הערכת חמצון מצע אנרגיה במבחנה עם לכידת CO 2 14

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה קלה לשימוש לבחינת חמצון מצע על ידי מעקב אחר ייצור ¹⁴CO₂ במבחנה.

Abstract

המיטוכונדריה מארחת את המכונות למחזור החומצה הטריקרבוקסילית (TCA) ולשרשרת הובלת האלקטרונים (ETC), המייצרות אדנוזין טריפוספט (ATP) כדי לשמור על הומאוסטזיס של אנרגיה. גלוקוז, חומצות שומן וחומצות אמינו הם מצעי האנרגיה העיקריים המניעים את הנשימה המיטוכונדרית ברוב התאים הסומאטיים. עדויות מראות שלסוגי תאים שונים עשויה להיות העדפה מובהקת למצעים מסוימים. עם זאת, ניצול המצע על ידי תאים שונים בשלד לא נחקר בפירוט. יתר על כן, מכיוון שמטבוליזם תאי מכוון לשינויים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים, הערכות ישירות של תלות במצע בתאי השלד עשויות לספק תובנות חשובות על הפתוגנזה של מחלות עצם.

הפרוטוקול הבא מבוסס על העיקרון של שחרור פחמן דו חמצני ממולקולות מצע לאחר זרחון חמצוני. על ידי שימוש במצעים המכילים אטומי פחמן המסומנים באופן רדיואקטיבי (¹⁴C), השיטה מספקת בדיקה רגישה וקלה לשימוש לקצב חמצון המצע בתרבית תאים. מקרה בוחן עם פראוסטאובלסטים ראשוניים לעומת מקרופאגים שמקורם במח עצם (BMMs) מדגים ניצול שונה של המצעים העיקריים בין שני סוגי התאים.

Introduction

זרחון חמצוני (OXPHOS) באאוקריוטים הוא התהליך שבו חומרי מזון מתפרקים בתוך המיטוכונדריה כדי לשחרר אנרגיה כימית בצורה של ATP באמצעות צריכת חמצן.  קטבוליזם של מצעים שונים בתוך המיטוכונדריה באמצעות מחזור החומצה הטריקרבוקסילית (TCA) מייצר מעט מולקולות ATP ישירות, אלא מאחסן אנרגיה באמצעות הפחתה של נושאי האלקטרונים ניקוטיןמיד אדנין דינוקלאוטיד (NAD⁺) ופלווין אדנין דינוקלאוטיד (FAD⁺). לאחר מכן הנשאים המופחתים מתחמצנים על ידי ETC הממוקם על הממברנה הפנימית של המיטוכונדריה כדי ליצור שיפוע ריכוז פרוטונים על פני הממברנה. הפרוטונים זורמים בסופו של דבר במורד השיפוע שלהם בחזרה לתוך המטריצה המיטוכונדריאלית דרך ATP synthase כדי לייצר ATP. OXPHOS הוא האמצעי היעיל ביותר לייצור ATP מצעי אנרגיה ומועדף בדרך כלל בסביבות אירוביות. בעבר, גליקוליזה אירובית - ייצור של לקטט מגלוקוז בזמן שיש חמצן - נחשבה לפתופיזיולוגית, לעתים קרובות סימן היכר של תאים סרטניים. יותר ויותר, מתגלה כי כמה סוגי תאים נורמליים משתמשים בגליקוליזה אירובית מסיבות שעדיין לא פוענחו במלואן.

גמישות מטבולית היא היכולת של תאים או אורגניזמים להסתגל לדרישות האנרגיה המשתנות ולמקורות הדלק הזמינים. לדוגמה, הביקוש האנרגטי של שרירי השלד נענה בעיקר על ידי OXPHOS במצב יציב אך על ידי גליקוליזה אנאירובית במהלך תרגיל בעצימות גבוהה¹. ככל שמשך הפעילות הגופנית גדל, חמצון הגלוקוז וחומצות השומן תורמים יותר לייצור האנרגיה הכולל². עם זאת, השימוש במצע אינו תלוי רק בזמינות, שכן מצעים מתחרים באופן אנטגוניסטי במהלך חמצון. בעיקר, חמצון חומצות שומן הוכח כמעכב את ניצול הגלוקוז על ידי שרירי השלד בתופעה הידועה בשם אפקט רנדל³. השפעה הדדית הודגמה על ידי מחקרים מאוחרים יותר ^4,5. בנוסף, מחלות רבות קשורות לשינוי בהעדפת המצע ולהתפתחות של חוסר גמישות מטבולית בתאים. לדוגמה, חמצון חומצות שומן מופחת בשריר השלד של חולי סוכרת מסוג II בהשוואה לנבדקי ביקורת רגילים⁶. השינויים המטבוליים בהגדרות המחלה הם נושא לחקירה אינטנסיבית מכיוון שהם עשויים לתרום לפתוגנזה.

חילוף החומרים האנרגטי בסוגי תאי השלד הוא יחסית לא מובן מאליו, אך זכה לתשומת לב בשנים האחרונות⁷. עבודות קודמות הראו כי גליקוליזה אירובית היא מסלול האנרגיה הדומיננטי באוסטאובלסטים קלבריאליים, בעוד שחמצון גלוקוז באמצעות מחזור TCA ממלא תפקיד בהיווצרות אוסטאוקלסט ^8,9. אחרים סיפקו ראיות לחומצות שומן כמקור אנרגיה לאוסטאובלסטים¹⁰. כמו כן, הוכח כי קטבוליזם של גלוטמין תומך בהתמיינות אוסטאובלסט מאבות^{אבותיהם 11,12}. עם זאת, עדיין חסרה הבנה מקיפה של שימוש במצע על ידי סוגי תאי שלד שונים. בנוסף, שינויים בחילוף החומרים התאי במהלך התמיינות תאים או בתגובה לאותות פתולוגיים צפויים לשנות את ניצול מצע הדלק. להלן פרוטוקול קל לשימוש לבדיקת חמצון מצע במבחנה.

Protocol

השימוש בחומרים רדיואקטיביים (RAM) דורש אישור מראש של ועדת בטיחות ייעודית בכל מוסד. RAMs המשמשים בפרוטוקול זה אושרו על ידי בריאות ובטיחות קרינה סביבתית (EHRS) באוניברסיטת פנסילבניה. השימוש בבעלי חיים דורש אישור מראש של הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) במוסד הביתי. המחקר הבא אושר על ידי IACUC בבית החולים לילדים בפילדלפיה.

1. הכנת פתרונות מלאי ^ל-14מצעים עם תווית C

1. הכינו תמיסת מלאי אלבומין בסרום בקר (BSA) של 4 מ"מ על ידי ערבוב של 11 גרם BSA ו-33.1 מ"ל של מי מלח עם מאגר פוספט (DPBS) של Dulbecco וניעורו בעדינות בטמפרטורת החדר למשך כ-3 שעות עד להמסת BSA במלואה. מחממים את תמיסת המלאי של BSA באמבט מים בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
2. 50 μCi ^{יבש באוויר 14}C-oleate (50 μCi/μmol באתנול) בבקבוקון עם המכסה כבוי במשך 8 שעות במכסה מנוע עבודה ייעודי של זיכרון RAM. מוסיפים 312.5 μL של H₂O ולאחר מכן 3.5 מ"ג (11.5 מיקרומול) של נתרן oleate. מערבבים היטב.
3. מחממים את התמיסה המתקבלת ל-70 מעלות צלזיוס באמבטיית מים. הוסף 0.9375 מ"ל של תמיסת המניות BSA שתוכננה מראש כדי להניב תמיסת מלאי אולט חם של 10 mM (המכילה יחס של 1:11.5 של ¹⁴C-oleate לאולט ללא תווית). Aliquot את פתרון המלאי ולאחסן אותו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לשימוש ארוך טווח.
4. יש להשתמש ^ב-14C-גלוקוז ^וב-14C-גלוטמין מיד לאחר ההפשרה.

2. הכנת תווך המכיל ¹⁴מצעים המסומנים ב-C

הערה: כדי להבטיח ריכוזים אמינים של מצעי אנרגיה במדיה, יש להשתמש במדיה מותאמת אישית עם מצעים טריים שנוספו זמן קצר לפני השימוש. כאן נעשה שימוש במדיום חיוני מינימלי מותאם אישית (MEMα) ללא גלוקוז, פירובט, גלוטמין, פנול אדום או נתרן ביקרבונט. עם זאת, יש לקבוע תווך אופטימלי עבור כל סוג תא.

1. שחזרו 8.67 גרם של האבקה הבינונית ב-1 ליטר של מים מטוהרים. הוסף 2.2 גרם של נתרן ביקרבונט כדי להשיג pH של 7.4 ולסנן את התמיסה באמצעות סינון ואקום 0.22 מיקרומטר.
2. הוסיפו מרכיבים טריים כדי להשיג את המדיום השלם (cMEMα) עם ריכוזים סופיים של 5.5 mM גלוקוז, 2 mM גלוטמין, 1 mM פירובט ו-10% סרום בקר עוברי (FBS). תוספים נוספים ל-cMEMα עם 100 mM L-קרניטין ו-10 מיקרומטר HEPES כדי להקל על חמצון חומצות השומן.
3. מיד לפני השימוש, הוסיפו ¹⁴מצעים עם תווית C ל-cMEMα שהוכן לאחרונה כדי ליצור מדיה חמה. כדי להפוך את המדיום החם של האולאט, הוסף את תמיסת האולאט החם של 10 מ"מ ל-cMEMα לריכוז סופי של 100 μM oleate (דילול 1:100, רדיואקטיביות סופית 0.4 μCi/mL).
   הערה: מלאי האולאט החם של 10 mM המכיל יחס של 1:11.5 של אולט חם:קר (ראה שלב 1.3) משמש להשגת רמה פיזיולוגית של 100 μM סה"כ אולאט במדיה תוך מזעור כמות החומר הרדיואקטיבי.
4. הפוך 10 mM מלאי oleate ללא תווית על ידי הוספת 24.36 מ"ג של נתרן oleate ל 2 מ"ל של H₂O באמבט מים ב 70 °C ב 70 ° C במשך ~ 20 דקות עד מומס לחלוטין לפני ערבוב במהירות עם 6 מ"ל של 4 mM BSA תמיסת מלאי מתוכנן מראש ל 70 ° C. מעבירים לאמבטיית מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת ומסננים דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר. Aliquot ולאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לשימוש ארוך טווח.
5. כדי להפוך את הגלוקוז לבינוני חם, הוסיפו ¹⁴C-גלוקוז לריכוז סופי של 1.333 μM (1:4,125 דילול, רדיואקטיביות סופית 0.4 μCi/mL). כדי להפוך את הגלוטמין לבינוני חם, הוסיפו ¹⁴C-גלוטמין לריכוז הסופי של 2 מיקרומטר (1:1,000 דילול, רדיואקטיביות סופית 0.4 μCi/mL).
6. השלימו את מדיום הגלוקוז והגלוטמין החם בתמיסת מלאי של 10 מ"מ של אולאט ללא תווית משלב 2.4 כדי להשיג את הריכוז הסופי של 100 μM oleate, זהה לזה שבמדיום החם של האולאט.

3. הכנת תאים

הערה: פראוסטאובלסטים קלבריים ומקרופאגים של מח עצם משמשים כדוגמאות כאן. המשתמשים צריכים להכין את סוג התא שלהם לפי הפרוטוקולים המתאימים. מטב את הריכוז של קולגן II שישמש לעיכול בניסויי פיילוט מכיוון שהפעילות האנזימטית עשויה להשתנות בין הרבה דברים שונים.

1. בידוד ותרבות של פראוסטאובלסטים קלבריאליים
   1. הקרב את הגורים לאחר הלידה 3-5 (P3-5) על ידי עריפת ראשים והעבר אותם ל-DPBS קר כקרח המכיל פניצילין-סטרפטומיצין (P/S).
   2. חשוף את הקלבריה על ידי הסרת העור והרקמות הרכות. אסוף את האזור האמצעי על-ידי חיתוך הרקמות הסובבות מאחורה לחזית ב-DPBS (איור 1A). מגרדים את המשטחים הפנימיים והחיצוניים של הקלבריה בעדינות באמצעות פינצטה כדי לסייע בשחרור התאים בעת העיכול הבא.
   3. מכינים תמיסה של 2 מ"ג/מ"ל ו-4 מ"ג/מ"ל של קולגן מסוג II ב-DPBS ומסננים כל תמיסה עם מסנן טרי של 0.22 מיקרומטר. מעכלים תחילה את הקלבריה המנוקה עם תמיסת הקולגן של 2 מ"ג/מ"ל למשך 15 דקות ומשליכים את תמיסת העיכול. לעכל את הדגימות המנוקות בתמיסת קולגן 4 מ"ג/מ"ל 3 פעמים במשך 15 דקות בכל פעם, תוך איגום וחיסכון בתמיסת העיכול.
   4. סנן את תמיסת העיכול דרך מסנני תאים של 70 מיקרומטר וצנטריפוגה של הסכל ב-300 × גרם למשך 5 דקות. החייאת גלולת התא ב-cMEMα (ראה שלב 2.2) המכילה 10% FBS ו-P/S.
   5. לספור ולזרוע את התאים ב 4 × 10⁴ תאים / ס"מ² ב 10 ס"מ צלחות. תרבית את התאים באינקובטור 37 °C עם 5% CO₂ במשך 3 ימים.
   6. נתקו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 0.25% טריפסין-EDTA. ספרו וזרעו את התאים בצלחות תרבית תאים של 24 בארות עם cMEMα המכילות 10% FBS ו-P/S ב-7.5 × 10⁵/ס"מ². זרעו לפחות 4 בארות לכל סוג תא לכל מצע ולפחות שלוש בארות נוספות עבור כל סוג תא לספירת תאים לפני הבדיקה.
   7. תרברו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במהלך הלילה לפני בדיקות חמצון המצע.
2. בידוד ותרבות של BMMs
   הערה: תרבית של BMMs דורשת גורם מגרה מושבה מקרופאגים (M-CSF), אשר ניתן לרכוש באופן מסחרי כחלבון רקומביננטי. מדיום מותנה מקו התא CMG14-12 שהונדס כדי לבטא M-CSF הוא חלופה חסכונית המשמשת כאן¹³.
   1. אספו עצם הירך והטיביות מעכברים בני 8 שבועות לאחר הסרת השרירים ורקמות החיבור. חותכים ומשליכים את שני קצות העצמות במספריים חדים.
   2. שטפו את מח העצם מעצם הירך אחת וטיביה אחת לתוך צלחת פטרי בגודל 10 ס"מ עם מזרק המצויד במחט 23 גרם המכילה 15 מ"ל של cMEMα עם 10% FBS, P/S, ו-10% CMG14-12 בינוני מותנה (BMM בינוני). תרבית את התאים בצלחת פטרי באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂.
   3. לאחר 3 ימים, יש להשליך את מדיית התרבות ולשטוף עם DPBS. נתקו את התאים המחוברים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 0.25% טריפסין-EDTA למשך 5 דקות. צנטריפוגה והחזרת גלולת התא בתווך BMM.
   4. לספור ולזרוע את התאים בלוחות תרבית תאים של 24 בארות ב-7.5 × 10⁵/ס"מ² באותו אופן שתואר ב-3.1.6. תרבית ב 37 מעלות צלזיוס לילה במדיום BMM לפני תחילת הבדיקות.

4. בדיקת חמצון מצע עם מלכודת CO₂

הערה: יש לקבוע צפיפות זריעה מתאימה עבור כל סוג תא כדי להשיג מפגש של 80-90% לפני תחילת הבדיקה. שים לב שצפיפות התאים יכולה להשפיע על המצב המטבולי של התאים.

1. שטפו את התאים בבארות הנוספות פעמיים באמצעות DPBS. נתקו את התאים עם 0.25% טריפסין-EDTA ותאי תערובת של 20 μL שעברו החייאה ב-DPBS עם 20 μL של תמיסת צבע מסחרית מוכנה לשימוש של 20 מיקרול'ידין כתום/פרופידיום יודיד (AO/PI). קבע את מספר התאים החיים באמצעות מונה תאים אוטומטי ורשום את המספר לחישובים סופיים.
2. לשטוף את התאים בבארות הבדיקה פעמיים עם DPBS. הוסיפו 500 μL של מדיום חם לכל בדיקה היטב במכסה התרביות המיועד ל-RAM. אטמו את הצלחות בפרפילם ודגרו את התאים באינקובטור המיועד ל-RAM ב-37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות.
3. במהלך הדגירה, חותכים את נייר הסינון לחתיכות עגולות מעט גדולות יותר מהשטח שבתוך המכסה של צינורות מיקרו-צנטריפוג' של 1.5 מ"ל ומכניסים את הנייר בנוחות לתוך המכסה (איור 1B). הוסיפו 200 μL של 1 M חומצה פרכלורית לכל צינור ו-20 μL של נתרן הידרוקסיד לנייר הסינון המותקן בתוך המכסה.
4. לאחר הדגירה של התאים, מעבירים 400 μL של מדיום תרבית מכל באר לצינורות המוכנים וסוגרים את הכובעים מיד. השאירו את הצינורות במדף צינורות בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.
5. במהלך הדגירה, קבעו בקבוקון סקינטילציה לכל צינור ומלאו אותו ב-4 מ"ל של נוזל ציצית. מעבירים כל פיסת נייר סינון לבקבוקון חרטום ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
6. בצע בדיקות מגבונים על מכסה המנוע של תרבית הרקמה, אמבט המים (המשמש להכנת ¹⁴C-oleate), מקרר, אינקובטור, כיור, קרקע וכל אזור עבודה אחר לזיהום זיכרון RAM פוטנציאלי. מכניסים את מגבוני הנייר לבקבוקוני סקינטילציה המכילים נוזל סקינטילציה.
7. מדוד רדיואקטיביות ^{של 14}C בבקבוקוני ה-scintillation באמצעות מונה נצנוץ. הקלט את תוצאות הקריאה. נטרל את סביבת העבודה בהתאם להנחיות בטיחות הקרינה במידת הצורך.

5. ניתוח נתונים

הערה: בהנחה שכל מצע מחומצן באופן מלא כדי לשחרר CO₂, ניתן לחשב את קצב חמצון המצע מהרדיואקטיביות CO₂ הלכודה.

1. חישוב קצב חמצון המצע באמצעות Eq (1) וערכי X, Y ו-Z המופיעים בטבלה 1 עבור מצעים שונים.
   קצב חמצון המצע (μmol/cell/h) =    (1)
   1. חשב היטב את סך ההתפוררות לדקה (DPM) עבור כל תגובה. עבור X, השתמש בערך DPM (קריאת מונה נצנוץ) מ-0.4 מ"ל של מדיום התגובה המשמש ללכידת CO₂ מתוך 0.5 מ"ל של מדיום התגובה הכולל. לכן, ה-DPM הכולל מכל תגובה היטב הוא X × 1.25.
   2. חלקו את ה-DPM הכולל בפקטור של 2,220,000 כדי להמיר ל-μCi.
   3. המרת הרדיואקטיביות ב-μCi למספר של ¹⁴מולקולות המסומנות ב-C. חלק את ערך μCi בפעילות הספציפית (Y) של כל מצע מסומן. השתמש בערכי Y הבאים (טבלה 1): ¹⁴C-גלוקוז: 300 mCi/mmol; ¹⁴ C-גלוטמין: 200 mCi/mmol; ¹⁴ C-oleate: 50 mCi/mmol.
   4. חשב את המספר הכולל של מולקולות מחומצנות ^מ-14המולקולות המחומצונות המסומנות כ-C על-ידי הכפלת האחרונה בגורם הדילול החם לסך הכל (Z). השתמש בערכי Z הבאים (טבלה 1): גלוקוז: 4,125; גלוטמין: 1,000; oleate: 12.5.
   5. חלקו את המכפלה המתקבלת במספר תא (cell#) וב-4 (עבור זמן התגובה של 4 שעות) כדי לקבוע את קצב חמצון המצע לכל תא. השתמש בתא# שנקבע בבארות המקבילות בתחילת הבדיקה.

תוצאות

בדוגמה זו, שיטת לכידת CO₂ משמשת להשוואת חמצון המצע על ידי פראוסטאובלסטים ראשוניים לעומת BMMs, המשמשים לעתים קרובות עבור אוסטאובלסט במבחנה או התמיינות אוסטאוקלסט או אוסטאוקלסט, בהתאמה. לאחר שהתאים הראשוניים מועברים ומתרבית ב-cMEMα במהלך הלילה, הם בדרך כלל מגיעים ל-80-90% מהמפגש ומציגים ...

Discussion

הפרוטוקול מספק שיטה קלה לשימוש לקביעת קצב החמצון של מצעי אנרגיה עיקריים. זוהי חלופה פשוטה יותר לפרוטוקולים אחרים המשתמשים בצלוחיות המכילות באר מרכזית ומכוסות בפקקי גומי 14,15,16. למרות שהמחקר לדוגמה כאן מבוצע עם תרבית תאים, ניתן להתאים את ה?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm filters	Sigma-Aldrich	SLGVM33RS	Used to filter BSA solution
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200056	Dissociate cells from cell culture plates
1.5 mL Eppendorf tubes	PR1MA	PR MCT17 RB	Used for reaction incubation
10 cm plates	TPP	93100	Used for cell culture
10 mL syringe	BD	302995	Used to flush marrow from long bones
10% FBS	Atlanta biologicals	S11550	For Cell culture medium preparation
14C-Glucose	PerkinElmer	NEC042X050UC	Used to make hot media
14C-glutamine	PerkinElmer	NEC451050UC	Used to make hot media
14C-oleate	PerkinElmer	NEC317050UC	Used to make hot media
23 G needle	BD	305120	Used to flush marrow from long bones
24-well plates	TPP	92024	Used for cell culture
70 μm cell strainers	MIDSCI	70CELL	Used to filter supernatant during cavarial digestion
Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) dye	Nexcelom Biosciences	CS2-0106	Stains live cells to determine seed density
Bovine Serum Ablumin	Proliant Biologicals	68700	Used for fatty acid conjugation
Cellometer Auto 2000	Nexcelom Biosciences		Determine the number of viable cells
Centrifuge	Thermo Fisher	Legend Micro 21R	Used to pellet cells
Collagenase type II	Worthington	LS004176	Dissociate cells from tissue
Custom MEM alpha	GIBCO	SKU: ME 18459P1	Used to create custom hot media
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Gibco	10010023	Used to dissolve and dilute reagents, and wash culture dishes
Filter Paper	Millipore-Sigma	WHA1001090	Traps CO2 with sodium hydroxide
Glucose	Sigma-Aldrich	g7528	Used to make custom media
HEPES	Gibco	15630080	Traps CO2 during cell culture
L-carnitine	Sigma-Aldrich	C0283	Supplemented for fatty acid oxidation
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	g3126	Used to make custom media
MEM alpha	Thermo	A10490	Cell culture medium
Parafilm	Pecheney Plastic Packaging	PM998	Used to seal cell culture dishes
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15140122	Prevents contamination in cell culture
Perchloric Acid	Sigma-Aldrich	244252	Releases CO2 during metabolic assay
Pyruvate	Sigma-Aldrich	p5280	Used to make custom media
Scintillation Counter	Beckman Coulter	LS6500	Determines radioactivity from the filter paper
Scintillation Fluid	MP Biomedicals	882453	Absorb the energy emitted by RAMs and re-emit it as flashes of light
Scintillation Vial	Fisher Scientific	03-337-1	Reaction containers for scintillation fluid
Sodium carbonate	Sigma-Aldrich	S5761	Balance buffer for medium
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	58045	Traps CO2 during metaboilc assay
Sodium oleate	SANTA CRUZ	SC-215879	BSA conjugated fatty acid preparation
Vaccum filtration 1000	TPP	99950	Filter cMEMα