Techniques de préparation tissulaire pour l’imagerie par micro-tomodensitométrie améliorée par contraste de modèles cardiaques de grands mammifères atteints de maladies chroniques

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour obtenir des images de micro-tomodensitométrie à haute résolution de cœurs entiers de grands mammifères sains et pathologiques avec une amélioration du contraste sélectif du collagène.

Résumé

Le remodelage structurel est une conséquence courante des stress pathologiques chroniques imposés au cœur. Comprendre les propriétés architecturales et compositionnelles des tissus malades est essentiel pour déterminer leurs interactions avec le comportement arythmique. Le remodelage des tissus à l’échelle microscopique, en dessous de la résolution clinique, émerge comme une source importante d’arythmie létale, avec une prévalence élevée chez les jeunes adultes. Il reste des défis à relever pour obtenir un contraste d’imagerie élevé à une résolution microscopique suffisante pour les modèles précliniques, tels que les cœurs entiers de grands mammifères. De plus, l’amélioration sélective du contraste de la composition tissulaire pour l’imagerie tridimensionnelle à haute résolution fait toujours défaut. L’imagerie non destructive utilisant la micro-tomodensitométrie est prometteuse pour l’imagerie haute résolution. L’objectif était de soulager la souffrance due à l’atténuation par rayons X dans de grands échantillons biologiques. Les cœurs ont été extraits de porcs sains (N = 2) et de moutons (N = 2) présentant soit un infarctus chronique du myocarde et une formation de cicatrices fibrotiques, soit une fibrillation auriculaire chronique induite. Les cœurs excisés ont été perfusés avec: une solution saline complétée par un agent de trempe des ions calcium et un vasodilatateur, de l’éthanol en déshydratation en série et de l’hexaméthyldisilizane sous vide. Ce dernier a renforcé la structure du cœur lors du séchage à l’air pendant 1 semaine. Les tissus à dominante collagène ont été liés sélectivement par un agent améliorant le contraste des rayons X, l’acide phosphomolybdique. La conformation tissulaire était stable dans l’air, ce qui a permis des acquisitions de micro-tomographie de longue durée pour obtenir des images à haute résolution (isotropes de 20,7 μm). La charge optimale en agent de contraste par diffusion a montré une amélioration sélective du contraste de la couche épithéliale et des fibres sous-endocardiques de Purkinje dans des ventricules de porc sains. Les cœurs de fibrillation auriculaire (FA) ont montré une accumulation de contraste accrue dans les parois postérieures et les appendices des oreillettes, attribuée à une plus grande teneur en collagène. Les cœurs d’infarctus du myocarde ont montré un contraste accru de manière sélective dans les régions de fibrose cardiaque, ce qui a permis d’identifier les fibres musculaires myocardiques survivantes entrelacées. Les préparations de tissus séchés à l’air amélioré par contraste ont permis l’imagerie à micro-échelle du cœur intact des grands mammifères et l’amélioration sélective du contraste des constituants sous-jacents de la maladie.

Introduction

Les cardiopathies structurelles représentent la majorité de la mortalité cardiaque dans le monde¹. Le remodelage de la structure cardiaque influence l’environnement myocardique et l’espace interstitiel. Étant donné que la fonction électrique et mécanique cardiaque dépend de l’organisation des myocytes, la perturbation peut entraîner une arythmie cardiaque intolérable, des actions de pompage du sang altérées et une insuffisance cardiaque 2,3,4,5,6,7,8,9. Les développements de thérapies curatives pour les maladies cardiaques structurelles sont largement compensés par la prévalence de la maladie ^2,5. En tant que tel, un nombre croissant de modèles précliniques de maladies cardiaques structurelles émergent pour mieux comprendre les profils anatomo-morphologiques et la pathogenèse résultante des arythmies cardiaques 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23. Dans l’ensemble du spectre des maladies structurelles, on observe une régulation à la hausse de la fibrose interstitielle et, plus fréquemment dans les cas liés à l’ischémie, un remplacement du myocarde par une fibrose et un tissu adipeux¹⁸. La compréhension morphologique des composants extracellulaires pathologiques peut permettre l’identification de substrats potentiels de l’arythmie. La distribution et l’étendue de la maladie fournissent de solides indicateurs du risque arythmogène. Pourtant, il reste des défis à relever pour imager de manière exhaustive les profils de maladie en intégrant des macro et micro-échelles dans le cœur intact.

La micro-tomodensitométrie (microCT), basée sur les rayons X, émerge comme un outil puissant pour interroger la microstructure des tissus biologiques mous à l’aide d’agents de contraste. Des cartes anatomiques très détaillées ont été obtenues pour les cœurs de petits rongeurs 24,25,26 et de petits échantillons disséqués de cœurs de grands mammifères ^27,28. Cependant, l’imagerie au niveau de l’ensemble des organes des cœurs de grands mammifères présente des longueurs de chemin excessives sur lesquelles les photons de rayons X sont atténués à l’aide de techniques conventionnelles de préparation des tissus. Cela implique de charger le tissu par contraste et d’immerger l’échantillon dans un solvant d’agent de contraste lors de l’acquisition. L’augmentation de la taille et de la résolution de l’échantillon impose une prolongation du temps d’acquisition total. Par conséquent, la stabilité des tissus devient cruciale pour la reconstruction d’images utilisables, ce qui signifie que la déformation tissulaire résultant du séchage doit être évitée. L’utilisation d’un fluide d’immersion présente cependant des inconvénients: (i) l’intensité globale du signal de fond devient non négligeable et (ii) favorise la dilution des molécules de contraste liées aux tissus. Ces deux facteurs contribuent à réduire le contraste de l’image.

Cette étude détaille un nouveau pipeline de traitement tissulaire pour atténuer l’atténuation des photons de fond et optimiser la plage dynamique offerte par les agents d’amélioration du contraste. Il est suggéré d’utiliser une approche de séchage à l’air des tissus avec renforcement chimique des tissus pour limiter la déformation des^{tissus 29}. Par conséquent, les échantillons de tissus peuvent rester stables dans l’air pour de longues acquisitions et omettre les contributions de fond des fluides d’immersion. Ce pipeline méthodologique fournit : (i) un protocole complet de traitement et d’imagerie des tissus optimisé à l’aide de cœurs de porc entiers ; (ii) une évaluation des techniques de concentration et de charge de contraste et, (iii) l’application de ce pipeline dans deux modèles distincts de maladies chroniques de fibrillation auriculaire et d’infarctus du myocarde dans les cœurs de moutons. Le développement des modèles de maladies chroniques a été décrit ailleurs pour chaque modèle de maladie cardiaque chronique, infarctus du myocarde induit par l’embolisation percutanée de l’artère coronaire¹³ et la fibrillation auriculaire auto-entretenue³⁰.

Protocole

Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux lignes directrices de la directive 2010/63/UE du Parlement européen sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques. Les protocoles animaux ont été approuvés par le comité d’éthique local (CEEA50) de l’Université de Bordeaux. Les cœurs provenaient de trois modèles de grands mammifères, y compris (i) de grands porcs blancs en bonne santé (N = 2, 2 mois); (ii) Moutons (N = 1,2 ans) atteints d’infarctus du myocarde induit¹³ et (iii) Moutons (N = 1,7 ans) atteints de fibrillation auriculaire induite³⁰.

1. Préparation de la solution:

1. Solution cardioplégique : Préparer 3 L d’eau distillée et ajouter le chlorure de sodium (110 mM), le chlorure de potassium (16 mM), le bicarbonate de sodium (10 mM), le D-(+)-glucose (9 mM), la solution de chlorure de calcium (1,2 mM) et la solution de chlorure de magnésium (16 mM). À la fin, ajouter 500 μL/L d’héparine sodique. Conserver cette solution à 4 °C.
2. Solution saline tamponnée au phosphate - solution d’EDTA (PBS-EDTA).
   1. Tout d’abord, ajouter l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 1 L d’eau distillée pour une concentration finale de 10 mM. Augmenter et maintenir un pH de solution de 12 en utilisant une solution d’hydroxyde de sodium (1 M) pour dissoudre l’EDTA.
   2. Une fois l’EDTA complètement dissous, abaissez le pH à 7,4 en utilisant de l’acide chlorhydrique. Ajouter une pochette en feuille de solution saline tamponnée au phosphate pour obtenir une solution à 0,01 M (chlorure de sodium, 0,138 M; chlorure de potassium, 0,0027 M) et pH 7,4. Conserver cette solution à température ambiante (RT).
3. Solution d’agent de contraste éthanol -acide phosphomolybdique (PMA) : Préparer 1 L d’éthanol absolu et ajouter le PMA pour obtenir une solution à 1% de concentration. Conservez cette solution chez RT.

2. Source de tissu

1. Euthanasier l’animal et extraire le cœur selon les directives éthiques locales. Immergez rapidement le cœur dans une solution cardioplégique froide et massez doucement les ventricules pour un rinçage initial.
2. Assurez-vous de couper l’aorte sous l’arc aortique et serrez les deux côtés de la paroi artérielle à l’aide de porte-aiguilles.
3. En suspendant le cœur par les porte-aiguilles, insérez une canule aortique dans la racine aortique, en prenant soin de ne pas entrer en contact avec les valves aortiques ou de ne pas les dépasser. Enroulez une suture de calibre 0 autour de l’arc aortique au niveau de la canule et attachez fermement la canule en place.
4. À l’aide de seringues de 50 mL, injecter 200 mL de solution cardioplégique froide (4 °C). Éliminez l’excès de sang accumulé dans les cavités en inclinant le cœur sur son côté postérieur pour s’écouler par les veines pulmonaires.
5. Immerger le cœur rincé et conserver dans une solution cardioplégique froide stockée sur de la glace jusqu’à ce qu’elle soit prête pour la dissection.

3. Préparation des tissus:

1. Préparer un réservoir de 1 L soutenu à 80 cm au-dessus d’un plat de dissection. Couplez un tube thermoplastique de 80 cm de longueur et de 3,2 mm de diamètre intérieur et de 4,8 mm de diamètre extérieur à un orifice de vidange du réservoir.
2. Fixez un robinet à trois voies au tube de drainage et couplez d’autres tubes thermoplastiques (20 cm, 1,6 mm de diamètre intérieur et 3,2 mm de diamètre externe) à chaque port libre du robinet à trois voies. Fixez les robinets bidirectionnels aux extrémités payantes du tube.
3. Remplissez le réservoir avec la solution cardioplégique complétée par de l’héparine (2500 unités). Ouvrez les robinets pour permettre à la solution cardioplégique de s’écouler et d’éliminer toutes les bulles d’air, puis fermez les robinets bidirectionnels.
4. Préparer les canules pour l’ostie coronaire gauche et droite à l’aide de tubes en polytétrafluoroéthylène (PTFE) (1 mm de diamètre intérieur et 2 mm de diamètre extérieur).
   1. Coupez 5 cm de tube et chauffez une extrémité en plaçant la pointe à côté d’une flamme nue. Une fois que 1 mm de la pointe commence à fondre et devient translucide, appuyez sur la pointe contre une surface dure résistante à la chaleur pour former une crête à l’extrémité des canules afin d’empêcher les canules de glisser hors des vaisseaux.
   2. Insérez 1 cm de l’extrémité non chauffée de chaque canule dans les deux extrémités du tuyau de drainage du réservoir de drainage.
5. Retirez la canule aortique. Sous solution cardioplégique froide, localiser l’ostie gauche et droite des artères coronaires.
6. À l’aide de ciseaux pointus, séparez soigneusement la racine aortique du tissu environnant au-dessus et au-dessous de l’ostie coronaire pour permettre le filetage d’une suture de soie de 0 G sous le vaisseau coronaire.
7. Ouvrez les robinets bidirectionnels et insérez les pointes des canules dans l’ostie coronaire. Avec les pointes des canules s’étendant de 1 à 2 cm dans l’ostie et au-delà de la suture, attachez les canules.
8. Rincez le cœur tout en massant doucement les ventricules pendant 15 minutes jusqu’à ce que le cœur soit débarrassé du sang.
9. Après le rinçage, fermez les robinets bidirectionnels et déconnectez-les du robinet à trois voies. Transférer le cœur dans un récipient en plastique résistant aux produits chimiques de 1 L contenant 500 mL de solution de PBS-EDTA.
10. Recirculer la solution PBS-EDTA dans le tube thermoplastique sous une hotte à l’aide d’une pompe péristaltique à deux canaux. Amorcer le tube de la pompe jusqu’à ce que le tube soit dépourvu de bulles d’air, puis perfuser chaque canule de l’artère coronaire par recirculation à RT pendant 2 h à 80 mL/min.
11. Assurez-vous que la hotte est opérationnelle. Arrêtez la pompe, égouttez la solution du récipient et remplacez-la par du formol (10%) pour une fixation pendant 1 h à RT à 80 mL/min.
12. Remplacer la solution de formol par du PBS pour rincer le fixateur trois fois pendant 15 min chacun à 80 mL/min.

4. Déshydratation et séchage des tissus :

REMARQUE: Utilisez le même taux de perfusion (80 mL / min) et laissez le tissu rester à RT tout au long.

1. Remplacer la solution de PBS par de l’éthanol à 20%, dilué dans de l’eau ultra-pure, et perfuser pendant au moins 3 h.
2. Perfuser le cœur en utilisant une série de concentrations d’éthanol incrémentées.
   1. Commencez par remplacer la solution d’éthanol à 20% par de l’éthanol dilué à 30% et perfusez pendant 2 h.
   2. Répétez la perfusion en incrémentant la concentration d’éthanol à chaque itération de 40 %, 50 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 95 %, 90 %, 95 %, 99 % et 100 % pendant une durée minimale de 1 h à chaque étape (concentration).
      REMARQUE: Les échantillons cardiaques peuvent reposer sans écoulement de perfusion pendant la nuit à toute dilution d’éthanol si une perfusion minimale de 15 minutes a eu lieu pour cette concentration.
3. FACULTATIF: Si vous appliquez des agents de contraste par perfusion, perfuser le cœur avec 100% d’éthanol complété par l’agent de contraste PMA, 1% pendant 48 h. Rincer l’agent de contraste par perfusion avec 100% d’éthanol pendant 2 h.
4. Pour renforcer le tissu cardiaque avant le séchage à l’air, recirculez un mélange 50:50 d’éthanol et d’hexaméthyldisilazane (HMDS) pendant 10 min. Suivez cela par 100% HMDS pendant 2 heures supplémentaires.
   ATTENTION : Le HMDS est une substance hautement toxique et nocive. Une forte odeur d’ammoniac est libérée au contact de l’air. De plus, la forme liquide du HMDS est très volatile et catalysée par des agents contenant de l’iode.
5. Débranchez les canules du tube et suspendez le cœur à une suture aortique à l’intérieur de la hotte.
6. Faites glisser soigneusement un sac à fermeture à glissière sur le cœur et fermez le sceau du sac sur la suture pour réduire l’exposition du cœur à l’air circulant. Laissez le cœur sécher par évaporation pendant 1 semaine.
7. FACULTATIF: Pour les agents de contraste à charge par diffusion, laver le cœur dans de l’éthanol à 100% pendant 15 min tout en agitant. Immerger le cœur dans de l’éthanol 100% complété par du PMA, 1%, pendant 48 h sous vide. Répétez l’étape 4.6.

5. MicroCT :

REMARQUE: Un système microCT à rayons X de bureau a été utilisé pour l’imagerie des cœurs de porc.

1. Montez le cœur séché à l’air sur un porte-échantillon approprié. Empêchez tout mouvement pendant les mesures microCT à rayons X à l’aide d’une pince ancrée au porte-échantillon et fixez le cœur via l’aorte séchée et rigide.
2. Alignez méticuleusement le centre de l’échantillon cardiaque le long de son axe longitudinal avec le centre du champ de vision d’imagerie pour des angles de rotation de 0° et 90°. Pour ce faire dans toutes les orientations, suspendez le cœur en l’air via une pince aortique fixée au support de l’échantillon.
3. Après avoir ouvert le logiciel et lancé le système microCT à rayons X, appliquez le filtre à rayons X en aluminium, 1 mm, la tension de la source de rayons X à 60 kV et le courant à 120 μA. Définissez les dimensions de l’image sur 2016 x 1344 pixels et la taille des pixels sur 20 μm.
4. Retirez le porte-échantillon hors du champ de vision et calibrez l’image d’arrière-plan et le temps d’exposition aux rayons X en obtenant une correction de champ plat. Assurez-vous que la transmission moyenne des rayons X de fond est supérieure à 80 %.
5. Images de transmission de rayons X scoutes sur toute la longueur du support pour déterminer le champ d’imagerie global dans l’axe longitudinal du cœur. Pour la numérisation, utilisez une étape de rotation de 0,18°, une moyenne d’image de 5 et une rotation d’échantillon de 180°. Sélectionnez le mode de numérisation décalé pour imager toute la largeur du support de l’échantillon.
   REMARQUE: Les paramètres d’acquisition indiqués dans cette section ont été sélectionnés pour optimiser la qualité d’image de la composition du cœur d’ensemble.
6. Après la numérisation, utilisez le logiciel pour la reconstruction tomographique d’un volume d’image tridimensionnel isotrope. Pour l’application du logiciel NRecon, utilisez la correction d’artefacts liée à l’acquisition, y compris des effets de durcissement du faisceau de 10% et une réduction des artefacts en anneau de 8.
7. Pour optimiser les limitations de stockage des données, appliquez la région rectangulaire minimale d’intérêt qui englobe les voxels d’image spécifiques au cœur. Exportez les images dans un format bitmap 8 bits en tant que pile d’images.
8. Visualisez la pile de données reconstruite à l’aide du logiciel DataViewer. Orientez numériquement l’échantillon à l’intérieur des limites de l’image pour réaligner les axes longs et courts de l’échantillon avec les trois axes principaux du volume d’image.
9. Recadrez le volume de l’image dans les trois axes pour supprimer les calques d’arrière-plan extérieurs de l’image, afin de réduire au maximum la taille totale de l’image.

Résultats

La préparation de cœurs de grands mammifères à l’aide de la méthode de déshydratation et de séchage à l’air élimine toute teneur en eau de l’échantillon. Des signes d’un remplacement insuffisant de l’eau par de l’éthanol peuvent être observés pendant le chargement du HMDS (voir protocole, étape 4.4). La présence d’eau sous HMDS créera des bulles s’élevant du tissu. En cas de niveaux d’eau excessifs, une augmentation de la température du fluide d’immersion peut se produire. Garder la chambre d’immersion entourée de glace pendant la charge initiale du HMDS peut réduire les effets néfastes du chauffage des tissus. Après séchage à l’air des cœurs en l’absence d’agents de contraste, l’échantillon apparaîtra de couleur blanche (voir Protocole, étape 4.6). La surface extérieure était souvent séchée et structurellement stable avant les couches intra-muros. Le rinçage dans de l’éthanol avant le chargement de l’agent de contraste a éliminé le dépôt blanc (voir protocole, étape 4.7). Le tranchage à travers les tissus à l’aide d’une lame tranchante révèle des fibres musculaires macroscopiquement individuelles avec une séparation claire. La charge de contraste par immersion d’échantillons cardiaques dans un produit de contraste a souffert d’artefacts de limite de diffusion dans les régions épaisses et très musclées de l’échantillon. La charge de contraste de diffusion sous vide a fourni une coloration plus homogène dans le muscle (échantillon cardiaque #1, voir le tableau 1 pour les temps de chargement des agents de contraste). Macroscopiquement, la distribution de l’agent de contraste de surface a montré une coloration in-homogène entre le muscle cardiaque et les régions composées principalement de composants extracellulaires, notamment la graisse et le tissu conjonctif. Les échantillons de tissus séchés à l’air, avant ou après le chargement de l’agent de contraste, ont maintenu une intégrité structurelle stable.

Le temps nécessaire pour numériser toute la largeur de l’échantillon à une résolution de 20 μm sous microCT en utilisant les paramètres de balayage susmentionnés et un temps d’exposition de 1700 ms était de 6 h 34 min. Selon la taille de l’échantillon dans l’axe du portique du scanner, cette durée a été multipliée par le nombre de positions nécessaires pour capturer toute la longueur de l’échantillon. Pour les cœurs de porc et de mouton dans cette étude, trois à quatre positions ont été utilisées. Le logiciel NRecon a carrelé les scans multi-positions et décalés pour former une seule image de projection de rayons X pour chaque étape de rotation de la source de rayons X et du détecteur. Au total, 1000 projections sont stockées sous forme d’images 16 bits, générant 30 à 40 Go de données. Les images volumétriques reconstruites étaient de 52 à 70 Go.

Les principaux repères anatomiques, y compris les cavités ventriculaires, le septum et les parois libres des ventricules, étaient facilement identifiables à partir de l’imagerie de transmission par rayons X de cœurs de porc séchés à l’air colorés avec un agent de contraste par diffusion-charge (Figure 1A). De plus, des régions très texturées indiquant une organisation microstructurale, telles que l’orientation des fibres myocardiques, ont également été observées en raison de l’atténuation/transmission sensible des rayons X (figure 1B). Les reconstructions tomographiques de volumes d’images tridimensionnelles ont montré une séparation distincte entre le tissu et l’arrière-plan aux limites épicardique et endothéliale (figure 1D). Un faible contraste intramurel et un gradient de diffusion d’intensité voxel ont été observés dans les régions transmurales épaisses du tissu. Malgré cela, le système vasculaire et les fibres myocardiques séparées par des plans de clivage étaient encore facilement identifiables. Une deuxième bande passante de contraste d’intensité plus élevée a été observée à la couche la plus épicardique et dans les régions sous-endocardiques ponctuées. L’amélioration du contraste a été la plus importante sur les sites où les composants extracellulaires ont été accumulés, en particulier le tissu conjonctif épicardique, la graisse épicardique et la gaine du tissu conjonctif du réseau de fibres de Purkinje. Les distributions d’intensité du signal Voxel ont montré une séparation élevée du fond d’intensité nulle (air) et deux populations dominantes de tissus à contraste faible et élevé (figure 1D).

Pour valider l’amélioration du contraste des reconstructions d’images microCT et la sélectivité des compartiments collagènes des échantillons cardiaques, l’histologie, la microscopie à champ lumineux et la microscopie fluorescente ont été utilisées (Figure 2). Un bloc transmural de tissu ventriculaire provenant d’un cœur séché à l’air sans charge préalable d’agent de contraste a été préparé pour l’incorporation et la section de la paraffine. Les tranches de tissu adjacentes montées sur des lames de microscope ont été traitées soit par coloration trichrome de Masson, soit par absence de traitement, soit par 48 h de PMA (1 %). L’immersion de coupes de tissus montées sur lame a éliminé les effets de gradient de diffusion du processus de coloration observés dans des échantillons de cœur entier. La coloration trichrome de Mason a montré une coloration positive au collagène au niveau des couches épithéliale et endothéliale, périvasculairement dans le tissu sous-épicardique, et une gaine de tissu conjonctif entourant une fibre de Purkinje libre dépassant dans la cavité ventriculaire gauche (Figure 2A). L’éclairage en champ lumineux a montré une coloration plus foncée dans les structures collagènes après la coloration PMA, soutenant l’accumulation préférentielle de PMA (figures 2B, C). De plus, il a déjà été démontré que le traitement PMA éteint l’autofluorescence des complexes macromoléculaires de collagène³¹. Les images fluorescentes de coupes de tissus ventriculaires présentaient une perte de fluorescence induite par la PMA sur les sites de collagène (Figure 2D vs 2E, Figure 2D' vs 2E' et Figure 2D'' vs . 2E''). Dans l’imagerie en champ lumineux et fluorescente, les compartiments cellulaires n’ont pas été altérés par le traitement PMA, et le collagène avait une accumulation sélective de coloration PMA et une trempe de l’autofluorescence.

L’échantillon cardiaque no 2 a été coloré avec un agent de contraste par perfusion avant le séchage à l’air. La reconstruction de l’image a révélé une coloration très inégale dans le compartiment myocardique (Figure 3A). L’amélioration du contraste ne semblait pas sélective de la composition tissulaire, sans autre amélioration de l’intensité du signal dans les régions épicardiques ou sous-endocardiques. De plus, les tissus à faible contraste ont montré une mauvaise séparation de l’intensité de fond (figure 3B).

La fibrose ventriculaire a été induite par un infarctus du myocarde et une ischémie chronique (échantillon cardiaque n ° 3). Une cicatrice antéro-apicale a été formée en remplaçant les myocytes par des dépôts fibro-graisseux dans le tissu en aval du site d’embolisation vasculaire. L’échantillon cardiaque n ° 3 a été préparé et imagé à partir d’un coin ventriculaire disséqué recouvrant le ventricule gauche antérieur, le septum et la paroi libre ventriculaire droite. La préparation de cette configuration de coin ventriculaire a été décrite précédemment³² et l’application de coins pour l’imagerie cardiaque a été examinée en détail³³. La morphologie cicatricielle était transmurale mais hétérogène (Figure 4). Une lésion fibrotique dense centrale était entourée d’une zone frontalière lâche et hétérogène (figure 4A). La préparation ventriculaire a été colorée par diffusion-chargement post-séchage à l’air et dans le vide. La figure 4B-E montre les plus grandes intensités de signal des volumes d’image microCT reconstruits aux limites des tissus et dans les régions cicatricielles. Les agents de contraste ont mal coloré le myocarde sain, mais le contraste microstructurel a été conservé (Figure 4C'). Dans la zone frontalière, le tissu cicatriciel était entrecoupé de myocarde survivant (figure 4D'). La fibrose dense est apparue transmurale mais texturée, indiquant des variations de composition (Figure 4E'). Des coupes tissulaires d’une région ventriculaire gauche transmurale de la préparation tissulaire séchée à l’air et colorée en PMA ont été utilisées pour valider la sélectivité de la PMA pour le collagène dans les tissus pathologiques en les comparant à la coloration trichrome de Masson (Figure 4F). La coloration PMA était sélective pour le collagène (sous-épicarde et sous-endocarde) et absente dans les régions du myocarde survivant (figure 4G).

L’échantillon cardiaque n ° 4 avec fibrillation auriculaire persistante induite a été séché à l’air tout en conservant la forme native de la cavité auriculaire. L’effondrement de l’appendice auriculaire n’a pas été observé. Les principaux repères anatomiques ont pu être identifiés morphologiquement à partir d’images reconstruites (le septum auriculaire, les muscles ectinés, le sinus coronaire, l’ostie veineuse pulmonaire, la veine cave et le cristae terminalis). La coloration par diffusion sous vide a entraîné une amélioration du contraste dans la racine aortique et les valves auriculo-ventriculaires et dans des régions discrètes du myocarde en activité. L’amélioration de la coloration musculaire a été limitée aux appendices auriculaires et aux parois postérieures des oreillettes gauche et droite (figure 5).

Figure 1 : Imagerie MicroCT d’un cœur de porc séché à l’air traité avec un agent de contraste PMA par diffusion sous vide. (A) Image de projection aux rayons X. (B) Profil de transmission extrait de la ligne rouge en A. (C) Tranche à axe court des ventricules à partir d’un volume tridimensionnel reconstruit tomographiquement. Les flèches jaunes indiquent les régions ponctuées de contraste attribuées aux fibres de Purkinje sous-endocardiques. Les flèches bleues indiquent la vascularisation. (D) Distribution de l’intensité du signal de la tranche d’image reconstruite montrée en C. LV: ventricule gauche et RV: ventricule droit. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Validation de la sélectivité de la PMA pour le collagène. (A) Coloration trichrome par Masson d’une section de tissu transmural à partir des ventricules d’un cœur séché à l’air. Le myocarde est coloré en rouge et le collagène est montré avec une coloration verte. Les coupes tissulaires adjacentes (B) dépourvues de coloration ou (C) colorées avec PMA (1%) ont été imagées avec un éclairage en champ vif pour évaluer l’uniformité de la coloration. (D) Des coupes de tissus dépourvues de coloration ou (E) colorées par PMA ont été photographiées par microscopie fluorescente. Les panneaux D'(boîte rouge unie) et E' (boîte rouge pointillée) sont des vues agrandies du sous-épicardium pour les sections non colorées et tachées de PMA. Les panneaux D'' (boîte bleue pleine) et E'' (boîte bleue en pointillés) sont des vues agrandies correspondantes du sous-endocarde et d’une fibre purkinje libre. Les flèches indiquent les sites de teneur en collagène. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Perfusion-charge de PMA avant séchage à l’air et imagerie MicroCT. (A) Tranche à axe court d’un volume d’image reconstruit des ventricules d’un cœur de porc. Les flèches bleues indiquent la vascularisation. (B) La distribution de l’intensité du signal de la tranche d’image à partir du panneau A. LV: ventricule gauche et RV: ventricule droit. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Imagerie microCT d’un cœur de mouton souffrant d’un infarctus chronique du myocarde. (A) Une cicatrice dense s’est formée dans la région apicale (voir photo en médaillon). Un rendu volumique de la région apicale d’un point de vue endocardique a été attribué à une coloration basée sur l’intensité de l’image (rouge correspondant au tissu cicatriciel et au myocarde en vert). Les tranches orthogonales de l’intensité en niveaux de gris montrent la distribution dense de la cicatrice et bordant le myocarde survivant. La séparation entre le tissu fibrotique et le myocarde correspond aux régions du tissu adipeux. (B) Photographie d’une préparation de coin ventriculaire séchée à l’air d’un mouton présentant des cicatrices apicales à la suite d’un infarctus du myocarde. Des tranches obliques du volume d’image microCT reconstruit traversent les ventricules au niveau médian entre la base et l’apex et proximale jusqu’au site d’occlusion vasculaire (C) (ligne rouge C dans le panneau B), (D) la région péri-infarctus bordant la cicatrice dense et le myocarde sain (D- ligne bleue dans le panneau B) et (E) une région de fibrose dense (E - ligne verte dans le panneau B). (C') Vue élargie de la région septale soulignée par une boîte pointillée rouge en C. (D') Vue étendue de la région de l’infarctus à l’apex ventriculaire droit (boîte pointillée bleue dans le panneau D). (E') Vue élargie de la région de l’infarctus à l’apex ventriculaire gauche (boîte pointillée verte dans le panneau E). LV: Cavité ventriculaire gauche; RV: cavité ventriculaire droite; MB : bande de modérateurs; Pap : muscle papillaire. La flèche jaune indique l’artère descendante antérieure gauche. (F) Coloration trichrome par Masson d’une section histologique découpée dans le ventricule gauche séché à l’air taché par PMA. Le collagène est coloré en bleu et le myocarde est taché en rose /violet. G) Une section tissulaire correspondante de la distribution de coloration PMA. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Image MicroCT d’un cœur de mouton suite à une fibrillation auriculaire induite chronique. (A) Rendu volumique des oreillettes avec coloration attribuée comme dans la figure 4A. (B) Tranche d’image microCT bi-auriculaire dans l’axe long du cœur. Des tranches à axe court ont été extraites au niveau des valves auriculo-ventriculaires (C- ligne rouge dans le panneau B), (D) racine aortique (D- ligne bleue dans le panneau B) et (E) toit auriculaire gauche (E- ligne verte dans l’panneau B). LA: oreillettes gauches; RA: oreillettes droites; LAA: appendice auriculaire gauche; RAA: appendice auriculaire droit; LV: ventricule gauche; RV: ventricule droit; LVOT: voie d’écoulement ventriculaire gauche; RVOT: voie d’écoulement ventriculaire droit et PA: artère pulmonaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Échantillon #	1	2	3	4
Espèce	Cochon	Cochon	Mouton	Mouton
Poids corporel (kg)	32.4	31.2	47.2	53.4
Poids cardiaque (g)	191.2	186.2	202.4	207.6
Pathologie	-	-	IM chronique	FA chronique
Préparation des échantillons	Cœur entier	Cœur entier	Coin du cœur antérieur	Cœur entier
Mode de chargement du contraste	Diffusion	Perfusion	Diffusion	Diffusion
Exposition aux agents de contraste (h)	48	24	48	48

Tableau 1 : Échantillons cardiaques et traitement par agent de contraste.

Discussion

Un protocole détaillé pour les préparations de gros tissus est établi en utilisant des cœurs entiers de grands mammifères pour l’imagerie structurelle à haute résolution ultérieure. Une approche de séchage à l’air a éliminé les influences de l’atténuation des rayons X de fond et optimisé au maximum les tissus: contraste de fond²⁹. En utilisant cette approche, une résolution isotrope de l’ordre de 20 μm pour l’imagerie volumétrique sur des échantillons jusqu’à 7,2 cm de diamètre a été obtenue. Cependant, la microCT des tissus mous repose généralement sur l’utilisation d’agents de contraste non spécifiques pour améliorer l’absorption des rayons X et la sensibilité des systèmes microCT³⁴. Bien que les agents de contraste aux rayons X améliorent l’atténuation globale des rayons X et l’amélioration de l’imagerie des tissus mous, la séparation des constituants tissulaires en fonction de la composition biochimique reste difficile. Cependant, il a été observé que l’utilisation de cœurs séchés à l’air en combinaison avec un agent de contraste à rayons X commun en laboratoire, le PMA, tachait sélectivement des composants extracellulaires. Le tissu conjonctif associé au myocarde sain et au remodelage structurel pathologique dans les maladies chroniques a été amélioré.

Le processus de séchage à l’air des tissus biologiques nécessite une intervention pour résister à la déformation de l’échantillon. La préparation d’échantillons pour la microscopie électronique a des exigences similaires. En règle générale, une méthode de séchage aux points critiques est utilisée, qui utilise un équilibre du milieu d’immersion tissulaire, de la température et de la pression pour éliminer la tension superficielle du contenu liquide du tissu, ce qui provoque une déformation au niveau moléculaire lors de l’évaporation³⁵. Cette approche nécessite un remplacement uniforme de la teneur en eau de l’échantillon par du dioxyde de carbone liquide, qui est plus fiable dans les échantillons de petite taille et facilement diffusables. Alternativement, l’intégrité structurelle du tissu peut être améliorée et le séchage à l’air, c’est-à-dire la phase d’évaporation peut être appliqué sur une plus longue période pour réduire la déformation globale. La molécule HMDS subit une silylation pour former un échafaudage à base de silicone afin de renforcer et de stabiliser l’organisation moléculaire de l’échantillon de tissu³⁶. L’évaporation est encore prolongée en limitant les courants d’air circulants de l’environnement, également pour éviter l’évaporation inhomogène, en particulier entre la surface de l’échantillon et les couches intra-muros.

De nombreux agents de contraste ont déjà été utilisés pour l’imagerie microCT des tissus mous. Les plus courants sont l’iode, l’acide phosphotungstique (PTA) et le PMA. L’iode en particulier a été utilisé en raison d’un taux de diffusion plus élevé 34,37,38. Néanmoins, l’iode agit comme un catalyseur pour la silylation du réactif HMDS³⁶. La réaction catalysée est agressive et exothermique, avec un risque élevé de destruction de l’échantillon et un risque pour la sécurité s’il reste du HMDS résiduel en raison d’une dessiccation incomplète de l’échantillon. Le PTA et le PMA dissous dans l’éthanol peuvent être utilisés en toute sécurité en conjonction avec le HMDS. Il a été démontré que la PTA et la PMA fournissent un plus grand pouvoir de résolution des structures fines dans les disques intervertébraux non minéralisés par rapport à la coloration à l’iode³⁸. Dans l’imagerie microCT d’échantillons de mammifères, la PTA et la PMA ont été utilisées pour colorer les embryons^{de souris 39}, le système cardiovasculaire^{de souris 37}, les muscles et le cerveau^{de lapin 40} et les veines porcines⁴¹. Le PTA a une masse moléculaire et une densité en solution plus élevées que le PMA. Cela est dû en partie à une masse atomique plus élevée de tungstène (le numéro atomique est de 74 g / mol), le principal élément atténuant de la PTA. En comparaison, l’élément le plus lourd du PMA, le molybdène, a un numéro atomique de 42 g/mol. La masse atomique et la densité de l’échantillon sous-tendent l’atténuation des rayons X, en plus de l’épaisseur de l’échantillon⁴². En augmentant la longueur du trajet des rayons X en augmentant la taille des échantillons, l’atténuation des rayons X devient plus sensible à l’augmentation de la densité de l’échantillon. Par conséquent, l’agent de contraste PMA de densité inférieure a été choisi pour réduire le risque de sur-atténuation et pour optimiser la plage dynamique du contraste d’image pour les cœurs à l’échelle humaine. D’autres preuves ont montré que la charge de diffusion de PMA donne une coloration plus homogène que pour la molécule plus grande PTA dans le tissu cardiaque⁴³.

La méthode d’administration des agents de contraste a une incidence sur l’uniformité de la distribution des agents de contraste dans le tissu cardiaque (figure 3). La perfusion d’agents de contraste dans le cœur déshydraté à l’éthanol a montré des niveaux de coloration de fond inégaux de PMA en raison d’une résistance vasculaire variable. Dans le cœur séché à l’air, la structure laminaire musculaire est soulignée par le processus de dessiccation de l’échantillon, ce qui augmente la séparation laminaire musculaire. Cela a finalement amélioré la perméabilité globale du tissu pour la charge en agent de contraste basée sur la diffusion. Par conséquent, le séchage à l’air a facilité les tissus : contraste de l’air aux niveaux laminaire et intra-laminaire (Figure 4). De plus, la charge de diffusion peut être encore facilitée par une application sous vide. Il a également été démontré que le rétrécissement tissulaire des échantillons non séchés dépend de la concentration en agent de contraste⁴⁰. Cependant, la stabilisation morphologique préalable de l’échantillon par séchage à l’air inhibe les effets de rétrécissement tissulaire²⁹.

Les images microCT haute résolution d’organes entiers produisent intrinsèquement de grands volumes de données. La nature des techniques d’imagerie tomographique permet la visualisation et la gestion des images tranche par tranche, ce qui allège le traitement informatique et la charge de mémoire. Cependant, pour visualiser des piles d’images tridimensionnelles, par exemple, pour rendre des volumes d’échantillons dans des représentations tridimensionnelles, les spécifications minimales recommandées par l’ordinateur sont de 128 Go de RAM et d’une vitesse de processeur de 3 GHz. Les disques durs SSD ont également considérablement amélioré le transfert de données.

L’émergence de l’imagerie microCT dans le domaine cardiaque offre de nombreux avantages pour les études translationnelles et la validation clinique. Les avantages de son imagerie tridimensionnelle et micrométrique ont déjà montré des applications dans la détermination de la charge thrombotique des patients atteints d’ischémie myocardique d’élévation ST^44,45. La cartographie des sources potentielles d’arythmie chez les patients atteints de maladies cardiaques structurelles dépend en grande partie de la détermination de la distribution du tissu cicatriciel fibrotique et de la localisation des traces entrelacées du myocarde survivant. Les approches de deuxième intention pour le diagnostic des arythmies ventriculaires utilisent l’imagerie par résonance magnétique⁴⁶. Il peut localiser de manière robuste la fibrose dense, mais se limite à la caractérisation morphologique à basse résolution et offre un aperçu limité du remodelage microstructurel et des distributions diffuses des lésions fibrotiques⁴⁷. L’examen à haute résolution de la distribution et de la caractérisation des cicatrices a un vaste potentiel pour améliorer notre compréhension du remodelage structurel cardiaque et du risque de développer une insuffisance cardiaque. En particulier, les études de recherche fondamentale ou les investigations post-mortem bénéficieront d’images structurelles corroborantes pour la cartographie électrique de l’arythmie cardiaque.

En conclusion, les cœurs renforcés par le traitement HMDS et le séchage à l’air peuvent ensuite être colorés avec un agent de contraste aux rayons X pour améliorer l’atténuation des composants extracellulaires aux rayons X. Plus précisément, dans le myocarde sain, l’accumulation de PMA se produit au niveau de l’épithélium, du tissu valvulaire et des compartiments du système de conduction ventriculaire gainés de tissu conjonctif, ce qui a entraîné une atténuation accrue des rayons X. De plus, dans le myocarde structurellement malade, l’amélioration du contraste était encore plus sélective pour la fibrose.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% neutral buffered formalin	Diapath	F0043
Calcium chloride solution	Honeywell	21114
Canulation Tubing PTFE	VWR	DENE3400102
Constant Head 1L Reservoir	Harvard Apparatus	50-0496
D-(+)-Glucose	Sigma	G5767
Ethanol absolute	VWR	20821.330
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	796881
Heparin sodium (5000 U/mL)	Panpharma	3400891287301.
Hexamethyldisilazane (HMDS)	Sigma	440191-1L
Hydrochloric acid, ACS reagent, 37%	Sigma	258148
Magnesium chloride solution	Honeywell	63020
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma	P5368
Phosphomolybdic acid hydrate	Fisher Scientific	417895000
Potassium Chloride	Sigma	P5405
Pump Tubing, 3-Stop	Ismatec	FV-96328-48
SkyScan, 1276	Bruker		micro CT
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761
Sodium Chloride	Sigma	S3014
Sodium hydroxide solution 50% in H2O	Sigma	415413
Tube Connector Kits	Harvard Apparatus	72-1407
Tubing pump	Ismatec	ISM 1089
Tubing Tygon R-3603 1.6 mm 3.2 mm 0.8 mm	VWR	228-1279
Tubing Tygon R-3603 3.2 mm 4.8 mm 0.8 mm	VWR	228-1283
Two-part single-use syringes 50 mL	Norm-Ject	4850001000	Pyrogen-free, PVC-free