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Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo de ensaio de quimiotaxis melhorado. O objetivo deste protocolo é reduzir as etapas e custos dos métodos tradicionais de quimioterapia bacteriana e servir como um recurso valioso para a compreensão das interações entre plantas e micróbios.

Resumo

A identificação de quimiotaxis é muito importante para a pesquisa e aplicação de bactérias promotoras do crescimento da rizofera. Estabelecemos um método simples para identificar rapidamente os quimioattractants que poderiam induzir o movimento quimotactic de bactérias promotoras do crescimento da rizosfera em lâminas de vidro estéreis através de passos simples. A solução bacteriana (OD600 = 0,5) e a solução aquosa quimioattractant estéril foram adicionadas dropwise no slide de vidro em um intervalo de 1 cm. Um loop inoculante foi usado para conectar a solução aquosa quimioattractant à solução bacteriana. O slide foi mantido em temperatura ambiente por 20 minutos no banco limpo. Finalmente, foi coletada a solução aquosa quimioattractant para contagem bacteriana e observação microscópica. Neste estudo, por meio de múltiplas comparações de resultados experimentais, o método superou múltiplas deficiências dos métodos tradicionais de quimioterapia bacteriana. O método reduziu o erro de contagem de placas e encurtou o ciclo experimental. Para a identificação de substâncias quimioattractant, este novo método pode economizar de 2 a 3 dias em comparação com o método tradicional. Além disso, este método permite que qualquer pesquisador complete sistematicamente um experimento de quimiotaxis bacteriana dentro de 1-2 dias. O protocolo pode ser considerado um recurso valioso para entender as interações entre plantas e micróbios.

Introdução

A quimiotaxis é importante para a colonização da rizobacteriana promotora do crescimento vegetal (PGPR) nas raízes e para a compreensão das interações entre plantas e micróbios1. Uma classe de compostos de baixo peso molecular (quimioattractants) em exudatas de raízes vegetais induzem o movimento quimotactic de PGPR à rizosfera2. Ácido malicílico, ácido cítrico e outros componentes nos exsudatos radiculares estimulam a quimotaxis das cepas de Bacillus3. Por exemplo, glicose, ácido cítrico e ácido fumarico na raiz do milho exsudam bactérias para a superfície raiz4. D-galactose, que é derivado de exudatas raiz, induz a quimiotaxis de Bacillus velezensis SQR95. Ácidos orgânicos, incluindo fumarato, ácido málico e succinato, influenciam a quimiotaxis e a colonização de vários PGPR no Cajan cajan - Zea mays intercropping system6. O ácido oleanolico em exsudates de raiz de arroz, atua como um quimioattractant para a cepa FP357. Outros exsudatos de plantas (incluindo histidina, arginina e aspartato) podem desempenhar um papel crucial na resposta quimotactica das bactérias8. Exsudatos vegetais funcionam como um sinal para direcionar o movimento das bactérias, que é o primeiro passo durante a colonização da rizofera. A colonização vegetal pela PGPR é um processo de enorme relevância, pois o PGPR é benéfico para o hospedeiro da planta.

Muitos métodos têm sido usados para analisar quimotaxis bacterianos. O método da placa de natação é um dos métodos descritos anteriormente9. Neste método, as placas foram feitas com um meio semisoólido. Um tampão quimotactic contendo ágar (1,0%, w/v) foi adicionado à placa. O tampão é aquecido e misturado com o quimioattractant. Em seguida, 8 μL de suspensão bacteriana foi adicionado dropwise ao meio da placa e a placa foi colocada em uma incubadora a 28 °C. A placa era regularmente observada e fotografada. No entanto, o ciclo experimental do método da placa de natação foi muito longo. No método capilar10, uma ponta de pipeta serve como câmara para segurar 100 μL de suspensão bacteriana. A agulha de seringa de 1 mL foi usada como capilar. Uma agulha de seringa contendo quimioattractants com diferentes gradientes de concentração foi inserida na ponta de pipeta de 100 μL. Após a incubação à temperatura ambiente por 3h, a agulha da seringa foi removida, o conteúdo foi diluído e banhado no meio. O acúmulo bacteriano na seringa foi representado por unidades formadoras de colônias (UFC) nas placas. No entanto, o erro experimental dentro das réplicas para o método capilar foi grande. Outro método utilizou um dispositivo SlipChip microfluidic11. Resumidamente, a solução de albumina de soro bovino (BSA) foi injetada em todos os canais e removida usando um vácuo. As soluções contendo diferentes quimioattractants (concentração de 1 mM apenas para detecção qualitativa), células bacterianas suspensas em soro fisiológico tampão salino tampão tampão tampão de fosfato (controle negativo) foram adicionadas às micro-habitas superior, média e inferior, respectivamente. A incubação foi então realizada em um ambiente escuro à temperatura ambiente por 30 minutos. As células bacterianas foram então detectadas nos microwells. O dispositivo Microfluídico SlipChip, no entanto, era caro. Portanto, cada um dos métodos descritos acima tinha vantagens e desvantagens.

Estabelecemos um ensaio de quimiotaxis melhorado para a identificação rápida de quimioattractants rizobacterianos em exsudatos radiculares usando lâminas de vidro estéreis sem etapas complicadas. Neste estudo, por meio de múltiplas comparações de resultados experimentais, o método superou múltiplas deficiências dos métodos tradicionais de quimioterapia bacteriana. O método reduziu o erro de contagem de placas e encurtou o ciclo experimental. Portanto, se usado para identificar uma substância quimiofos, este novo método pode economizar de 2 a 3 dias e reduzir o custo de materiais experimentais.

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Protocolo

1. Materiais e equipamentos

NOTA: Bacillus altitudinis LZP02 (CP075052) foi isolado da rizosfera do arroz no nordeste da China12,13 para este estudo.

  1. Cultura B. altitudinis LZP02 em Luria-Bertani (LB) médio (peptone, 10 g L-1; NaCl, 8 g L-1 e extrato de levedura, 5 g L-1) por 10 h. Colete células por centrifugação a 9.569 x g por 2 min a 4 °C. e armazene com 15% de glicerol a -80 °C.
    NOTA: Para este experimento, as sementes de arroz (Oryza sativa Longgeng 46) foram fornecidas pelo Instituto de Pesquisa de Arroz da Academia heilongjiang de Ciências Agrícolas.

2. Coleção de exsudatos de raiz

  1. Distribua aleatoriamente sementes de arroz em uma câmara de crescimento.
    NOTA: As sementes de arroz foram esterilizadas com 30% de H2O2 por 30 min e encharcadas em água durante a noite. As condições foram as seguintes: luz controlada (ciclo claro/escuro de 16/8 horas), temperatura (22 ± 2 °C) e umidade relativa (͂ 70%).
  2. Cultura sementes de arroz por uma semana e adicione água estéril duas vezes.
  3. Selecione mudas de arroz de tamanho semelhante e plante em 50 mL de meio líquido Murashige e Skoog (MS). Incubar por 48 h a 22 °C em condições assépticas.
    NOTA: Os exsudatos de raiz de arroz serão liberados no ms médio14,15,16.

3. Análise de espectrometria de massa cromatografia líquida de exsudatos radiculares

  1. Colete 100 μL da amostra (meio MS contendo exsudatos radiculares) em um tubo centrífuga de 1,5 mL. Adicione 20 μL do solvente de extração (acetonitrilo-água de metanol, 2:2:1, incluindo padrão interno). Homogeneize a amostra a 45 Hz por 4 min, seguida de ultrassônica no gelo por 5 minutos em banho-maria.
  2. Repita a homogeneização e o ciclo ultrassônico três vezes. Incubar a amostra a -20 °C por 1h, seguida de centrifugação a 133.778 x g e 4 °C por 15 min.
  3. Transfira o supernatante resultante para frascos LC-MS e armazene a -80 °C até análise UHPLC-QE. Prepare as amostras de controle de qualidade (QC) misturando partes iguais do sobrenatante de todas as amostras.
    NOTA: Cada volume amostral foi de 600 μL (seis réplicas por experimento) no experimento apresentado.
  4. Realize a análise LC-MS/MS utilizando o sistema UHPLC, a coluna UPLC HSS T3 (2,1 mm x 100 mm, 1,8 μm) e a Q Exactive12.
    1. Use solução aquosa de ácido fórmico de 0,1% e solução aquosa de acetato de amônio 5 mmol/L como fase móvel A e acetonitrilo como fase móvel B. Use ácido fórmico e acetato de amônio como modos positivos e negativos de íons, respectivamente.
    2. Coloque o gradiente de elução da seguinte forma: 0 min, 1% B; 1 min, 1% B; 8 min, 99% B. 10 min, 99% B. 10,1 min, 1% B; 12 min, 1% B. Ajuste a taxa de fluxo e o volume de injeção para 0,5 mL/min e 2 μL, respectivamente.
      NOTA: A macromolécula (>1.000 Daltons) não pode ser detectada.

4. Ensaio de quimioterapia

  1. Prepare a solução aquosa quimioattractant. Certifique-se de que é estéril. Filtre a solução de quimioterapia com um filtro de bactérias de 0,22 μm.
    NOTA: A solução aquosa quimioattractant foi a única substância obtida dos estudos de LC-MS dissolvidos na água. A concentração e o volume podem ser ajustados adequadamente de acordo com diferentes estudos. A solução de ácido cítrico foi usada como exemplo. Todas as ações devem ser realizadas ao lado de uma lâmpada.
  2. Marque a posição do meio do deslizamento de vidro em um intervalo de 1 cm. Certifique-se de que a lâmina de vidro seja esterilizada várias vezes na chama.
  3. Adicione os 30 μL de solução de quimioattractant à esquerda do slide de vidro. Certifique-se de que as bactérias foram cultivadas até o estágio logarítmico (2 x 108 UFC/mL) em meio LB. Adicione 30 μL da solução bacteriana à direita do escorregador de vidro.
    NOTA: Prepare um grupo de controle negativo com um volume igual de água estéril. A solução salina (0,9% NaCI) foi utilizada como controle positivo para eliminar as alterações causadas pela força intermolecular no experimento.
  4. Esterilize um laço inoculante várias vezes na chama. Use o laço inoculante para conectar a solução aquosa quimioattractant à solução bacteriana e mantê-la em temperatura ambiente por 20 minutos em um banco limpo.
    NOTA: O experimento deve ser realizado em um ambiente sem vento. Ajuste o tempo antes de desconectar a linha de conexão para cepas de diferentes habilidades atléticas adequadamente.
  5. Após 20 min, desconecte a linha de conexão com papel filtro.
  6. Certifique-se de que o tubo centrífuga de 1,5 mL é estéril. Colete a solução aquosa quimioattractant à esquerda do escorregador de vidro. Transfira a solução para o tubo de centrífuga estéril de 1,5 mL.
  7. Adicione o volume apropriado de safranin ao tubo centrífuga. Após 2 minutos, colete os líquidos miscíveis para contar bactérias e observação microscópica com uma câmara de contagem de sangue.

5. Análise de resultados

  1. Determine o número de microrganismos viáveis atraídos usando a seguinte equação:
    figure-protocol-5599
    onde NBC: Número total de células bacterianas; N: Número de bactérias em 80 grades.
    NOTA: O software de análise estatística foi utilizado para análise de dados. O erro foi baseado em três diferentes valores experimentais replicados e foi calculado utilizando-se de uma ANOVA unidirecional, seguida pela análise pós-hoc da Turquia. P ≤ 0,05 foi considerado significativo.

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Resultados

Foram detectados 584 e 937 metabólitos conhecidos nos índices de íons positivos e negativos, respectivamente. Estudos anteriores mostraram que os quimioattractants são tipicamente ácidos orgânicos, aminoácidos e carboidratos17,18.

Neste estudo, foram selecionados 16 tipos de quimioattractants dos estudos da LC-MS nos exsudatos da rizosfera de arroz para experimentos subsequentes (Tabela 1). Usando o método da p...

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Discussão

Pesquisas crescentes indicam que as interações entre plantas e bactérias ocorrem principalmente na rizosfera e são influenciadas por exsudates raiz20,21,22,23,24. Os exsudatos de raízes vegetais incluem uma variedade diversificada de metabólitos primários, incluindo ácidos fenólicos, ácidos orgânicos e aminoácidos, bem como compostos secundários ...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela National Natural Science Foundation of China (Nos. 31870493), os Principais Projetos de Pesquisa e Desenvolvimento em Heilongjiang, China (GA21B007), e as Taxas Básicas de Pesquisa das Universidades da Província de Heilongjiang, China (No. 135409103).

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
2,5-dihydroxybenzoic acidBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.490-79-9
AcetonitrileCNW Technologies75-05-8
Ammonium acetateCNW Technologies631-61-8
Caffeic acidBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.331-39-5
CentrifugeThermo Fisher ScientificHeraeus Fresco17
Citric acidBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.77-92-9
Clean benchShanghai Boxun Industrial Co., Ltd.BJ-CD
Ferulic acidBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.1135-24-6
Formic acidCNW Technologies64-18-6
FructoseBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.57-48-7
GalactoseBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.59-23-4
GlycineBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.56-40-6
Grinding MillShanghai Jingxin Industrial Development
Co., Ltd.		JXFSTPRP-24
HistidineBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.71-00-1
Internal standard: 2-Chloro-L-phenylalanineShanghai Hengbai Biotech C.,Ltd.103616-89-3
LeucineBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.61-90-5
Malic acidBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.6915-15-7
MannoseBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.3458-28-4
Mass SpectrometerThermo Fisher ScientificQ Exactive Focus
MethanolCNW Technologies67-56-1
Optical MicroscopeOlympusBX43
PhenylalanineBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.63-91-2
ProlineBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.147-85-3
ScalesSartoriusBSA124S-CW
SerineBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.56-45-1
ThreonineBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.72-19-5
UHPLCAgilent1290 UHPLC
Ultrasound InstrumentShenzhen Leidebang Electronics
Co., Ltd.		PS-60AL
ValineBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.7004-03-7

Referências

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