의 가장 큰 신호 강도를 보여준다. 조영제는 건강한 심근을 제대로 염색하지 못했지만 미세한 구조적 조영제는 유지되었다(도 4C'). 국경 지대에서, 흉터 조직은 생존한 심근으로 산재되었다(그림 4D'). 조밀한 섬유증은 경막이면서도 질감이 있는 것으로 나타나 조성의 차이를 나타낸다(도 4E'). 공기 건조 및 PMA 염색된 조직 제제의 경벽 좌심실 영역의 조직 절편을 마손의 삼색 염색과 비교하여 병리학적 조직에서 콜라겐에 대한 PMA 선택성을 검증하기 위해 사용하였다(도 4F). PMA 염색은 콜라겐 (서브 심막 및 서브 심내막) 및 생존 심근의 영역에 부재에 대해 선택적이었다 (도 4G).

유도된 지속성 심방세동을 갖는 심장 샘플 #4는 심방강의 천연 형태를 보존하면서 공기-건조되었다. 심방 부속기 붕괴는 관찰되지 않았다. 주요 해부학 적 랜드 마크는 재구성 된 이미지 (심방 중격, 펙티네이트 근육, 관상 동맥 부비동, 폐정맥 ostia, vena cava 및 cristae terminalis)에서 형태 학적으로 식별 될 수 있습니다. 진공 하에서의 확산 염색은 대동맥 뿌리 및 방실 판막 및 작동 심근의 개별 영역에서 대비 향상을 가져 왔습니다. 근육 염색 증진은 왼쪽 및 오른쪽 심방 양쪽 심방의 심방 부속기 및 후방 벽으로 제한되었다 (그림 5).

그림 1: 진공 하에서 확산시켜 PMA 조영제로 처리된 공기 건조된 돼지 심장의 MicroCT 영상 . (A) X선 투사 이미지. (B) A. (C)에서 적색 선으로부터 추출된 전송 프로파일로서, 단층적으로 재구성된 입체 체적으로부터 심실의 단축 슬라이스. 노란색 화살표는 심내막 이하 Purkinje 섬유에 기인하는 대조의 펑크 영역을 나타냅니다. 파란색 화살표는 혈관 조직을 나타냅니다. (d) C. LV:좌심실 및 RV: 우심실에 도시된 재구성된 이미지 슬라이스의 신호 강도 분포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 콜라겐에 대한 PMA 선택성의 검증 . (A) 공기 건조된 심장의 심실에서 경막 조직 절편의 Masson의 삼색 염색. 심근은 빨간색으로 염색되고 콜라겐은 녹색 착색으로 표시됩니다. 인접 조직 절편을 (B) 염색하지 않거나 (C) PMA로 염색(1%)하여 착색의 균일성을 평가하기 위해 밝은 전계 조명으로 영상화하였다. (d) PMA로 염색하거나 (E) 염색하지 않은 조직 절편을 형광 현미경으로 영상화하였다. 패널 D ' (솔리드 레드 박스) 및 E' (파선 레드 박스)는 염색되지 않은 및 PMA 염색 된 섹션에 대한 서브 심막의 확대 뷰입니다. 패널 D ' (단색 파란색 상자) 및 E'' (점선 파란색 상자)는 서브 심내막 및 자유 실행 Purkinje 섬유의 상응하는 확대 뷰입니다. 화살표는 콜라겐 함량의 부위를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 공기 건조 및 MicroCT 이미징 전에 PMA의 관류 로딩 . (A) 돼지 심장으로부터 심실의 재구성된 이미지 부피의 단축 슬라이스. 파란색 화살표는 혈관 조직을 나타냅니다. (B) 패널 A로부터의 이미지 슬라이스의 신호 세기 분포. LV : 좌심실 및 RV : 우심실. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 4: 만성 심근경색증을 앓고 있는 양 심장의 MicroCT 영상. (A) 정점 부위에 조밀한 흉터가 형성되었다(삽입 사진 참조). 심내막 관점에서 정점 영역의 볼륨 렌더링은 이미지 강도 (흉터 조직에 해당하는 빨간색과 녹색의 심근에 해당하는 빨간색)에 따라 착색을 할당했습니다. 그레이스케일 강도의 직교 조각은 조밀 한 흉터 분포와 생존 심근과 경계를 보여줍니다. 섬유성 조직과 심근 사이의 분리는 지방 조직의 영역에 해당한다. (B) 심근경색 후 정점 흉터가 있는 양에서 공기 건조된 심실 쐐기 준비 사진. 재구성된 microCT 이미지 부피의 경사 슬라이스는 (C) 혈관 폐색 부위(패널 B에서 C-적색 선), (D) 조밀한 흉터와 건강한 심근을 경계하는 경색 주위 영역(패널 B의 D-청색 선) 및 (E) 조밀한 섬유증의 영역(패널 B의 E-녹색 선)에 대한 기저부와 정점 및 근위 사이의 중간 수준에서 심실을 횡단한다. (C') C의 빨간색 점선 상자로 윤곽이 그려진 중격 영역의 확장된 보기입니다. (D') 우심실 정점의 경색 영역의 확장 된 전망 (패널 D의 파란색 점선 상자). (E') 좌심실 정점의 경색 영역의 확장 된 전망 (패널 E의 녹색 점선 상자). LV: 좌심실강; RV: 우심실 강; MB: 사회자 밴드; Pap: 유두 근육. 노란색 화살표는 왼쪽 전방 내림차순 동맥을 나타냅니다. (f) PMA 염색된 공기로부터 절단된 조직학적 절편의 마손의 삼색 염색-건조된 좌심실. 콜라겐은 파란색으로 염색되고 심근은 분홍색 / 보라색으로 염색됩니다. (g) PMA 염색 분포의 상응하는 조직 절편. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 5: 만성 유도 심방세동에 따른 양 심장의 MicroCT 이미지. (A) 도 4A에서와 같이 착색이 할당된 심방의 부피 렌더링. (B) 심장의 장축에 있는 Bi-atrial microCT 이미지 슬라이스. 단축 슬라이스를 (C) 방실 밸브 (패널 B의 C-레드 라인), (D) 대동맥 뿌리 (패널 B의 D-블루 라인) 및 (E) 좌심방 지붕 (E-그린 라인 패널 B)의 레벨에서 추출하였다. LA: 왼쪽 심트리아; RA: 우심부; LAA: 왼쪽 심방 부속기; RAA: 오른쪽 심방 부속기; LV: 좌심실; RV: 우심실; LVOT: 좌심실 유출관; RVOT : 우심실 유출관 및 PA : 폐동맥. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

견본 #	1	2	3	4
종	돼지	돼지	양	양
본체 중량 (kg)	32.4	31.2	47.2	53.4
심장 무게 (g)	191.2	186.2	202.4	207.6
병리학	-	-	만성 MI	만성 AF
시료 준비	온 마음	온 마음	전방 심장의 쐐기	온 마음
콘트라스트 로딩 모드	확산	관류	확산	확산
조영제 노출 (h)	48	24	48	48

표 1: 심장 샘플 및 조영제 치료.

토론

대형 조직 제제에 대한 상세한 프로토콜은 후속 고해상도 구조 이미징을 위해 대형 포유류의 전심을 사용하여 제시됩니다. 공기 건조 접근법은 배경 X선 감쇠의 영향을 제거하고 조직을 최대한 최적화합니다 : 배경 대비²⁹. 이 접근법을 사용하여, 직경 7.2 cm까지의 샘플에 걸친 체적 이미징을 위해 20 μm 범위의 등방성 분해능이 달성되었다. 그러나 연조직의 MicroCT는 일반적으로 microCT 시스템(³⁴)의 X선 흡수 및 감도를 개선하기 위해 비특이적 조영제의 사용에 의존한다. X선 조영제가 전반적인 X선 감쇠 및 연조직 이미징 향상을 향상시키지만, 생화학적 조성에 기초한 조직 구성성분의 분리는 여전히 어려운 과제입니다. 그러나, 공기 건조된 심장을 실험실 환경에서 일반적인 X선 조영제인 PMA와 조합하여 사용하여, 세포외 성분을 선택적으로 염색하는 것이 관찰되었다. 건강한 심근과 관련된 결합 조직 및 만성 질환에서의 병리학적 구조 리모델링이 강화되었다.

생물학적 조직을 공기 건조시키는 과정은 샘플의 변형에 저항하기위한 개입을 필요로합니다. 전자 현미경을 위한 샘플 준비는 비슷한 요구 사항을 가지고 있습니다. 전형적으로, 조직 침지 매질, 온도 및 압력의 균형을 사용하여 조직의 액체 함량의 표면 장력을 제거하는 임계점 건조 방법이 사용되며, 이는 증발 시 분자 수준에서 변형을 일으킨다(³⁵). 이 접근법은 샘플의 수분 함량을 액체 이산화탄소로 균일하게 대체해야하며, 이는 작고 쉽게 확산 가능한 샘플에서보다 신뢰할 수 있습니다. 대안적으로, 조직의 구조적 완전성이 개선될 수 있고 공기-건조, 즉, 증발 단계가 전체 변형을 감소시키기 위해 더 긴 기간에 걸쳐 적용될 수 있다. 분자 HMDS는 실릴화를 겪어 실리콘 기반 스캐폴드를 형성하여 조직 샘플⁽³⁶)의 분자 조직을 강화하고 안정화시킨다. 증발은 환경으로부터의 순환 기류를 제한함으로써 더욱 연장되며, 또한 특히 샘플 표면과 교내 층 사이의 불균질 증발을 피한다.

이전에 수많은 조영제가 연조직의 microCT 영상화에 사용되어 왔습니다. 가장 흔한 것은 요오드, 포스포텅스텐산 (PTA) 및 PMA입니다. 요오드는 특히 더 높은 확산률^34,37,38로 인해 사용되었다. 그럼에도 불구하고, 요오드는 HMDS 시약(³⁶)의 실릴화를 위한 촉매로서 작용한다. 촉매 반응은 공격적이고 발열적이며, 시료의 불완전한 건조로 인해 잔류 HMDS가 남아있을 경우 시편의 파괴 위험이 높고 안전 위험이 있습니다. 에탄올에 용해된 PTA 및 PMA 모두 HMDS와 함께 안전하게 사용될 수 있다. PTA 및 PMA는 요오드 염색³⁸과 비교했을 때 미네랄화되지 않은 추간판에서 미세 구조의 더 큰 분해능을 제공하는 것으로 나타났다. 포유동물 샘플의 microCT 영상화에서, PTA 및 PMA는 마우스 배아⁽³⁹), 마우스 심혈관계(³⁷), 토끼 근육 및 뇌(40), 및 돼지 정맥⁽⁴¹)을 염색하는데 사용되어 왔다. PTA는 PMA보다 용액에서 더 높은 분자 질량 및 밀도를 갖는다. 이것은 부분적으로 PTA의 주요 감쇠 원소 인 텅스텐 (원자 번호는 74g / mol)의 원자 질량이 높기 때문입니다. 비교해 보면, PMA에서 가장 무거운 원소 인 몰리브덴은 원자 번호가 42g / mol입니다. 원자 질량 및 샘플 밀도 둘 다 샘플 두께⁽⁴²)에 더하여 X선 감쇠의 기초가 된다. 샘플 크기를 늘려 X선 경로 길이를 늘리면 X선 감쇠가 샘플 밀도 증가에 더 민감해집니다. 따라서, 저밀도 PMA 조영제는 과다 감쇠의 위험을 감소시키고 인간과 같은 스케일의 심장에 대한 이미지 콘트라스트의 동적 범위를 최적화하기 위해 선택되었다. 추가의 증거는 PMA의 확산-로딩이 심장 조직(⁴³)에서 더 큰 분자 PTA에 대한 것보다 더 균질한 염색을 제공한다는 것을 보여주었다.

조영제 전달 방법은 심장 조직에서 조영제 분포의 균일성에 영향을 미칩니다 (그림 3). 에탄올 탈수 심장에서 조영제의 관류는 가변 혈관 저항성으로 인한 PMA의 패치 배경 염색 수준을 보였다. 공기 건조 된 심장에서 근육 층상 구조는 샘플 건조 과정에 의해 강조되어 근육 층류 분리를 증가시킵니다. 이것은 궁극적으로 확산계 조영제 로딩을 위한 조직의 전체 투과성을 개선시켰다. 결과적으로, 공기 건조는 조직을 촉진시켰다: 층상 및 층내 수준에서의 공기 대비(그림 4). 더욱이, 확산-로딩은 진공 하에서의 적용에 의해 더욱 촉진될 수 있다. 건조되지 않은 샘플의 조직 수축은 조영제 농도(⁴⁰)에 의존한다는 것이 추가로 밝혀졌다. 그러나, 공기 건조에 의한 시편의 종래 형태학적 안정화는 조직 수축 효과⁽²⁹)를 억제한다.

전체 장기의 고해상도 microCT 이미지는 본질적으로 대용량 데이터를 생성합니다. 단층 촬영 이미징 기술의 특성상 시각화 및 이미지 처리를 슬라이스별로 수행할 수 있으므로 컴퓨터 처리 및 메모리 부담을 줄일 수 있습니다. 그러나 예를 들어 시편 볼륨을 3차원 표현으로 렌더링하는 등 3차원 이미지 스택을 시각화하기 위해 권장되는 최소 컴퓨터 사양은 128GB RAM과 3GHz의 프로세서 속도입니다. 솔리드 스테이트 하드 드라이브도 데이터 전송을 크게 개선했습니다.

심장 분야에서 microCT 이미징의 출현은 번역 연구 및 임상 검증에 많은 이점을 제공합니다. 그것의 입체 및 마이크로메트릭 영상화의 이점은 이미 ST-상승 심근 허혈 환자^(44,45)의 혈전성 부담을 결정하는 데 응용을 보여주었다. 구조적 심장 질환 환자에서 부정맥의 잠재적 인 원인을 매핑하는 것은 섬유성 흉터 조직의 분포를 결정하고 생존 한 심근의 엮인 트랙을 국소화하는 데 크게 의존합니다. 심실 부정맥의 진단을 위한 두 번째 라인 접근법은 자기 공명 영상(⁴⁶)을 이용한다. 그것은 조밀 한 섬유증을 견고하게 국소화 할 수 있지만 저해상도 형태 학적 특성화로 제한되며 섬유성 병변의 미세 구조 리모델링 및 확산 분포에 대한 제한된 통찰력을 제공합니다⁴⁷. 흉터 분포 및 특성화에 대한 고해상도 검사는 심장 구조 리모델링에 대한 우리의 이해와 심부전 발병 위험을 향상시킬 수있는 엄청난 잠재력을 가지고 있습니다. 특히, 근본적인 연구 연구 또는 사후 조사는 심장 부정맥의 전기 매핑을위한 확증적인 구조 이미지의 이점을 누릴 수 있습니다.

결론적으로, HMDS 처리 및 공기 건조로 강화된 심장은 후속적으로 X선 조영제로 염색되어 세포외 성분의 X선 감쇠를 향상시킬 수 있다. 구체적으로, 건강한 심근에서, 결합 조직에 의해 피복된 심실 전도 시스템의 상피, 판막 조직 및 구획에서 PMA 축적이 발생하여 향상된 X선 감쇠를 초래하였다. 더욱이, 구조적으로 병든 심근에서, 강화된 콘트라스트는 섬유증에 대해 더욱 선택적이었다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% neutral buffered formalin	Diapath	F0043
Calcium chloride solution	Honeywell	21114
Canulation Tubing PTFE	VWR	DENE3400102
Constant Head 1L Reservoir	Harvard Apparatus	50-0496
D-(+)-Glucose	Sigma	G5767
Ethanol absolute	VWR	20821.330
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	796881
Heparin sodium (5000 U/mL)	Panpharma	3400891287301.
Hexamethyldisilazane (HMDS)	Sigma	440191-1L
Hydrochloric acid, ACS reagent, 37%	Sigma	258148
Magnesium chloride solution	Honeywell	63020
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma	P5368
Phosphomolybdic acid hydrate	Fisher Scientific	417895000
Potassium Chloride	Sigma	P5405
Pump Tubing, 3-Stop	Ismatec	FV-96328-48
SkyScan, 1276	Bruker		micro CT
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761
Sodium Chloride	Sigma	S3014
Sodium hydroxide solution 50% in H2O	Sigma	415413
Tube Connector Kits	Harvard Apparatus	72-1407
Tubing pump	Ismatec	ISM 1089
Tubing Tygon R-3603 1.6 mm 3.2 mm 0.8 mm	VWR	228-1279
Tubing Tygon R-3603 3.2 mm 4.8 mm 0.8 mm	VWR	228-1283
Two-part single-use syringes 50 mL	Norm-Ject	4850001000	Pyrogen-free, PVC-free