Valutazione dell'ossidazione del substrato energetico in vitro con 14INtrappolamento di CO 2

Riepilogo

Questo protocollo descrive un metodo facile da usare per esaminare l'ossidazione del substrato monitorando la produzione di ¹⁴CO₂ in vitro.

Abstract

I mitocondri ospitano i macchinari per il ciclo dell'acido tricarbossilico (TCA) e la catena di trasporto degli elettroni (ETC), che generano adenosina trifosfato (ATP) per mantenere l'omeostasi energetica. Glucosio, acidi grassi e amminoacidi sono i principali substrati energetici che alimentano la respirazione mitocondriale nella maggior parte delle cellule somatiche. L'evidenza mostra che diversi tipi di cellule possono avere una netta preferenza per determinati substrati. Tuttavia, l'utilizzo del substrato da parte di varie cellule nello scheletro non è stato studiato in dettaglio. Inoltre, poiché il metabolismo cellulare è in sintonia con i cambiamenti fisiologici e fisiopatologici, le valutazioni dirette della dipendenza dal substrato nelle cellule scheletriche possono fornire importanti informazioni sulla patogenesi delle malattie ossee.

Il seguente protocollo si basa sul principio del rilascio di anidride carbonica dalle molecole del substrato dopo fosforilazione ossidativa. Utilizzando substrati contenenti atomi di carbonio marcati radioattivamente (¹⁴C), il metodo fornisce un saggio sensibile e facile da usare per il tasso di ossidazione del substrato in coltura cellulare. Un caso di studio con preosteoblasti calvariali primari rispetto a macrofagi derivati dal midollo osseo (BMM) dimostra un diverso utilizzo dei substrati principali tra i due tipi di cellule.

Introduzione

La fosforilazione ossidativa (OXPHOS) negli eucarioti è il processo attraverso il quale i nutrienti vengono scomposti all'interno dei mitocondri per rilasciare energia chimica sotto forma di ATP attraverso il consumo di ossigeno.  Il catabolismo di vari substrati all'interno dei mitocondri attraverso il ciclo dell'acido tricarbossilico (TCA) genera direttamente poche molecole di ATP, ma piuttosto immagazzina energia attraverso la riduzione dei portatori di elettroni nicotinamide adenina dinucleotide (NAD ⁺) e flavina adenina dinucleotide (FAD ⁺). I portatori ridotti vengono quindi ossidati da ETC situati sulla membrana interna dei mitocondri per generare un gradiente di concentrazione protonica attraverso la membrana. I protoni alla fine fluiscono lungo il loro gradiente nella matrice mitocondriale attraverso l'ATP sintasi per produrre ATP. OXPHOS è il mezzo più efficiente di produzione di ATP da substrati energetici e generalmente preferito in ambienti aerobici. In precedenza, la glicolisi aerobica - produzione di lattato dal glucosio mentre l'ossigeno è presente - era ritenuta fisiopatologica, spesso un segno distintivo delle cellule tumorali. Sempre di più, si sta scoprendo che alcuni tipi di cellule normali usano la glicolisi aerobica per ragioni che devono ancora essere completamente decifrate.

La flessibilità metabolica è la capacità delle cellule o degli organismi di adattarsi alle mutevoli richieste di energia e alle fonti di combustibile disponibili. Ad esempio, la domanda energetica del muscolo scheletrico è soddisfatta principalmente da OXPHOS allo stato stazionario, ma dalla glicolisi anaerobica durante l'esercizio ad alta intensità¹. Con l'aumentare della durata dell'esercizio, l'ossidazione del glucosio e degli acidi grassi contribuisce maggiormente alla produzione complessiva di energia². Tuttavia, l'uso del substrato non dipende solo dalla disponibilità, poiché i substrati competono antagonisticamente durante l'ossidazione. In particolare, l'ossidazione degli acidi grassi ha dimostrato di inibire l'utilizzo del glucosio da parte del muscolo scheletrico in un fenomeno noto come effetto Randle³. Un effetto reciproco è stato dimostrato da studi successivi ^4,5. Inoltre, molte malattie sono associate a un cambiamento nella preferenza del substrato e allo sviluppo di inflessibilità metabolica nelle cellule. Ad esempio, l'ossidazione degli acidi grassi è ridotta nel muscolo scheletrico dei pazienti diabetici di tipo II rispetto ai normali soggetti di controllo⁶. I cambiamenti metabolici nelle impostazioni della malattia sono oggetto di intense indagini in quanto possono contribuire alla patogenesi.

Il metabolismo energetico nei tipi di cellule scheletriche è relativamente poco studiato, ma ha attirato l'attenzione negli ultimi anni⁷. Lavori precedenti hanno dimostrato che la glicolisi aerobica è la via energetica dominante negli osteoblasti calvariali, mentre l'ossidazione del glucosio attraverso il ciclo TCA svolge un ruolo nella formazione degli osteoclasti ^8,9. Altri hanno fornito prove per gli acidi grassi come fonte di energia per gli osteoblasti¹⁰. Il catabolismo della glutammina ha anche dimostrato di supportare la differenziazione degli osteoblasti dai progenitori^11,12. Tuttavia, manca ancora una comprensione completa dell'utilizzo del substrato da parte di vari tipi di cellule scheletriche. Inoltre, si prevede che i cambiamenti nel metabolismo cellulare durante la differenziazione cellulare o in risposta a segnali patologici alterino l'utilizzo del substrato del carburante. Di seguito è descritto un protocollo di facile utilizzo per l'analisi dell'ossidazione del substrato in vitro.

Protocollo

L'uso di materiali radioattivi (RAM) richiede l'approvazione preventiva di un comitato di sicurezza designato presso ciascuna istituzione. Le RAM utilizzate in questo protocollo sono state approvate da Environmental Health & Radiation Safety (EHRS) presso l'Università della Pennsylvania. L'uso di animali richiede l'approvazione preventiva da parte del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) presso l'istituzione di origine. Il seguente studio è stato approvato dalla IACUC presso il Children's Hospital di Philadelphia.

1. Preparazione di soluzioni stock per ¹⁴substrati con etichetta C

1. Produrre 4 mM di soluzione madre di albumina sierica bovina (BSA) mescolando 11 g di BSA e 33,1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS) di Dulbecco e agitandola delicatamente a temperatura ambiente per ~ 3 ore fino a quando BSA non è completamente disciolto. Riscaldare la soluzione madre BSA a bagnomaria a 70 °C prima dell'uso.
2. Asciugare all'aria 50 μCi ¹⁴C-oleato (50 μCi/μmol in etanolo) nel flaconcino con il coperchio spento per 8 ore in una cappa di lavoro RAM designata. Aggiungere 312,5 μL di H₂O e poi 3,5 mg (11,5 μmol) di oleato di sodio. Mescolare accuratamente.
3. Riscaldare la soluzione risultante a 70 °C a bagnomaria. Aggiungere 0,9375 mL della soluzione madre BSA preriscaldata per produrre 10 mM di soluzione madre di oleato caldo (contenente un rapporto 1:11,5 di ¹⁴C-oleato e oleato non etichettato). Aliquotare la soluzione madre e conservarla a -20 °C per un uso a lungo termine.
4. Utilizzare ¹⁴C-glucosio e ¹⁴C-glutammina direttamente dopo lo scongelamento.

2. Preparazione di un mezzo contenente ¹⁴substrati marcati con etichetta C

NOTA: per garantire concentrazioni affidabili di substrati energetici nel fluido, è necessario utilizzare supporti personalizzati con substrati freschi aggiunti poco prima dell'uso. Qui viene utilizzato un minimum essential medium (MEMα) su misura senza glucosio, piruvato, glutammina, rosso fenolo o bicarbonato di sodio. Tuttavia, un mezzo ottimale dovrebbe essere determinato per ogni tipo di cellula.

1. Ricostituire 8,67 g di polvere media in 1 L di acqua purificata. Aggiungere 2,2 g di bicarbonato di sodio per ottenere un pH di 7,4 e filtrare la soluzione utilizzando la filtrazione sotto vuoto da 0,22 μm.
2. Aggiungere ingredienti freschi per ottenere il mezzo completo (cMEMα) con concentrazioni finali di 5,5 mM di glucosio, 2 mM di glutammina, 1 mM di piruvato e 10% di siero bovino fetale (FBS). Integrare ulteriormente cMEMα con 100 mM di L-carnitina e 10 μM HEPES per facilitare l'ossidazione degli acidi grassi.
3. Immediatamente prima dell'uso, aggiungere ¹⁴substrati con etichetta C a cMEMα appena preparato per ottenere supporti caldi. Per rendere il mezzo oleato caldo, aggiungere la soluzione madre di oleato caldo da 10 mM a cMEMα per una concentrazione finale di oleato di 100 μM (diluizione 1:100, radioattività finale 0,4 μCi/mL).
   NOTA: il materiale oleato caldo da 10 mM contenente un rapporto 1:11,5 di oleato caldo/freddo (vedere punto 1.3) viene utilizzato per raggiungere un livello fisiologico di oleato totale di 100 μM nel fluido riducendo al minimo la quantità di materiale radioattivo.
4. Produrre 10 mM di brodo di oleato non etichettato aggiungendo 24,36 mg di oleato di sodio a 2 mL di H₂O a bagnomaria a 70 °C per ~20 minuti fino a completa dissoluzione prima di mescolare rapidamente con 6 mL della soluzione madre BSA da 4 mM preriscaldata a 70 °C. Trasferire a bagnomaria a 37 °C per 1 ora e filtrare attraverso un filtro da 0,22 μm. Aliquota e conservazione a -20 °C per uso a lungo termine.
5. Per produrre glucosio mezzo caldo, aggiungere ¹⁴C-glucosio ad una concentrazione finale di 1,333 μM (diluizione 1:4.125, radioattività finale 0,4 μCi/mL). Per rendere la glutammina media calda, aggiungere ¹⁴C-glutammina alla concentrazione finale di 2 μM (diluizione 1:1.000, radioattività finale 0,4 μCi/mL).
6. Integrare il mezzo caldo di glucosio e glutammina con una soluzione madre da 10 mM di oleato non marcato dal punto 2.4 per ottenere la concentrazione finale di oleato di 100 μM, la stessa di quella nel mezzo caldo oleato.

3. Preparazione delle cellule

NOTA: I preosteoblasti calvariali e i macrofagi del midollo osseo sono usati come esempi qui. Gli utenti dovrebbero preparare il loro tipo di cella di scelta in base ai protocolli appropriati. Ottimizzare la concentrazione di collagenasi II da utilizzare per la digestione in esperimenti pilota in quanto l'attività enzimatica può variare tra diversi lotti.

1. Isolamento e coltura dei preosteoblasti calvariali
   1. Sacrificare i cuccioli postnatali giorno 3-5 (P3-5) per decapitazione e trasferirli in DPBS ghiacciato contenente penicillina-streptomicina (P / S).
   2. Esporre la calvaria rimuovendo la pelle e i tessuti molli. Raccogliere la regione centrale tagliando via i tessuti circostanti da dietro a davanti in DPBS (Figura 1A). Gratta delicatamente le superfici interne ed esterne della calvaria usando una pinzetta per aiutare a rilasciare le cellule dopo la successiva digestione.
   3. Preparare una soluzione da 2 mg/mL e una soluzione da 4 mg/mL di collagenasi di tipo II in DPBS e filtrare ogni soluzione con un filtro fresco da 0,22 μm. Digerire prima la calvaria pulita con la soluzione di collagenasi da 2 mg/ mL per 15 minuti e scartare la soluzione di digestione. Digerire i campioni puliti in soluzione di collagenasi da 4 mg/mL 3 volte per 15 minuti ogni volta, mettendo in comune e risparmiando la soluzione di digestione.
   4. Filtrare la soluzione di digestione attraverso filtri cellulari da 70 μm e centrifugare il filtrato a 300 × g per 5 minuti. Sospendere il pellet cellulare in cMEMα (vedere punto 2.2) contenente il 10% di FBS e P/S.
   5. Contare e seminare le cellule a 4 × 10⁴ cellule/cm² in piastre da 10 cm. Coltivare le cellule in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO₂ per 3 giorni.
   6. Dissociare le cellule a 37 °C con lo 0,25% di tripsina-EDTA. Contare e seminare le cellule in piastre di coltura cellulare a 24 pozzetti con cMEMα contenente il 10% di FBS e P/S a 7,5 × 10⁵/cm². Seminare almeno 4 pozzetti per tipo di cellula per substrato e almeno tre pozzetti extra per ogni tipo di cellula per il conteggio delle cellule prima del test.
   7. Coltivare le cellule a 37 °C durante la notte prima dei test di ossidazione del substrato.
2. Isolamento e cultura dei BMM
   NOTA: La coltura di BBM richiede un fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF), che può essere acquistato commercialmente come proteina ricombinante. Il mezzo condizionato dalla linea cellulare CMG14-12 progettato per esprimere M-CSF è un'alternativa economica utilizzata qui¹³.
   1. Raccogli femori e tibie da topi di 8 settimane dopo aver rimosso il muscolo e i tessuti connettivi. Tagliare e scartare entrambe le estremità delle ossa con forbici affilate.
   2. Sciacquare il midollo osseo da un femore e una tibia in una capsula di Petri di 10 cm con una siringa dotata di un ago da 23 G contenente 15 ml di cMEMα con il 10% di FBS, P/S e il 10% di CMG14-12 di mezzo condizionato (mezzo BMM). Coltivare le cellule nella capsula di Petri in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO₂.
   3. Dopo 3 giorni, scartare il terreno di coltura e risciacquare con DPBS. Dissociare le cellule attaccate a 37 °C con lo 0,25% di tripsina-EDTA per 5 minuti. Centrifugare e risospendare il pellet cellulare nel mezzo BMM.
   4. Contare e seminare le cellule in piastre di coltura cellulare a 24 pozzetti a 7,5 × 10⁵/cm² nello stesso modo descritto al punto 3.1.6. Coltura a 37 °C durante la notte nel mezzo BMM prima di iniziare i test.

4. Saggio di ossidazione del substrato con trappola di CO₂

NOTA: deve essere determinata una densità di semina appropriata per ciascun tipo di cellula per raggiungere una confluenza dell'80-90% prima dell'inizio del test. Si noti che la densità cellulare può influenzare lo stato metabolico delle cellule.

1. Lavare le cellule nei pozzetti extra due volte con DPBS. Dissociare le cellule con lo 0,25% di tripsina-EDTA e cellule miste da 20 μL risospese in DPBS con 20 μL di acridina arancia/ioduro di propidio (AO/PI) pronta all'uso soluzione colorante commerciale. Determinare il numero di cellule vive con un contatore di celle automatizzato e registrare il numero per i calcoli finali.
2. Lavare le cellule nei pozzetti di analisi due volte con DPBS. Aggiungere 500 μL di mezzo caldo a ciascun test bene nella cappa di coltura tissutale designata dalla RAM. Sigillare le piastre con parafilm e incubare le celle in un incubatore designato dalla RAM a 37 °C per 4 ore.
3. Durante l'incubazione, tagliare la carta da filtro in pezzi circolari leggermente più grandi dell'area all'interno del cappuccio di tubi di microcentrifuga da 1,5 ml e inserire la carta comodamente nel cappuccio (Figura 1B). Aggiungere 200 μL di acido perclorico 1 M a ciascun tubo e 20 μL di idrossido di sodio alla carta da filtro montata all'interno del tappo.
4. Dopo l'incubazione delle cellule, trasferire 400 μL di terreno di coltura da ciascun pozzetto ai tubi preparati e chiudere immediatamente i tappi. Lasciare i tubi in un portatubi a temperatura ambiente per 1 ora.
5. Durante l'incubazione, impostare una fiala di scintillazione per ogni tubo e riempirla con 4 ml di liquido di scintillazione. Trasferire ogni pezzo di carta da filtro in un flaconcino scintillante e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.
6. Eseguire test di pulizia sulla cappa di coltura del tessuto, sul bagno d'acqua (utilizzato per la preparazione ^{di 14}C-oleato), sul frigorifero, sull'incubatore, sul lavandino, sul terreno e su qualsiasi altra area di lavoro per una potenziale contaminazione da RAM. Mettere le salviette di carta in flaconcini di scintillazione contenenti liquido di scintillazione.
7. Misurare la radioattività ^{di 14}C nei flaconcini di scintillazione con un contatore di scintillazione. Registrare i risultati di lettura. Decontaminare l'ambiente di lavoro secondo le linee guida sulla sicurezza delle radiazioni, se necessario.

5. Analisi dei dati

NOTA: Supponendo che ogni substrato sia completamente ossidato per rilasciare CO₂, il tasso di ossidazione del substrato può essere calcolato dalla radioattività CO_{2 intrappolata} .

1. Calcolare il tasso di ossidazione del substrato utilizzando Eq (1) e i valori X, Y e Z indicati nella Tabella 1 per diversi substrati.
   Tasso di ossidazione del substrato (μmol/cell/h) =    (1)
   1. Calcola le disintegrazioni totali al minuto (DPM) per ogni reazione bene. Per X, utilizzare il valore DPM (lettura del contatore di scintillazione) da 0,4 mL del mezzo di reazione utilizzato per l'intrappolamento di CO₂ su 0,5 mL del mezzo di reazione totale. Pertanto, il DPM totale di ciascun pozzo di reazione è X × 1,25.
   2. Dividere il DPM totale per un fattore di 2.220.000 da convertire in μCi.
   3. Convertire la radioattività in μCi nel numero di ¹⁴molecole marcate con C. Dividere il valore μCi per l'attività specifica (Y) di ciascun substrato etichettato. Utilizzare i seguenti valori Y (Tabella 1): ¹⁴C-glucosio: 300 mCi/mmol; ^{14 anni} C-glutammina: 200 mCi/mmol; ^{14 anni} C-oleato: 50 mCi/mmol.
   4. Calcola il numero totale di molecole ossidate dalle ¹⁴molecole marcate C ossidate moltiplicando queste ultime per il fattore di diluizione da caldo a totale (Z). Utilizzare i seguenti valori Z (Tabella 1): Glucosio: 4.125; glutammina: 1.000; oleato: 12.5.
   5. Dividere il prodotto risultante per numero di cella (cell#) e 4 (per il tempo di reazione di 4 h) per determinare il tasso di ossidazione del substrato per cella. Utilizzare il cell# determinato nei pozzetti paralleli all'inizio del test.

Risultati

In questo esempio, il metodo di intrappolamento della CO₂ viene utilizzato per confrontare l'ossidazione del substrato da parte dei preosteoblasti calvariali primari rispetto ai BMM, che vengono spesso utilizzati rispettivamente per la differenziazione in vitro degli osteoblasti o degli osteoclasti. Dopo che le cellule primarie sono passate e coltivate in cMEMα durante la notte, in genere raggiungono l'80-90% della confluenza e mostrano la loro morfologia caratteristica. I preosteoblasti calvariali s...

Discussione

Il protocollo fornisce un metodo facile da usare per determinare il tasso di ossidazione dei principali substrati energetici. È un'alternativa più semplice ad altri protocolli che utilizzano palloni contenenti un pozzo centrale e ricoperti da tappi di gomma 14,15,16. Sebbene lo studio di esempio qui sia eseguito con coltura cellulare, il metodo può essere facilmente adattato per espianti tissutali o omogeneizzati tissutali co...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm filters	Sigma-Aldrich	SLGVM33RS	Used to filter BSA solution
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200056	Dissociate cells from cell culture plates
1.5 mL Eppendorf tubes	PR1MA	PR MCT17 RB	Used for reaction incubation
10 cm plates	TPP	93100	Used for cell culture
10 mL syringe	BD	302995	Used to flush marrow from long bones
10% FBS	Atlanta biologicals	S11550	For Cell culture medium preparation
14C-Glucose	PerkinElmer	NEC042X050UC	Used to make hot media
14C-glutamine	PerkinElmer	NEC451050UC	Used to make hot media
14C-oleate	PerkinElmer	NEC317050UC	Used to make hot media
23 G needle	BD	305120	Used to flush marrow from long bones
24-well plates	TPP	92024	Used for cell culture
70 μm cell strainers	MIDSCI	70CELL	Used to filter supernatant during cavarial digestion
Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) dye	Nexcelom Biosciences	CS2-0106	Stains live cells to determine seed density
Bovine Serum Ablumin	Proliant Biologicals	68700	Used for fatty acid conjugation
Cellometer Auto 2000	Nexcelom Biosciences		Determine the number of viable cells
Centrifuge	Thermo Fisher	Legend Micro 21R	Used to pellet cells
Collagenase type II	Worthington	LS004176	Dissociate cells from tissue
Custom MEM alpha	GIBCO	SKU: ME 18459P1	Used to create custom hot media
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Gibco	10010023	Used to dissolve and dilute reagents, and wash culture dishes
Filter Paper	Millipore-Sigma	WHA1001090	Traps CO2 with sodium hydroxide
Glucose	Sigma-Aldrich	g7528	Used to make custom media
HEPES	Gibco	15630080	Traps CO2 during cell culture
L-carnitine	Sigma-Aldrich	C0283	Supplemented for fatty acid oxidation
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	g3126	Used to make custom media
MEM alpha	Thermo	A10490	Cell culture medium
Parafilm	Pecheney Plastic Packaging	PM998	Used to seal cell culture dishes
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15140122	Prevents contamination in cell culture
Perchloric Acid	Sigma-Aldrich	244252	Releases CO2 during metabolic assay
Pyruvate	Sigma-Aldrich	p5280	Used to make custom media
Scintillation Counter	Beckman Coulter	LS6500	Determines radioactivity from the filter paper
Scintillation Fluid	MP Biomedicals	882453	Absorb the energy emitted by RAMs and re-emit it as flashes of light
Scintillation Vial	Fisher Scientific	03-337-1	Reaction containers for scintillation fluid
Sodium carbonate	Sigma-Aldrich	S5761	Balance buffer for medium
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	58045	Traps CO2 during metaboilc assay
Sodium oleate	SANTA CRUZ	SC-215879	BSA conjugated fatty acid preparation
Vaccum filtration 1000	TPP	99950	Filter cMEMα