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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein verbessertes Chemotaxis-Assay-Protokoll. Ziel dieses Protokolls ist es, die Schritte und Kosten herkömmlicher bakterieller Chemotaxis-Methoden zu reduzieren und als wertvolle Ressource für das Verständnis von Pflanzen-Mikroben-Interaktionen zu dienen.

Zusammenfassung

Die Chemotaxis-Identifizierung ist sehr wichtig für die Erforschung und Anwendung von rhizosphärenwachstumsfördernden Bakterien. Wir haben eine einfache Methode etabliert, um schnell die Chemoattraktiva zu identifizieren, die die chemotaktische Bewegung von rhizosphärenwachstumsfördernden Bakterien auf sterilen Glasobjektträgern in einfachen Schritten induzieren könnten. Bakterienlösung (OD600 = 0,5) und sterile chemoattraktive wässrige Lösung wurden im Abstand von 1 cm tropfenweise auf den Glasobjektträger gegeben. Eine Impfschleife wurde verwendet, um die chemoattraktive wässrige Lösung mit der bakteriellen Lösung zu verbinden. Die Rutsche wurde bei Raumtemperatur für 20 min auf der sauberen Bank gehalten. Schließlich wurde die chemoattraktive wässrige Lösung für die Bakterienzählung und mikroskopische Beobachtung gesammelt. In dieser Studie überwand die Methode durch mehrfache Vergleiche experimenteller Ergebnisse mehrere Mängel herkömmlicher bakterieller Chemotaxis-Methoden. Die Methode reduzierte den Fehler der Plattenzählung und verkürzte den Versuchszyklus. Für die Identifizierung von chemoattraktiven Substanzen kann diese neue Methode im Vergleich zur herkömmlichen Methode 2-3 Tage einsparen. Darüber hinaus ermöglicht diese Methode jedem Forscher, ein bakterielles Chemotaxis-Experiment innerhalb von 1-2 Tagen systematisch abzuschließen. Das Protokoll kann als wertvolle Ressource für das Verständnis von Pflanzen-Mikroben-Interaktionen angesehen werden.

Einleitung

Chemotaxis ist wichtig für die Besiedlung von pflanzenwachstumsfördernden Rhizobakterien (PGPR) auf Wurzeln und für das Verständnis von Pflanzen-Mikroben-Interaktionen1. Eine Klasse niedermolekularer Verbindungen (Chemoattraktiva) in Pflanzenwurzelexsudaten induziert die chemotaktische Bewegung von PGPR in die Rhizosphäre2. Apfelsäure, Zitronensäure und andere Komponenten in den Wurzelexsudaten stimulieren die Chemotaxis von Bacillus-Stämmen3. Zum Beispiel rekrutieren Glukose, Zitronensäure und Fumarsäure in Maiswurzelexsudaten Bakterien an die Wurzeloberfläche4. D-Galactose, die aus Wurzelexsudaten gewonnen wird, induziert die Chemotaxis von Bacillus velezensis SQR95. Organische Säuren, einschließlich Fumarat, Apfelsäure und Bernsteinat, beeinflussen die Chemotaxis und die Besiedlung verschiedener PGPR im Cajanus cajan - Zea mays Zwischenfruchtsystem6. Oleanolsäure in Reiswurzelexsudaten wirkt als Chemoattraktivum für den Stamm FP357. Andere pflanzliche Exsudate (einschließlich Histidin, Arginin und Aspartat) können eine entscheidende Rolle bei der chemotaktischen Reaktion von Bakterien spielen8. Pflanzenexsudate fungieren als Signal, um die Bewegung von Bakterien zu steuern, was der erste Schritt während der Rhizosphärenbesiedlung ist. Die Pflanzenbesiedlung durch PGPR ist ein Prozess von enormer Relevanz, da PGPR für den Pflanzenwirt von Vorteil sind.

Viele Methoden wurden zur Analyse der bakteriellen Chemotaxis verwendet. Die Schwimmplattenmethode ist eine der zuvor beschriebenen Methoden9. Bei diesem Verfahren wurden Platten mit einem halbfesten Medium hergestellt. Ein chemotaktischer Puffer, der Agar (1,0%, w/v) enthielt, wurde der Platte zugesetzt. Der Puffer wird erhitzt und dann mit dem Chemoattraktivum gemischt. Dann wurden 8 μL Bakteriensuspension tropfenweise in die Mitte der Platte gegeben und die Platte bei 28 °C in einen Inkubator gegeben. Die Platte wurde regelmäßig beobachtet und fotografiert. Der experimentelle Zyklus der Schwimmplattenmethode war jedoch sehr lang. Bei der kapillarartigen Methode10 dient eine Pipettenspitze als Kammer zur Aufnahme von 100 μL Bakteriensuspension. 1 ml Spritzennadel wurde als Kapillare verwendet. In die 100 μL Pipettenspitze wurde eine Spritzennadel mit Chemotraktoren mit unterschiedlichen Konzentrationsgradienten eingeführt. Nach der Inkubation bei Raumtemperatur für 3 h wurde die Spritzennadel entfernt, der Inhalt verdünnt und auf dem Medium plattiert. Die bakterielle Akkumulation in der Spritze wurde durch koloniebildende Einheiten (CFUs) in den Platten dargestellt. Der experimentelle Fehler innerhalb von Replikaten für die kapillarartige Methode war jedoch groß. Eine andere Methode verwendete ein mikrofluidisches SlipChip-Gerät11. Kurz gesagt, Rinderserumalbumin (BSA) -Lösung wurde in alle Kanäle injiziert und mit einem Vakuum entfernt. Die Lösungen, die verschiedene Chemoattraktiva (1 mM-Konzentration nur für den qualitativen Nachweis), Bakterienzellen, die in phosphatgepufferter Kochsalzlösung suspendiert sind, und phosphatgepufferter Kochsalzpuffer (Negativkontrolle) enthielten, wurden den oberen, mittleren bzw. unteren Mikrobohrlöchern zugesetzt. Die Inkubation wurde dann in einer dunklen Umgebung bei Raumtemperatur für 30 min durchgeführt. Die Bakterienzellen wurden dann in den Mikrotrüchtigen nachgewiesen. Das mikrofluidische SlipChip-Gerät war jedoch teuer. Daher hatte jede der oben beschriebenen Methoden Vor- und Nachteile.

Wir haben einen verbesserten Chemotaxis-Assay zur schnellen Identifizierung von rhizobakteriellen Chemoattraktiva in Wurzelexsudaten unter Verwendung steriler Glasobjektträger ohne komplizierte Schritte etabliert. In dieser Studie überwand die Methode durch mehrfache Vergleiche experimenteller Ergebnisse mehrere Mängel herkömmlicher bakterieller Chemotaxis-Methoden. Die Methode reduzierte den Fehler der Plattenzählung und verkürzte den Versuchszyklus. Wenn diese neue Methode zur Identifizierung einer chemoattraktiven Substanz verwendet wird, kann sie 2-3 Tage einsparen und die Kosten für experimentelle Materialien senken.

Protokoll

1. Materialien und Ausrüstung

ANMERKUNG: Bacillus altitudinis LZP02 (CP075052) wurde für diese Studie aus der Rhizosphäre von Reis im Nordosten Chinas isoliert12,13.

  1. Kultur B. altitudinis LZP02 in Luria-Bertani (LB) medium (Pepton, 10 g L-1; NaCl, 8 g L-1 und Hefeextrakt, 5 g L-1) für 10 h. Zellen durch Zentrifugation bei 9.569 x g für 2 min bei 4 °C sammeln und mit 15% Glycerin bei -80 °C lagern.
    HINWEIS: Für dieses Experiment wurden Reissamen (Oryza sativa Longgeng 46) vom Reisforschungsinstitut der Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences zur Verfügung gestellt.

2. Sammlung von Wurzelexsudaten

  1. Verteilen Sie zufällig Reissamen in einer Wachstumskammer.
    HINWEIS: Reissamen wurden mit 30% H2O2 für 30 min sterilisiert und über Nacht in Wasser eingeweicht. Die Bedingungen waren wie folgt: das kontrollierte Licht (16/8 h Hell/Dunkel-Zyklus), die Temperatur (22 ± 2 °C) und die relative Luftfeuchtigkeit ( ͂70%).
  2. Kultivieren Sie Reissamen für eine Woche und fügen Sie zweimal steriles Wasser hinzu.
  3. Wählen Sie Reissämlinge ähnlicher Größe und Pflanze in 50 ml Murashige und Skoog (MS) flüssigem Medium. 48 h bei 22 °C unter aseptischen Bedingungen inkubieren.
    HINWEIS: Reiswurzelexsudate werden in das MS-Medium freigesetzt14,15,16.

3. Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie Analyse von Wurzelexsudaten

  1. 100 μL der Probe (MS-Medium mit Wurzelexsudaten) in einem 1,5 mL Zentrifugenröhrchen auffangen. 20 μL des Extraktionslösungsmittels (Acetonitril-Methanol-Wasser, 2:2:1, einschließlich interner Norm) zugeben. Homogenisieren Sie die Probe bei 45 Hz für 4 min, gefolgt von Ultraschall auf Eis für 5 min in einem Wasserbad.
  2. Wiederholen Sie den Homogenisierungs- und Ultraschallzyklus dreimal. Inkubieren der Probe bei -20 °C für 1 h, gefolgt von einer Zentrifugation bei 133,778 x g und 4 °C für 15 min.
  3. Den resultierenden Überstand auf LC-MS-Fläschchen übertragen und bei -80 °C bis zur UHPLC-QE-Analyse lagern. Bereiten Sie die Proben der Qualitätskontrolle (QC) vor, indem Sie gleiche Teile des Überstands aller Proben mischen.
    HINWEIS: Jedes Probenvolumen betrug im vorgestellten Experiment 600 μL (sechs Replikate pro Experiment).
  4. Durchführung von LC-MS/MS-Analysen mit UHPLC-System, UPLC HSS T3-Säule (2,1 mm x 100 mm, 1,8 μm) und Q Exactive12.
    1. Verwenden Sie 0,1% ige wässrige Ameisensäurelösung und 5 mmol/L wässrige Ammoniumacetatlösung als mobile Phase A und Acetonitril als mobile Phase B. Verwenden Sie Ameisensäure und Ammoniumacetat als positive bzw. negative Ionenmoden.
    2. Stellen Sie den Elutionsgradienten wie folgt ein: 0 min, 1% B; 1 Min., 1% B; 8 min, 99% B. 10 min, 99% B. 10,1 min, 1% B; 12 min, 1% B. Stellen Sie die Durchflussrate und das Injektionsvolumen auf 0,5 ml/min bzw. 2 μL ein.
      HINWEIS: Das Makromolekül (>1.000 Dalton) kann nicht erkannt werden.

4. Chemotaxis-Assay

  1. Bereiten Sie die chemoattraktive wässrige Lösung vor. Stellen Sie sicher, dass es steril ist. Die chemoattraktive Lösung wird mit einem 0,22 μm Bakterienfilter filtriert.
    ANMERKUNG: Die chemoattraktive wässrige Lösung war die aus den LC-MS-Studien erhaltene Einzelsubstanz, gelöst in Wasser. Die Konzentration und das Volumen können entsprechend den verschiedenen Studien angepasst werden. Als Beispiel wurde Zitronensäurelösung verwendet. Alle Aktionen müssen an der Seite einer Lampe ausgeführt werden.
  2. Markieren Sie die mittlere Position des Glasobjektträgers in einem Abstand von 1 cm. Stellen Sie sicher, dass der Glasobjektträger mehrmals auf der Flamme sterilisiert wird.
  3. Fügen Sie die 30 μL chemoattraktive Lösung auf der linken Seite des Glasobjektträgers hinzu. Stellen Sie sicher, dass Bakterien bis zum logarithmischen Stadium (2 x 108 KBE/ml) in LB-Medium kultiviert wurden. Fügen Sie 30 μL der Bakterienlösung auf der rechten Seite des Glasobjektträgers hinzu.
    HINWEIS: Bereiten Sie eine Negativkontrollgruppe mit einem gleichen Volumen sterilen Wassers vor. Die Kochsalzlösung (0,9% NaCI) wurde als Positivkontrolle verwendet, um die durch die intermolekulare Kraft auf das Experiment verursachten Veränderungen zu eliminieren.
  4. Sterilisieren Sie eine Impfschlaufe mehrmals auf der Flamme. Verwenden Sie die Impfschleife, um die chemoattraktive wässrige Lösung mit der Bakterienlösung zu verbinden und sie 20 Minuten lang auf einer sauberen Bank bei Raumtemperatur zu halten.
    HINWEIS: Das Experiment muss in einer windstillen Umgebung durchgeführt werden. Passen Sie die Zeit vor dem Trennen der Verbindungsleitung für Belastungen unterschiedlicher sportlicher Fähigkeiten entsprechend an.
  5. Nach 20 min trennen Sie die Verbindungsleitung mit Filterpapier.
  6. Stellen Sie sicher, dass das 1,5 ml Zentrifugenröhrchen steril ist. Sammeln Sie die chemoattraktive wässrige Lösung auf der linken Seite des Glasobjektträgers. Die Lösung wird in das 1,5 ml sterile Zentrifugenröhrchen gegeben.
  7. Das entsprechende Volumen Safranin in das Zentrifugenröhrchen geben. Sammeln Sie nach 2 Min die mischbaren Flüssigkeiten zum Zählen von Bakterien und zur mikroskopischen Beobachtung mit einer Blutzählkammer.

5. Ergebnisanalyse

  1. Bestimmen Sie die Anzahl der lebensfähigen Mikroorganismen, die mit der folgenden Gleichung angezogen werden:
    figure-protocol-5940
    wobei NBC: Gesamtzahl der Bakterienzellen; N: Anzahl der Bakterien in 80 Gittern.
    HINWEIS: Für die Datenanalyse wurde eine Statistische Analysesoftware verwendet. Der Fehler basierte auf drei verschiedenen replizierten experimentellen Werten und wurde unter Verwendung der Einweg-ANOVA berechnet, gefolgt von der Post-hoc-Analyse der Türkei. P ≤ 0,05 wurde als signifikant angesehen.

Ergebnisse

Insgesamt wurden 584 bzw. 937 bekannte Metaboliten im positiven bzw. negativen Ionenindex nachgewiesen. Frühere Studien haben gezeigt, dass Chemoattraktiva typischerweise organische Säuren, Aminosäuren und Kohlenhydrate sind17,18.

In dieser Studie wurden 16 Arten von Chemoattraktiva aus den LC-MS-Studien in den Reis-Rhizosphären-Exsudaten für nachfolgende Experimente ausgewählt (Tabelle 1). Mit der Schwimmplatten...

Diskussion

Zunehmende Forschungen deuten darauf hin, dass Pflanzen-Bakterien-Interaktionen hauptsächlich in der Rhizosphäre auftreten und durch Wurzelexsudate beeinflusst werden20,21,22,23,24. Pflanzenwurzelexsudate umfassen eine Vielzahl von Primärmetaboliten, darunter Phenolsäuren, organische Säuren und Aminosäuren sowie komplexere Sekundärverbindungen25,26,27.<...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Nr. 31870493), den Key Research and Development Projects in Heilongjiang, China (GA21B007), und den Basic Research Fees of Universities in Heilongjiang Province, China (No. 135409103) unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
2,5-dihydroxybenzoic acidBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.490-79-9
AcetonitrileCNW Technologies75-05-8
Ammonium acetateCNW Technologies631-61-8
Caffeic acidBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.331-39-5
CentrifugeThermo Fisher ScientificHeraeus Fresco17
Citric acidBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.77-92-9
Clean benchShanghai Boxun Industrial Co., Ltd.BJ-CD
Ferulic acidBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.1135-24-6
Formic acidCNW Technologies64-18-6
FructoseBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.57-48-7
GalactoseBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.59-23-4
GlycineBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.56-40-6
Grinding MillShanghai Jingxin Industrial Development
Co., Ltd.		JXFSTPRP-24
HistidineBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.71-00-1
Internal standard: 2-Chloro-L-phenylalanineShanghai Hengbai Biotech C.,Ltd.103616-89-3
LeucineBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.61-90-5
Malic acidBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.6915-15-7
MannoseBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.3458-28-4
Mass SpectrometerThermo Fisher ScientificQ Exactive Focus
MethanolCNW Technologies67-56-1
Optical MicroscopeOlympusBX43
PhenylalanineBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.63-91-2
ProlineBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.147-85-3
ScalesSartoriusBSA124S-CW
SerineBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.56-45-1
ThreonineBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.72-19-5
UHPLCAgilent1290 UHPLC
Ultrasound InstrumentShenzhen Leidebang Electronics
Co., Ltd.		PS-60AL
ValineBeijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd.7004-03-7

Referenzen

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