הערכת חמצון מצע אנרגיה במבחנה עם לכידת CO 2 14

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה קלה לשימוש לבחינת חמצון מצע על ידי מעקב אחר ייצור ¹⁴CO₂ במבחנה.

Abstract

המיטוכונדריה מארחת את המכונות למחזור החומצה הטריקרבוקסילית (TCA) ולשרשרת הובלת האלקטרונים (ETC), המייצרות אדנוזין טריפוספט (ATP) כדי לשמור על הומאוסטזיס של אנרגיה. גלוקוז, חומצות שומן וחומצות אמינו הם מצעי האנרגיה העיקריים המניעים את הנשימה המיטוכונדרית ברוב התאים הסומאטיים. עדויות מראות שלסוגי תאים שונים עשויה להיות העדפה מובהקת למצעים מסוימים. עם זאת, ניצול המצע על ידי תאים שונים בשלד לא נחקר בפירוט. יתר על כן, מכיוון שמטבוליזם תאי מכוון לשינויים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים, הערכות ישירות של תלות במצע בתאי השלד עשויות לספק תובנות חשובות על הפתוגנזה של מחלות עצם.

הפרוטוקול הבא מבוסס על העיקרון של שחרור פחמן דו חמצני ממולקולות מצע לאחר זרחון חמצוני. על ידי שימוש במצעים המכילים אטומי פחמן המסומנים באופן רדיואקטיבי (¹⁴C), השיטה מספקת בדיקה רגישה וקלה לשימוש לקצב חמצון המצע בתרבית תאים. מקרה בוחן עם פראוסטאובלסטים ראשוניים לעומת מקרופאגים שמקורם במח עצם (BMMs) מדגים ניצול שונה של המצעים העיקריים בין שני סוגי התאים.

Introduction

זרחון חמצוני (OXPHOS) באאוקריוטים הוא התהליך שבו חומרי מזון מתפרקים בתוך המיטוכונדריה כדי לשחרר אנרגיה כימית בצורה של ATP באמצעות צריכת חמצן.  קטבוליזם של מצעים שונים בתוך המיטוכונדריה באמצעות מחזור החומצה הטריקרבוקסילית (TCA) מייצר מעט מולקולות ATP ישירות, אלא מאחסן אנרגיה באמצעות הפחתה של נושאי האלקטרונים ניקוטיןמיד אדנין דינוקלאוטיד (NAD⁺) ופלווין אדנין דינוקלאוטיד (FAD⁺). לאחר מכן הנשאים המופחתים מתחמצנים על ידי ETC הממוקם על הממברנה הפנימית של המיטוכונדריה כדי ליצור שיפוע ריכוז פרוטונים על פני הממברנה. הפרוטונים זורמים בסופו של דבר במורד השיפוע שלהם בחזרה לתוך המטריצה המיטוכונדריאלית דרך ATP synthase כדי לייצר ATP. OXPHOS הוא האמצעי היעיל בי....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

השימוש בחומרים רדיואקטיביים (RAM) דורש אישור מראש של ועדת בטיחות ייעודית בכל מוסד. RAMs המשמשים בפרוטוקול זה אושרו על ידי בריאות ובטיחות קרינה סביבתית (EHRS) באוניברסיטת פנסילבניה. השימוש בבעלי חיים דורש אישור מראש של הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) במוסד הביתי. המחקר הבא אושר על ידי IACUC בבית החולים לילדים בפילדלפיה.

1. הכנת פתרונות מלאי ^ל-14מצעים עם תווית C

1. הכינו תמיסת מלאי אלבומין בסרום בקר (BSA) של 4 מ"מ על ידי ערבוב של 11 גרם BSA ו-33.1 מ"ל של מי מלח עם מאגר פוספט (DPBS) של Dulbecco וניעורו בעדינות בטמפרטורת החדר למשך כ-3 שעות עד להמסת BSA במלואה. מחממים את תמיסת המלאי של BSA באמבט....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

בדוגמה זו, שיטת לכידת CO₂ משמשת להשוואת חמצון המצע על ידי פראוסטאובלסטים ראשוניים לעומת BMMs, המשמשים לעתים קרובות עבור אוסטאובלסט במבחנה או התמיינות אוסטאוקלסט או אוסטאוקלסט, בהתאמה. לאחר שהתאים הראשוניים מועברים ומתרבית ב-cMEMα במהלך הלילה, הם בדרך כלל מגיעים ל-80-90% מהמפגש ומציגים .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הפרוטוקול מספק שיטה קלה לשימוש לקביעת קצב החמצון של מצעי אנרגיה עיקריים. זוהי חלופה פשוטה יותר לפרוטוקולים אחרים המשתמשים בצלוחיות המכילות באר מרכזית ומכוסות בפקקי גומי 14,15,16. למרות שהמחקר לדוגמה כאן מבוצע עם תרבית תאים, ניתן להתאים את ה?.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm filters	Sigma-Aldrich	SLGVM33RS	Used to filter BSA solution
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200056	Dissociate cells from cell culture plates
1.5 mL Eppendorf tubes	PR1MA	PR MCT17 RB	Used for reaction incubation
10 cm plates	TPP	93100	Used for cell culture
10 mL syringe	BD	302995	Used to flush marrow from long bones
10% FBS	Atlanta biologicals	S11550	For Cell culture medium preparation
14C-Glucose	PerkinElmer	NEC042X050UC	Used to make hot media
14C-glutamine	PerkinElmer	NEC451050UC	Used to make hot media
14C-oleate	PerkinElmer	NEC317050UC	Used to make hot media
23 G needle	BD	305120	Used to flush marrow from long bones
24-well plates	TPP	92024	Used for cell culture
70 μm cell strainers	MIDSCI	70CELL	Used to filter supernatant during cavarial digestion
Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) dye	Nexcelom Biosciences	CS2-0106	Stains live cells to determine seed density
Bovine Serum Ablumin	Proliant Biologicals	68700	Used for fatty acid conjugation
Cellometer Auto 2000	Nexcelom Biosciences		Determine the number of viable cells
Centrifuge	Thermo Fisher	Legend Micro 21R	Used to pellet cells
Collagenase type II	Worthington	LS004176	Dissociate cells from tissue
Custom MEM alpha	GIBCO	SKU: ME 18459P1	Used to create custom hot media
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Gibco	10010023	Used to dissolve and dilute reagents, and wash culture dishes
Filter Paper	Millipore-Sigma	WHA1001090	Traps CO2 with sodium hydroxide
Glucose	Sigma-Aldrich	g7528	Used to make custom media
HEPES	Gibco	15630080	Traps CO2 during cell culture
L-carnitine	Sigma-Aldrich	C0283	Supplemented for fatty acid oxidation
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	g3126	Used to make custom media
MEM alpha	Thermo	A10490	Cell culture medium
Parafilm	Pecheney Plastic Packaging	PM998	Used to seal cell culture dishes
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15140122	Prevents contamination in cell culture
Perchloric Acid	Sigma-Aldrich	244252	Releases CO2 during metabolic assay
Pyruvate	Sigma-Aldrich	p5280	Used to make custom media
Scintillation Counter	Beckman Coulter	LS6500	Determines radioactivity from the filter paper
Scintillation Fluid	MP Biomedicals	882453	Absorb the energy emitted by RAMs and re-emit it as flashes of light
Scintillation Vial	Fisher Scientific	03-337-1	Reaction containers for scintillation fluid
Sodium carbonate	Sigma-Aldrich	S5761	Balance buffer for medium
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	58045	Traps CO2 during metaboilc assay
Sodium oleate	SANTA CRUZ	SC-215879	BSA conjugated fatty acid preparation
Vaccum filtration 1000	TPP	99950	Filter cMEMα