Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול בדיקה כימוטקסיס משופר. מטרת פרוטוקול זה היא להפחית את הצעדים והעלויות של שיטות כימוטקסיס חיידקיות מסורתיות ולשמש משאב בעל ערך להבנת אינטראקציות בין צמחים למיקרובים.

Abstract

זיהוי Chemotaxis חשוב מאוד למחקר ויישום של חיידקים מקדמי צמיחה rhizosphere. הקמנו שיטה פשוטה כדי לזהות במהירות את הכימותרפיה שיכולה לגרום לתנועה כימוטקטית של חיידקים מקדמי צמיחה rhizosphere על שקופיות זכוכית סטריליות באמצעות צעדים פשוטים. תמיסת חיידקים (OD600 = 0.5) ותמיסה מימית כימותרפית סטרילית נוספו טיפה על מגלשת הזכוכית במרווח של 1 ס"מ. לולאה חיסונית שימשה לחיבור התמיסה המימית הכימותרפית לפתרון החיידקי. המגלשה נשמרה בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות על הספסל הנקי. לבסוף, תמיסת מימית כימותרפית נאספה לספירת חיידקים ותצפית מיקרוסקופית. במחקר זה, באמצעות השוואות מרובות של תוצאות ניסיוניות, השיטה התגברה על חסרונות מרובים של שיטות כימוטקסיס חיידקיות מסורתיות. השיטה הפחיתה את השגיאה של ספירת הלוחות וקיצרה את מחזור הניסוי. לזיהוי חומרים כימותרפיים, שיטה חדשה זו יכולה לחסוך 2-3 ימים בהשוואה לשיטה המסורתית. בנוסף, שיטה זו מאפשרת לכל חוקר להשלים באופן שיטתי ניסוי כימוטקסיס חיידקי תוך 1-2 ימים. הפרוטוקול יכול להיחשב כמשאב בעל ערך להבנת אינטראקציות בין חיידקים צמחיים.

Introduction

Chemotaxis חשוב להתיישבות של ריזובקטריאל קידום צמיחה צמחית (PGPR) על שורשים ולהבנת אינטראקציות בין צמחים למיקרואורגניזמים1. סוג של תרכובות משקל מולקולרי נמוך (כימותרפיה) ב exudates שורש הצמח לגרום לתנועה כימוטקטית של PGPR כדי rhizosphere2. חומצה מאלית, חומצת לימון, ורכיבים אחרים exudates השורש לעורר chemotaxis של זני Bacillus3. לדוגמה, גלוקוז, חומצת לימון וחומצה פומרית באקסודות שורש תירס מגייסים חיידקים למשטח השורש4. D-גלקטוז, אשר נגזר exudates שורש, גורם כימוטקסיס של Bacillus velezensis SQR95. חומצות אורגניות, כולל פומראט, חומצה מאלית, ותמציתיות, משפיעות על כימוטקסיס והתיישבות של PGPR שונים במערכת הקג'אן - Zea mays intercropping6. חומצה אולאנולית באקסודטים שורש אורז, משמשת ככימותרפיה לזן FP357. אקסודטים צמחיים אחרים (כולל היסטידין, ארגינין ואספרטאט) יכולים למלא תפקיד מכריע בתגובה הכימית של חיידקים8. אקסודטים צמחיים מתפקדים כאות לכוון את תנועת החיידקים, שהיא הצעד הראשון במהלך קולוניזציה של ריזוספירה. קולוניזציה צמחית על ידי PGPR היא תהליך של רלוונטיות עצומה, כמו PGPR מועילים עבור המארח הצמח.

שיטות רבות שימשו לניתוח כימוטקסיס חיידקי. שיטת צלחת השחייה היא אחת השיטות שתוארו בעבר9. בשיטה זו, הצלחות נעשו עם מדיום חצי-סוליד. חיץ כימוטקטי המכיל אגר (1.0%, w/v) נוסף ללוח. החיץ מחומם, ולאחר מכן מעורבב עם chemoattractant. לאחר מכן, 8 μL של השעיית חיידקים נוספה dropwise לאמצע הצלחת ואת הצלחת הונחה באינקובטור ב 28 °C (60 °F). הצלחת נצפתה באופן קבוע וצולמה. עם זאת, המחזור הניסיוני של שיטת צלחת השחייה היה ארוך מאוד. בשיטה דמוית נימי10, קצה פיפטה משמש כתא להחזקת 100 μL של השעיה חיידקית. מחט מזרק 1 מ"ל שימשה כנימים. מחט מזרק המכילה כימותרפיה עם שיפועי ריכוז שונים הוכנסה לתוך קצה פיפטה 100 μL. לאחר הדגירה בטמפרטורת החדר במשך 3 שעות, מחט המזרק הוסרה, התוכן היה מדולל מצופה על המדיום. הצטברות החיידקים במזרק יוצגה על ידי יחידות יוצרות מושבה (CFUs) בלוחות. עם זאת, השגיאה הניסיונית בתוך שכפולים עבור השיטה דמוית נימי היה גדול. שיטה אחרת השתמשה במכשיר SlipChip מיקרופלוידי11. בקצרה, פתרון אלבומין סרום בקר (BSA) הוזרק לכל הערוצים והוסר באמצעות ואקום. הפתרונות המכילים כימותרפיה שונים (ריכוז של 1 מ"מ לגילוי איכותי בלבד), תאי חיידקים המושעים מלוחים חוצצי פוספט ומאגר מלוחים עם מאגר פוספט (בקרה שלילית) נוספו למיקרווולים העליונים, האמצעיים והתחתונים, בהתאמה. הדגירה בוצעה אז בסביבה חשוכה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. תאי החיידקים התגלו אז במיקרווולים. מכשיר SlipChip המיקרופלוידי, לעומת זאת, היה יקר. לכן, לכל אחת מהשיטות שתוארו לעיל היו יתרונות וחסרונות.

הקמנו בדיקת כימוטקסי משופרת לזיהוי מהיר של כימותרפיה rhizobacterial ב exudates שורש באמצעות שקופיות זכוכית סטריליות ללא צעדים מסובכים. במחקר זה, באמצעות השוואות מרובות של תוצאות ניסיוניות, השיטה התגברה על חסרונות מרובים של שיטות כימוטקסיס חיידקיות מסורתיות. השיטה הפחיתה את השגיאה של ספירת הלוחות וקיצרה את מחזור הניסוי. לכן, אם נעשה שימוש כדי לזהות חומר כימותרפי, שיטה חדשה זו יכולה לחסוך 2-3 ימים ולהפחית את העלות של חומרים ניסיוניים.

Protocol

1. חומרים וציוד

הערה: Bacillus altitudinis LZP02 (CP075052) היה מבודד מן הריזוספירה של אורז בצפון מזרח סין12,13 למחקר זה.

  1. תרבות ב'. altitudinis LZP02 בלוריא-ברטאני (LB) בינוני (פפטון, 10 גרם L-1; NaCl, 8 גרם L-1 ותמצית שמרים, 5 גרם L-1) למשך 10 שעות. לאסוף תאים על ידי צנטריפוגה ב 9,569 x g במשך 2 דקות ב 4 °C (60 °F) ולאחסן עם 15% גליצרול ב -80 °C (80 °F).
    הערה: עבור ניסוי זה, זרעי אורז (Oryza sativa Longgeng 46) סופקו על ידי המכון לחקר האורז של האקדמיה למדעי החקלאות של Heilongjiang.

2. אוסף אקסודטים שורשיים

  1. להפיץ באופן אקראי זרעי אורז בתא גדילה.
    הערה: זרעי אורז היו מעוקרים עם 30% H2O2 במשך 30 דקות ספוג במים לילה. התנאים היו כדלקמן: האור המבוקר (16/8 שעות מחזור אור / כהה), טמפרטורה (22 ± 2 °C (26 °F ) ולחות יחסית ( ͂70%).
  2. זרעי אורז תרבות במשך שבוע ולהוסיף מים סטריליים פעמיים.
  3. בחר שתילי אורז בגודל דומה צמח ב 50 מ"ל של Murashige ו Skoog (MS) מדיום נוזלי. דגירה עבור 48 שעות ב 22 °C (65 °F) בתנאים אספטיים.
    הערה: אקסודטים שורש אורז ישוחררו למדיום MS14,15,16.

3. ניתוח ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית של אקסודטים שורשיים

  1. לאסוף 100 μL של המדגם (MS בינוני המכיל exudates שורש) בצינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל. הוסף 20 μL של ממס החילוץ (acetonitrile-מתנול-מים, 2:2:1, כולל תקן פנימי). Homogenize המדגם ב 45 Hz במשך 4 דקות, ואחריו ultrasonication על קרח במשך 5 דקות באמבט מים.
  2. חזור על ההומוגניזציה ומחזור קולי שלוש פעמים. דגירה המדגם ב -20 °C (60 °F) עבור 1 שעות, ואחריו צנטריפוגה ב 133,778 x g ו 4 °C (66 °F) במשך 15 דקות.
  3. העבר את supernatant וכתוצאה מכך בקבוקונים LC-MS ולאחסן ב -80 °C (80 °F) עד ניתוח UHPLC-QE. הכן את דגימות בקרת האיכות (QC) על ידי ערבוב חלקים שווים של supernatant של כל הדגימות.
    הערה: כל נפח מדגם היה 600 μL (שישה משוכפלים לכל ניסוי) בניסוי שהוצג.
  4. בצע ניתוח LC-MS/MS באמצעות מערכת UHPLC, עמודת UPLC HSS T3 (2.1 מ"מ x 100 מ"מ, 1.8 מיקרומטר) ו- Q Exactive12.
    1. השתמש 0.1% חומצה פורמית תמיסה מימית ו 5 mmol / L אמוניום אצטט פתרון מימי כמו שלב נייד A ואצטוניטריל כמו שלב נייד B. השתמש חומצה פורמית אמוניום אצטט כמו מצבי יון חיובי ושלילי, בהתאמה.
    2. הגדר את שיפוע ההמלטות כדלקמן: 0 דקות, 1% B; 1 דקה, 1% B; 8 דקות, 99% B. 10 דקות, 99% B. 10.1 דקות, 1% B; 12 דקות, 1% B. הגדר את קצב הזרימה ואת נפח ההזרקה ל 0.5 מ"ל / דקה ו 2 μL, בהתאמה.
      הערה: אין אפשרות לזהות את המאקרומולקולה (>1,000 דלטון).

4. בדיקת כימוטקסיס

  1. הכן את הפתרון מימי הכימותרפי. ודא שהוא סטרילי. סנן את התמיסה הכימותרפית באמצעות מסנן חיידקים של 0.22 מיקרומטר.
    הערה: התמיסה מימית הכימותרפית הייתה החומר היחיד שהתקבל ממחקרי LC-MS שהומסו במים. הריכוז והנפח ניתן לכוונן כראוי על פי מחקרים שונים. תמיסת חומצת לימון שימשה כדוגמה. כל הפעולות חייבות להתבצע לצד מנורה.
  2. סמן את המיקום האמצעי של שקופית הזכוכית במרווח של 1 ס"מ. ודא כי שקופית הזכוכית מעוקרת מספר פעמים על הלהבה.
  3. הוסף את 30 μL של פתרון chemoattractant בצד שמאל של שקופית הזכוכית. ודא כי חיידקים היו בתרבית לשלב הלוגריתמי (2 x 108 CFU / mL) במדיום LB. הוסף 30 μL של תמיסת החיידקים בצד ימין של שקופית הזכוכית.
    הערה: הכן קבוצת בקרה שלילית עם נפח שווה של מים סטריליים. תמיסת המלח (0.9% NaCI) שימשה כבקרה חיובית על מנת לחסל את השינויים הנגרמים על ידי כוח intermolecular על הניסוי.
  4. לחטא לולאת חיסון מספר פעמים על הלהבה. השתמש בלולאה החיסונית כדי לחבר את הפתרון מימית chemoattractant לפתרון חיידקי ולשמור אותו בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות על ספסל נקי.
    הערה: הניסוי חייב להתבצע בסביבה נטולת רוח. התאם את הזמן לפני ניתוק קו החיבור עבור זנים בעלי יכולות אתלטיות שונות כראוי.
  5. לאחר 20 דקות, נתק את הקו המחבר עם נייר סינון.
  6. ודא כי צינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל הוא סטרילי. לאסוף את הפתרון מימית chemoattractant בצד שמאל של שקופית הזכוכית. העבר את הפתרון לצינור הצנטריפוגה הסטרילי 1.5 מ"ל.
  7. הוסף את הנפח המתאים של ספרנין לצינור הצנטריפוגה. לאחר 2 דקות, לאסוף את הנוזלים השונים לספירת חיידקים ותצפית מיקרוסקופית עם תא ספירת דם.

5. ניתוח תוצאות

  1. קבע את מספר המיקרואורגניזמים הקיימים הנמשכים באמצעות המשוואה הבאה:
    figure-protocol-4505
    איפה NBC: המספר הכולל של תאי חיידקים; נ: מספר החיידקים ב-80 רשתות.
    הערה: תוכנת ניתוח סטטיסטי שימשה לניתוח נתונים. השגיאה התבססה על שלושה ערכים ניסיוניים משוכפלים שונים וחושבה באמצעות ANOVA חד כיוונית ואחריה ניתוח פוסט הוק של טורקיה. P ≤ 0.05 נחשב משמעותי.

תוצאות

בסך הכל זוהו 584 ו-937 מטבוליטים ידועים במדדי היונים החיוביים והשליליים, בהתאמה. מחקרים קודמים הראו כי כימותרפיה הם בדרך כלל חומצות אורגניות, חומצות אמינו, ופחמימות17,18.

במחקר זה, 16 סוגים של כימותרפיה ממחקרי LC-MS ב exudates ריזוספירה אורז נבחרו לניסויי...

Discussion

מחקרים הולכים וגוברים מצביעים על כך שאינטראקציות בין חיידקים צמחיים מתרחשות בעיקר בריזוספירה ומושפעות מאקסודטים שורשיים20,21,22,23,24. אקסודטים שורש צמח כוללים מגוון רחב של מטבוליטים ראשוניים, כולל חומצ...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '31870493), פרויקטי המחקר והפיתוח העיקריים בהיילונגג'יאנג, סין (GA21B007), ודמי המחקר הבסיסיים של אוניברסיטאות במחוז היילונגג'יאנג, סין (מס '135409103).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2,5-dihydroxybenzoic acidBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.490-79-9
AcetonitrileCNW Technologies75-05-8
Ammonium acetateCNW Technologies631-61-8
Caffeic acidBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.331-39-5
CentrifugeThermo Fisher ScientificHeraeus Fresco17
Citric acidBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.77-92-9
Clean benchShanghai Boxun Industrial Co., Ltd.BJ-CD
Ferulic acidBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.1135-24-6
Formic acidCNW Technologies64-18-6
FructoseBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.57-48-7
GalactoseBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.59-23-4
GlycineBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.56-40-6
Grinding MillShanghai Jingxin Industrial Development
Co., Ltd.		JXFSTPRP-24
HistidineBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.71-00-1
Internal standard: 2-Chloro-L-phenylalanineShanghai Hengbai Biotech C.,Ltd.103616-89-3
LeucineBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.61-90-5
Malic acidBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.6915-15-7
MannoseBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.3458-28-4
Mass SpectrometerThermo Fisher ScientificQ Exactive Focus
MethanolCNW Technologies67-56-1
Optical MicroscopeOlympusBX43
PhenylalanineBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.63-91-2
ProlineBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.147-85-3
ScalesSartoriusBSA124S-CW
SerineBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.56-45-1
ThreonineBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.72-19-5
UHPLCAgilent1290 UHPLC
Ultrasound InstrumentShenzhen Leidebang Electronics
Co., Ltd.		PS-60AL
ValineBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.7004-03-7

References

  1. Belas, R. Biofilms, flagella, and mechanosensing of surfaces by bacteria. Trends in Microbiology. 22 (9), 517-527 (2014).
  2. Haichar, Z., Santaella, C., Heulin, T., Achouak, W. Root exudates mediated interactions belowground. Soil Biology and Biochemistry. 77 (7), 69-80 (2014).
  3. Zhang, N., et al. Effects of different plant root exudates and their organic acid components on chemotaxis, biofilm formation and colonization by beneficial rhizosphere-associated bacterial strains. Plant and Soil. 374 (1-2), 689-700 (2014).
  4. Zhang, N., et al. Whole transcriptomic analysis of the plant-beneficial rhizobacterium Bacillus amyloliquefaciens SQR9 during enhanced biofilm formation regulated by maize root exudates. BMC Genomics. 16 (1), 685 (2015).
  5. Lui, Y., et al. Induced root-secreted D-galactose functions as a chemoattractant and enhances the biofilm formation of Bacillus velezensis SQR9 in an mcpa-dependent manner. Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (17), 785-797 (2020).
  6. Vora, S. M., Joshi, P., Belwalkar, M., Archana, G. Root exudates influence chemotaxis and colonization of diverse plant growth-promoting rhizobacteria in the Cajanus cajan - Zea mays intercropping system. Rhizosphere. 18 (12), 100331 (2021).
  7. Sampedro, I., et al. Effects of halophyte root exudates and their components on chemotaxis, biofilm formation and colonization of the halophilic bacterium halomonas anticariensis FP35T. Microorganisms. 8 (4), 575 (2020).
  8. Liu, X. L., Raza, W., Ma, J. H., Huang, Q. W., Shen, Q. R. A dual role amino acid from sesbania rostrata seed exudates in the chemotaxis response of Azorhizobium caulinodans ORS571. Molecular Plant-Microbe Interactions. 32 (9), 1134-1147 (2019).
  9. Ling, N., Raza, W., Ma, J. H., Huang, Q. W., Shen, Q. R. Identification and role of organic acids in watermelon root exudates for recruiting Paenibacillus polymyxa SQR-21 in the rhizosphere. European Journal of Soil Biology. 47 (6), 374-379 (2011).
  10. Rudrappa, T., Czymmek, K. J., Pare, P. W., Bais, H. P. Root-secreted malic acid recruits beneficial soil bacteria. Plant Physiology. 148 (3), 1547-1556 (2008).
  11. Shen, C., et al. Bacterial chemotaxis on Slipchip. Lab on a Chip. 14 (16), 3074-3080 (2014).
  12. Liu, H., et al. Bacillus pumilus LZP02 promotes rice root growth by improving carbohydrate metabolism and phenylpropanoid biosynthesis. Molecular Plant-Microbe Interactions. 33 (10), 1222-1231 (2020).
  13. Goswami, M., Deka, S. Isolation of a novel rhizobacteria having multiple plant growth promoting traits and antifungal activity against certain phytopathogens. Microbiological Research. 240, 126516 (2020).
  14. Kaiira, M., Chemining'Wa, G., Ayuke, F., Baguma, Y., Nganga, F. Profiles of compounds in root exudates of rice, cymbopogon, desmodium, mucuna and maize. Journal of Agricultural Sciences Belgrade. 64 (4), 399-412 (2019).
  15. Shi, Y., et al. Effect of rice root exudates and strain combination on biofilm formation of Paenibacillus polymyxa and Paenibacillus macerans. African Journal of Microbiology Research. 6 (13), 3343-3347 (2012).
  16. Lee, H. W., Ghimire, S. R., Shin, D. H., Lee, I. J., Kim, K. U. Allelopathic effect of the root exudates of K21, a potent allelopathic rice. Weed Biology and Management. 8 (2), 85-90 (2008).
  17. Belimov, A. A., et al. Rhizobacteria that produce auxins and contain 1-amino-cyclopropane-1-carboxylic acid deaminase decrease amino acid concentrations in the rhizosphere and improve growth and yield of well-watered and water-limited potato (Solanum tuberosum). Annals of Applied Biology. 167 (1), 11-25 (2015).
  18. Ankati, S., Podile, A. R. Metabolites in the root exudates of groundnut change during interaction with plant growth promoting rhizobacteria in a strain-specific manner. Journal of Plant Physiology. 243, 153057 (2019).
  19. Gordillo, F., Chavez, F., Jerez, C. A. Motility and chemotaxis of Pseudomonas sp. B4 towards polychlorobiphenyls and chlorobenzoates. FEMS Microbiology Ecology. 60 (2), 322-328 (2007).
  20. Bais, H. P., Weir, T. L., Perry, L. G., Gilroy, S., Vivanco, J. M. The role of root exudates in rhizosphere interactions with plants and other organisms. Annual Review of Plant Biology. 57, 233-266 (2006).
  21. Badri, D. V., Vivanco, J. M. Regulation and function of root exudates. Plant Cell Environment. 32 (6), 666-681 (2009).
  22. Badri, D. V., Weir, T. L., Lelie, D., Vivanco, J. M. Rhizosphere chemical dialogues: plant-microbe interactions. Curr Opin Biotech. Current Opinion in Biotechnology. 20 (6), 642-650 (2009).
  23. Kamilova, F., Kravchenko, L. V., Shaposhnikov, A. I., Makarova, N., Lugtenberg, B. Effects of the tomato pathogen Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici and of the biocontrol bacterium Pseudomonas fluorescens WCS365. Molecular Plant-Microbe Interactions. 19 (10), 1121-1126 (2006).
  24. Kamilova, F., et al. Organic acids, sugars, and L-tryptophane in exudates of vegetables growing on stonewool and their effects on activities of rhizosphere bacteria. Molecular Plant-Microbe Interactions. 19 (3), 250-256 (2006).
  25. Badri, D. V., Vivanco, J. M. Regulation and function of root exudates. Plant Cell Environment. 32 (6), 666-681 (2009).
  26. Hao, W. Y., Ren, L. X., Ran, W., Shen, Q. R. Allelopathic effects of root exudates from watermelon and rice plants on Fusarium oxysporum f.sp. Niveum. Plant and Soil. 336 (1-2), 485-497 (2010).
  27. Hao, Z. P., Wang, Q., Christie, P., Li, X. L. Allelopathic potential of watermelon tissues and root exudates. Scientia Horticulturae. 112 (3), 315-320 (2007).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

181

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved