Enerji Substrat Oksidasyonunun In Vitro 14CO2 Trapping ile Değerlendirilmesi

Özet

Bu protokol, in vitro ¹⁴CO₂ üretimini izleyerek substrat oksidasyonunu incelemek için kullanımı kolay bir yöntemi açıklar.

Özet

Mitokondri, enerji homeostazını korumak için adenozin trifosfat (ATP) üreten trikarboksilik asit (TCA) döngüsü ve elektron taşıma zinciri (ETC) için makinelere ev sahipliği yapar. Glikoz, yağ asitleri ve amino asitler, çoğu somatik hücrede mitokondriyal solunumu besleyen başlıca enerji substratlarıdır. Kanıtlar, farklı hücre tiplerinin belirli substratlar için farklı bir tercihe sahip olabileceğini göstermektedir. Bununla birlikte, iskeletteki çeşitli hücreler tarafından substrat kullanımı ayrıntılı olarak çalışılmamıştır. Ayrıca, hücresel metabolizma fizyolojik ve patofizyolojik değişikliklere uyum sağladığından, iskelet hücrelerinde substrat bağımlılığının doğrudan değerlendirilmesi, kemik hastalıklarının patogenezi hakkında önemli bilgiler sağlayabilir.

Aşağıdaki protokol, oksidatif fosforilasyonu takiben substrat moleküllerinden karbondioksit salınımı prensibine dayanmaktadır. Radyoaktif olarak etiketlenmiş karbon atomları (¹⁴C) içeren substratları kullanarak, yöntem hücre kültüründeki substrat oksidasyon oranı için hassas ve kullanımı kolay bir test sağlar. Primer kalvarial preosteoblastlara karşı kemik iliği kaynaklı makrofajlar (BMM'ler) ile yapılan bir vaka çalışması, iki hücre tipi arasındaki ana substratların farklı kullanımlarını göstermektedir.

Giriş

Ökaryotlardaki oksidatif fosforilasyon (OXPHOS), oksijen tüketimi yoluyla ATP şeklinde kimyasal enerjiyi serbest bırakmak için besinlerin mitokondri içinde parçalandığı işlemdir.  Trikarboksilik asit (TCA) döngüsü yoluyla mitokondri içindeki çeşitli substratların katabolizması doğrudan az sayıda ATP molekülü üretir, ancak elektron taşıyıcıları nikotinamid adenin dinükleotid (NAD ⁺) ve flavin adenin dinükleotidin (FAD ⁺) indirgenmesi yoluyla enerji depolar. İndirgenmiş taşıyıcılar daha sonra membran boyunca bir proton konsantrasyon gradyanı oluşturmak için mitokondrinin iç zarında bulunan ETC tarafından oksitlenir. Protonlar sonunda ATP üretmek için gradyanlarını ATP sentaz yoluyla mitokondriyal matrise geri akarlar. OXPHOS, enerji substratlarından ATP üretiminin en verimli aracıdır ve genellikle aerobik ortamlarda tercih edilir. Önceden, aerobik glikolizin - oksijen mevcutken glikozdan laktat üretimi - patofizyolojik olduğu, genellikle kanser hücrelerinin bir işareti olduğu düşünülüyordu. Giderek daha fazla, bazı normal hücre tiplerinin henüz tam olarak deşifre edilmemiş nedenlerden dolayı aerobik glikoliz kullandığı keşfedilmektedir.

Metabolik esneklik, hücrelerin veya organizmaların değişen enerji taleplerine ve mevcut yakıt kaynaklarına uyum sağlama kapasitesidir. Örneğin, iskelet kasının enerjik talebi esas olarak sabit durumda OXPHOS tarafından karşılanır, ancak yüksek yoğunluklu egzersiz sırasında anaerobik glikoliz¹. Egzersiz süresi arttıkça, glikoz ve yağ asidi oksidasyonu genel enerji üretimine daha fazla katkıda bulunur². Bununla birlikte, substrat kullanımı sadece kullanılabilirliğe bağlı değildir, çünkü substratlar oksidasyon sırasında antagonistik olarak rekabet eder. En önemlisi, yağ asidi oksidasyonunun, Randle etkisi³ olarak bilinen bir fenomende iskelet kası tarafından glikoz kullanımını inhibe ettiği gösterilmiştir. Karşılıklı bir etki sonraki çalışmalarla gösterilmiştir ^4,5. Ek olarak, birçok hastalık substrat tercihindeki bir değişiklik ve hücrelerde metabolik esnekliğin gelişmesi ile ilişkilidir. Örneğin, tip II diyabetik hastaların iskelet kasında yağ asidi oksidasyonu normal kontrol deneklerine kıyasla azalır⁶. Hastalık ortamlarındaki metabolik değişiklikler patogeneze katkıda bulunabileceği için yoğun bir araştırma konusudur.

İskelet hücre tiplerinde enerji metabolizması nispeten az çalışılmakla birlikte son yıllarda dikkat çekmektedir⁷. Önceki çalışmalar, aerobik glikolizin kalvarial osteoblastlarda baskın enerji yolu olduğunu, TCA döngüsü boyunca glikoz oksidasyonunun osteoklast oluşumunda rol oynadığını göstermiştir ^8,9. Diğerleri, osteoblastlar için bir enerji kaynağı olarak yağ asitleri için kanıt sağlamıştır¹⁰. Glutamin katabolizmasının da osteoblast farklılaşmasını progenitörlerden^11,12 desteklediği gösterilmiştir. Bununla birlikte, çeşitli iskelet hücresi tipleri tarafından substrat kullanımının kapsamlı bir şekilde anlaşılması hala eksiktir. Ek olarak, hücre farklılaşması sırasında veya patolojik sinyallere yanıt olarak hücresel metabolizmadaki değişikliklerin yakıt substrat kullanımını değiştirmesi beklenir. Aşağıda açıklanan, in vitro substrat oksidasyonunu test etmek için kullanımı kolay bir protokoldür.

Protokol

Radyoaktif malzemelerin (RAM) kullanımı, her kurumda belirlenmiş bir güvenlik komitesi tarafından önceden onay alınmasını gerektirir. Bu protokolde kullanılan RAM'ler, Pennsylvania Üniversitesi'ndeki Çevre Sağlığı ve Radyasyon Güvenliği (EHRS) tarafından onaylanmıştır. Hayvanların kullanımı, ev kurumundaki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından önceden onay alınmasını gerektirir. Aşağıdaki çalışma IACUC tarafından Philadelphia Çocuk Hastanesi'nde onaylanmıştır.

1. ¹⁴C etiketli substrat için stok çözeltilerinin hazırlanması

1. 11 g BSA ve 33,1 mL Dulbecco'nun fosfat tamponlu salinini (DPBS) karıştırarak ve BSA tamamen çözünene kadar oda sıcaklığında ~3 saat hafifçe çalkalayarak 4 mM sığır serum albümini (BSA) stok çözeltisi yapın. BSA stok solüsyonunu kullanmadan önce 70 °C'lik bir su banyosunda ısıtın.
2. Şişede 50 μCi ¹⁴C-oleat (etanol içinde 50 μCi/μmol) hava ile kurutun, kapak 8 saat kapalıyken belirlenmiş bir RAM çalışma davlumbazında. 312.5 μL_H2O ve daha sonra 3.5 mg (11.5 μmol) sodyum oleat ekleyin. İyice karıştırın.
3. Elde edilen çözeltiyi bir su banyosunda 70 ° C'ye ısıtın. 10 mM sıcak oleat stok çözeltisi elde etmek için önceden ısıtılmış BSA stok çözeltisinin 0,9375 mL'sini ekleyin (14 C-oleatın etiketsiz oleata ^1:11,5oranını içerir). Stok çözeltisini serbest bırakın ve uzun süreli kullanım için -20 ° C'de saklayın.
4. Çözüldükten hemen sonra ¹⁴C-glikoz ve ¹⁴C-glutamin kullanın.

2. ¹⁴C etiketli substrat içeren ortamın hazırlanması

NOT: Ortamdaki enerji substratlarının güvenilir konsantrasyonlarını sağlamak için, kullanımdan kısa bir süre önce eklenen taze substratlarla birlikte ısmarlama ortam kullanılmalıdır. Burada, glikoz, piruvat, glutamin, fenol kırmızısı veya sodyum bikarbonat içermeyen özel yapım bir Minimum Esansiyel Ortam (MEMa) kullanılır. Bununla birlikte, her hücre tipi için en uygun ortam belirlenmelidir.

1. 1 L arıtılmış suda 8.67 g orta tozu yeniden oluşturun. 7.4 pH elde etmek için 2.2 g sodyum bikarbonat ekleyin ve 0.22 μm vakum filtrasyonu kullanarak çözeltiyi filtreleyin.
2. Son konsantrasyonlarda 5.5 mM glikoz, 2 mM glutamin, 1 mM piruvat ve% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile tam ortamı (cMEMa) elde etmek için taze bileşenler ekleyin. Ayrıca yağ asidi oksidasyonunu kolaylaştırmak için cMEMα'yı 100 mM L-karnitin ve 10 μM HEPES ile destekleyin.
3. Kullanmadan hemen önce, sıcak ortam yapmak için taze hazırlanmış cMEMα'ya ¹⁴C etiketli substrat ekleyin. Oleat sıcak ortamını yapmak için, 100 μM oleatın son konsantrasyonu (1:100 seyreltme, son radyoaktivite 0,4 μCi / mL) için cMEMa'ya 10 mM sıcak oleat stok çözeltisini ekleyin.
   NOT: 1:11.5 oranında sıcak:soğuk oleat içeren 10 mM sıcak oleat stoğu (bkz. adım 1.3), radyoaktif madde miktarını en aza indirirken ortamda toplam 100 μM fizyolojik oleat seviyesine ulaşmak için kullanılır.
4. 70 ° C'de bir su banyosunda 2 mL H2 O'ya 24.36 mg sodyum oleat ekleyerek ~₂₀dakika boyunca tamamen çözünene kadar 10 mM etiketsiz oleat stoğu yapın, 70 ° C'ye önceden ısıtılmış 4 mM BSA stok çözeltisinin 6 mL'si ile hızlı bir şekilde karıştırmadan önce. 37 °C'lik bir su banyosuna 1 saat boyunca aktarın ve 0,22 μm filtreden süzün. Aliquot ve uzun süreli kullanım için -20 ° C'de saklayın.
5. Glikozu sıcak ortam yapmak için, 1.333 μM'lik bir son konsantrasyona ¹⁴C-glikoz ekleyin (1: 4.125 seyreltme, son radyoaktivite 0.4 μCi / mL). Glutamin sıcak ortam yapmak için, 2 μM'lik son konsantrasyona ¹⁴C-glutamin ekleyin (1: 1.000 seyreltme, son radyoaktivite 0.4 μCi / mL).
6. Glikoz ve glutamin sıcak ortamını, oleat sıcak ortamındakiyle aynı olan 100 μM oleatın nihai konsantrasyonunu elde etmek için adım 2.4'ten itibaren 10 mM'lik etiketsiz oleat stok çözeltisi ile destekleyin.

3. Hücrelerin hazırlanması

NOT: Kalvarial preosteoblastlar ve kemik iliği makrofajları burada örnek olarak kullanılmıştır. Kullanıcılar seçtikleri hücre tipini uygun protokollere göre hazırlamalıdır. Enzimatik aktivite farklı partiler arasında değişebileceğinden, pilot deneylerde sindirim için kullanılacak kollajenaz II konsantrasyonunu optimize edin.

1. Kalvarial preosteoblastların izolasyonu ve kültürü
   1. Doğum sonrası gün 3-5 (P3-5) yavrularını kafalarını keserek kurban edin ve onları Penisilin-Streptomisin (P / S) içeren buz gibi soğuk DPB'lere aktarın.
   2. Cildi ve yumuşak dokuyu çıkararak kalvariyi açığa çıkarın. DPBS'de çevredeki dokuları arkadan öne doğru keserek orta bölgeyi toplayın (Şekil 1A). Kalvarinin iç ve dış yüzeylerini, sonraki sindirimde hücrelerin serbest bırakılmasına yardımcı olmak için cımbız kullanarak hafifçe çizin.
   3. DPBS'de 2 mg / mL ve 4 mg / mL'lik bir Kollajenaz tip II çözeltisi hazırlayın ve her bir çözeltiyi taze bir 0.22 μm filtre ile filtreleyin. Temizlenmiş kalvariyi önce 2 mg / mL kollajenaz çözeltisi ile 15 dakika boyunca sindirin ve sindirim çözeltisini atın. Temizlenen numuneleri her seferinde 15 dakika boyunca 3 kez 4 mg / mL kollajenaz çözeltisinde sindirin, sindirim çözeltisini bir araya getirin ve saklayın.
   4. Çürütme çözeltisini 70 μm hücre süzgeçlerinden süzün ve filtrazı 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüj edin. Hücre peletini cMEMα'da (bkz. adım 2.2) %10 FBS ve P/S içeren yeniden askıya alın.
   5. Hücreleri 10 cm'lik plakalarda 4 × 10⁴ hücre/^cm2'de sayın ve tohumlayın. Hücreleri 3 gün boyunca% 5 CO₂ ile 37 ° C'lik bir inkübatörde kültürleyin.
   6. Hücreleri 37 ° C'de% 0.25 tripsin-EDTA ile ayırın. 7.5 × 10⁵ / cm2'de% 10 FBS ve P / S içeren cMEMα ile²⁴ kuyucuklu hücre kültürü plakalarındaki hücreleri sayın ve tohumlayın. Substrat başına hücre tipi başına en az 4 kuyucuk ve tahlilden önce hücre sayımı için her hücre tipi için en az üç ekstra kuyucuk tohumlayın.
   7. Substrat oksidasyon testlerinden önce hücreleri gece boyunca 37 ° C'de kültürleyin.
2. BMM'lerin izolasyonu ve kültürü
   NOT: BMM'lerin kültürü, rekombinant protein olarak ticari olarak satın alınabilen makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) gerektirir. M-CSF'yi eksprese etmek için tasarlanmış CMG14-12 hücre hattından şartlandırılmış ortam, burada kullanılan ekonomik bir alternatiftir¹³.
   1. Kas ve bağ dokularını çıkardıktan sonra 8 haftalık farelerden femurları ve tibiasları toplayın. Kemiklerin her iki ucunu keskin makasla kesin ve atın.
   2. Kemik iliğini bir femur ve bir tibia'dan% 10 FBS, P / S ve% 10 CMG14-12 şartlandırılmış ortam (BMM ortamı) ile 15 mL cMEMa içeren 23 G'lik bir iğne ile donatılmış bir şırınga ile 10 cm'lik bir Petri kabına yıkayın. Petri kabındaki hücreleri% 5 CO 2 ile 37 ° C'lik bir inkübatörde_{kültürleyin}.
   3. 3 gün sonra, kültür ortamını atın ve DPBS ile durulayın. Bağlı hücreleri 37 ° C'de% 0.25 tripsin-EDTA ile 5 dakika boyunca ayırın. BMM ortamında hücre peletini santrifüj yapın ve yeniden askıya alın.
   4. 24 kuyucuklu hücre kültürü plakalarındaki hücreleri 7.5 × 10⁵ /^cm2'de 3.1.6'da tarif edildiği gibi sayın ve tohumlayın. Tahlillere başlamadan önce BMM ortamında gece boyunca 37 ° C'de kültür.

4. CO₂ tuzaklı substrat oksidasyon testi

NOT: Tahlil başlamadan önce %80-90 birleşme elde etmek için her hücre tipi için uygun bir tohumlama yoğunluğu belirlenmelidir. Hücre yoğunluğunun hücrelerin metabolik durumunu etkileyebileceğini unutmayın.

1. Ekstra kuyucuklardaki hücreleri DPBS ile iki kez yıkayın. Hücreleri% 0.25 tripsin-EDTA ile ayırın ve DPBS'de yeniden askıya alınan karışık 20 μL hücreleri, 20 μL akridin turuncu / propidium iyodür (AO / PI) kullanıma hazır ticari boya çözeltisi ile ayırın. Otomatik bir hücre sayacı ile canlı hücre sayısını belirleyin ve son hesaplamalar için sayıyı kaydedin.
2. Tahlil kuyucuklarındaki hücreleri DPBS ile iki kez yıkayın. RAM tarafından belirlenen doku kültürü başlığındaki her tahlil kuyusuna 500 μL sıcak ortam ekleyin. Plakaları parafilm ile kapatın ve hücreleri 4 saat boyunca 37 ° C'de RAM tarafından belirlenmiş bir inkübatörde inkübe edin.
3. Kuluçka sırasında, filtre kağıdını 1,5 ml'lik mikrosantrifüj tüplerinin kapağının içindeki alandan biraz daha büyük dairesel parçalar halinde kesin ve kağıdı kapağa sıkıca yerleştirin (Şekil 1B). Her tüpe 200 μL 1 M perklorik asit ve kapağın içine takılı filtre kağıdına 20 μL sodyum hidroksit ekleyin.
4. Hücrelerin inkübasyonundan sonra, her bir kuyucuktan hazırlanan tüplere 400 μL kültür ortamı aktarın ve kapakları hemen kapatın. Tüpleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca bir tüp rafında bırakın.
5. Kuluçka sırasında, her tüp için bir parıltı şişesi ayarlayın ve 4 mL sintilasyon sıvısı ile doldurun. Her bir filtre kağıdı parçasını bir parıltı şişesine aktarın ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
6. Doku kültürü davlumbazında, su banyosunda ( ¹⁴C-oleat hazırlama için kullanılır), buzdolabında, inkübatörde, lavaboda, zeminde ve potansiyel RAM kontaminasyonu için diğer çalışma alanlarında silme testleri yapın. Kağıt mendilleri parıltı sıvısı içeren parıltı şişelerine koyun.
7. Bir parıltı sayacı ile parıltı şişelerinde ¹⁴C radyoaktivite ölçün. Okuma sonuçlarını kaydedin. Gerekirse çalışma ortamını radyasyon güvenliği kurallarına göre dekontamine edin.

5. Veri analizi

NOT: Her bir substratın_CO2'yi serbest bırakmak için tamamen oksitlendiği varsayılırsa, substrat oksidasyon hızı sıkışmış CO₂ radyoaktivitesinden hesaplanabilir.

1. Farklı substratlar için Eq (1) ve Tablo 1'de verilen X, Y ve Z değerlerini kullanarak substrat oksidasyon hızını hesaplayın.
   Substrat oksidasyon hızı (μmol/hücre/h) =    (1)
   1. Her reaksiyon için dakika başına toplam parçalanma miktarını (DPM) iyi hesaplayın. X için, toplam reaksiyon ortamının 0,5 mL'sinden CO₂ yakalama için kullanılan reaksiyon ortamının 0,4 mL'sinden DPM değerini (parıltı sayacı okuma) kullanın. Bu nedenle, her reaksiyon kuyucuğundan toplam DPM, X × 1,25'tir.
   2. μCi'ye dönüştürmek için toplam DPM'yi 2.220.000 faktörüne bölün.
   3. μCi'deki radyoaktiviteyi ¹⁴C etiketli molekül sayısına dönüştürün. μCi değerini, etiketlenmiş her bir substratın spesifik aktivitesine (Y) bölün. Aşağıdaki Y değerlerini kullanın (Tablo 1): ¹⁴C-glukoz: 300 mCi/mmol; ¹⁴ adet C-glutamin: 200 mCi/mmol; ¹⁴ adet C-oleat: 50 mCi/mmol.
   4. Oksitlenmiş ¹⁴C etiketli molekülden oksitlenmiş moleküllerin toplam sayısını, ikincisini sıcak-toplam seyreltme faktörü (Z) ile çarparak hesaplayın. Aşağıdaki Z değerlerini kullanın (Tablo 1): Glikoz: 4,125; glutamin: 1.000; oleat: 12.5.
   5. Hücre başına substrat oksidasyon hızını belirlemek için elde edilen ürünü hücre numarasına (hücre #) ve 4'e (4 saatlik reaksiyon süresi için) bölün. Tahlilin başlangıcındaki paralel kuyucuklarda belirlenen cell# değerini kullanın.

Sonuçlar

Bu örnekte, CO₂ yakalama yöntemi, sırasıyla in vitro osteoblast veya osteoklast farklılaşması için sıklıkla kullanılan primer kalvarial preosteoblastlar ile BMM'ler arasındaki substrat oksidasyonunu karşılaştırmak için kullanılmıştır. Birincil hücreler bir gecede cMEMa'da paslanıp kültürlendikten sonra, tipik olarak birleşmenin% 80-90'ına ulaşırlar ve karakteristik morfolojilerini sergilerler. Kalvarial preosteoblastlar BMM'lerden önemli ölçüde daha büyüktür (

Tartışmalar

Protokol, ana enerji substratlarının oksidasyon oranını belirlemek için kullanımı kolay bir yöntem sağlar. Merkezi bir kuyu içeren ve^14,15,16 kauçuk tıpalarla kaplı şişeler kullanan diğer protokollere daha basit bir alternatiftir. Buradaki örnek çalışma hücre kültürü ile yapılmasına rağmen, yöntem daha önce tarif edildiği gibi doku eksplantları veya bozulmamış mitokondri içeren doku homojenatlar...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm filters	Sigma-Aldrich	SLGVM33RS	Used to filter BSA solution
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200056	Dissociate cells from cell culture plates
1.5 mL Eppendorf tubes	PR1MA	PR MCT17 RB	Used for reaction incubation
10 cm plates	TPP	93100	Used for cell culture
10 mL syringe	BD	302995	Used to flush marrow from long bones
10% FBS	Atlanta biologicals	S11550	For Cell culture medium preparation
14C-Glucose	PerkinElmer	NEC042X050UC	Used to make hot media
14C-glutamine	PerkinElmer	NEC451050UC	Used to make hot media
14C-oleate	PerkinElmer	NEC317050UC	Used to make hot media
23 G needle	BD	305120	Used to flush marrow from long bones
24-well plates	TPP	92024	Used for cell culture
70 μm cell strainers	MIDSCI	70CELL	Used to filter supernatant during cavarial digestion
Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) dye	Nexcelom Biosciences	CS2-0106	Stains live cells to determine seed density
Bovine Serum Ablumin	Proliant Biologicals	68700	Used for fatty acid conjugation
Cellometer Auto 2000	Nexcelom Biosciences		Determine the number of viable cells
Centrifuge	Thermo Fisher	Legend Micro 21R	Used to pellet cells
Collagenase type II	Worthington	LS004176	Dissociate cells from tissue
Custom MEM alpha	GIBCO	SKU: ME 18459P1	Used to create custom hot media
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Gibco	10010023	Used to dissolve and dilute reagents, and wash culture dishes
Filter Paper	Millipore-Sigma	WHA1001090	Traps CO2 with sodium hydroxide
Glucose	Sigma-Aldrich	g7528	Used to make custom media
HEPES	Gibco	15630080	Traps CO2 during cell culture
L-carnitine	Sigma-Aldrich	C0283	Supplemented for fatty acid oxidation
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	g3126	Used to make custom media
MEM alpha	Thermo	A10490	Cell culture medium
Parafilm	Pecheney Plastic Packaging	PM998	Used to seal cell culture dishes
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15140122	Prevents contamination in cell culture
Perchloric Acid	Sigma-Aldrich	244252	Releases CO2 during metabolic assay
Pyruvate	Sigma-Aldrich	p5280	Used to make custom media
Scintillation Counter	Beckman Coulter	LS6500	Determines radioactivity from the filter paper
Scintillation Fluid	MP Biomedicals	882453	Absorb the energy emitted by RAMs and re-emit it as flashes of light
Scintillation Vial	Fisher Scientific	03-337-1	Reaction containers for scintillation fluid
Sodium carbonate	Sigma-Aldrich	S5761	Balance buffer for medium
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	58045	Traps CO2 during metaboilc assay
Sodium oleate	SANTA CRUZ	SC-215879	BSA conjugated fatty acid preparation
Vaccum filtration 1000	TPP	99950	Filter cMEMα