Оценка окисления энергетического субстрата in vitro с улавливанием 14CO2

Резюме

Этот протокол описывает простой в использовании метод исследования окисления субстрата путем отслеживания производства ¹⁴CO₂ in vitro.

Аннотация

Митохондрии содержат механизм для цикла трикарбоновой кислоты (TCA) и цепи переноса электронов (ETC), которые генерируют аденозинтрифосфат (АТФ) для поддержания энергетического гомеостаза. Глюкоза, жирные кислоты и аминокислоты являются основными энергетическими субстратами, подпитывающими митохондриальное дыхание в большинстве соматических клеток. Фактические данные показывают, что различные типы клеток могут иметь явное предпочтение определенным субстратам. Однако использование субстрата различными клетками скелета подробно не изучено. Более того, поскольку клеточный метаболизм настроен на физиологические и патофизиологические изменения, прямые оценки субстратной зависимости в скелетных клетках могут дать важное представление о патогенезе заболеваний костей.

Следующий протокол основан на принципе высвобождения углекислого газа из молекул субстрата после окислительного фосфорилирования. Используя субстраты, содержащие радиоактивно меченые атомы углерода (¹⁴С), способ обеспечивает чувствительный и простой в использовании анализ скорости окисления субстрата в клеточной культуре. Тематическое исследование с первичными кальвариальными преостеобластами по сравнению с макрофагами, полученными из костного мозга (BMM), демонстрирует различное использование основных субстратов между двумя типами клеток.

Введение

Окислительное фосфорилирование (OXPHOS) у эукариот — это процесс, посредством которого питательные вещества расщепляются внутри митохондрий для высвобождения химической энергии в виде АТФ за счет потребления кислорода.  Катаболизм различных субстратов внутри митохондрий через цикл трикарбоновой кислоты (TCA) генерирует несколько молекул АТФ напрямую, а скорее накапливает энергию за счет восстановления носителей электронов никотинамидадениндинуклеотида (NAD⁺) и флавинадениндинуклеотида (FAD⁺). Восстановленные носители затем окисляются ETC, расположенными на внутренней мембране митохондрий, чтобы генерировать градиент концентрации протонов по всей ....

протокол

Использование радиоактивных материалов (ОЗУ) требует предварительного одобрения назначенного комитета по безопасности в каждом учреждении. RAM, используемые в этом протоколе, были одобрены Environmental Health & Radiation Safety (EHRS) в Университете Пенсильвании. Использование животных требует предварительного одобрения Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) в домашнем учреждении. Следующее исследование было одобрено IACUC в Детской больнице Филадельфии.

1. Подготовка стоковых растворов для ¹⁴субстратов с маркировкой C

1. Сделайте 4 мМ раствора сывороточного альбумина....

Результаты

В этом примере метод улавливания CO₂ используется для сравнения окисления субстрата первичными кальвариальными преостеобластами по сравнению с БММ, которые часто используются для дифференцировки остеобластов in vitro или остеокластов, соответственно. После того, как первичные.......

Обсуждение

Протокол обеспечивает простой в использовании метод определения скорости окисления основных энергетических субстратов. Это более простая альтернатива другим протоколам, которые используют колбы, содержащие центральный колодец и увенчанные резиновыми пробками 14,15,16.^<.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm filters	Sigma-Aldrich	SLGVM33RS	Used to filter BSA solution
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200056	Dissociate cells from cell culture plates
1.5 mL Eppendorf tubes	PR1MA	PR MCT17 RB	Used for reaction incubation
10 cm plates	TPP	93100	Used for cell culture
10 mL syringe	BD	302995	Used to flush marrow from long bones
10% FBS	Atlanta biologicals	S11550	For Cell culture medium preparation
14C-Glucose	PerkinElmer	NEC042X050UC	Used to make hot media
14C-glutamine	PerkinElmer	NEC451050UC	Used to make hot media
14C-oleate	PerkinElmer	NEC317050UC	Used to make hot media
23 G needle	BD	305120	Used to flush marrow from long bones
24-well plates	TPP	92024	Used for cell culture
70 μm cell strainers	MIDSCI	70CELL	Used to filter supernatant during cavarial digestion
Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) dye	Nexcelom Biosciences	CS2-0106	Stains live cells to determine seed density
Bovine Serum Ablumin	Proliant Biologicals	68700	Used for fatty acid conjugation
Cellometer Auto 2000	Nexcelom Biosciences		Determine the number of viable cells
Centrifuge	Thermo Fisher	Legend Micro 21R	Used to pellet cells
Collagenase type II	Worthington	LS004176	Dissociate cells from tissue
Custom MEM alpha	GIBCO	SKU: ME 18459P1	Used to create custom hot media
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Gibco	10010023	Used to dissolve and dilute reagents, and wash culture dishes
Filter Paper	Millipore-Sigma	WHA1001090	Traps CO2 with sodium hydroxide
Glucose	Sigma-Aldrich	g7528	Used to make custom media
HEPES	Gibco	15630080	Traps CO2 during cell culture
L-carnitine	Sigma-Aldrich	C0283	Supplemented for fatty acid oxidation
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	g3126	Used to make custom media
MEM alpha	Thermo	A10490	Cell culture medium
Parafilm	Pecheney Plastic Packaging	PM998	Used to seal cell culture dishes
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15140122	Prevents contamination in cell culture
Perchloric Acid	Sigma-Aldrich	244252	Releases CO2 during metabolic assay
Pyruvate	Sigma-Aldrich	p5280	Used to make custom media
Scintillation Counter	Beckman Coulter	LS6500	Determines radioactivity from the filter paper
Scintillation Fluid	MP Biomedicals	882453	Absorb the energy emitted by RAMs and re-emit it as flashes of light
Scintillation Vial	Fisher Scientific	03-337-1	Reaction containers for scintillation fluid
Sodium carbonate	Sigma-Aldrich	S5761	Balance buffer for medium
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	58045	Traps CO2 during metaboilc assay
Sodium oleate	SANTA CRUZ	SC-215879	BSA conjugated fatty acid preparation
Vaccum filtration 1000	TPP	99950	Filter cMEMα