14CO2트래핑을 사용한 시험관내 에너지 기질 산화 평가

요약

이 프로토콜은 시험관내에서 ^14CO2생산을 추적함으로써 기질 산화를 검사하는 사용하기 쉬운 방법을 기술한다.

초록

미토콘드리아는 에너지 항상성을 유지하기 위해 아데노신 삼인산염(ATP)을 생성하는 트리카르복실산(TCA) 사이클 및 전자 수송 사슬(ETC)을 위한 기계장치를 호스트한다. 포도당, 지방산 및 아미노산은 대부분의 체세포에서 미토콘드리아 호흡을 촉진하는 주요 에너지 기질입니다. 증거는 상이한 세포 유형이 특정 기질에 대해 뚜렷한 선호도를 가질 수 있음을 보여준다. 그러나, 골격 내의 다양한 세포에 의한 기질 활용은 구체적으로 연구되지 않았다. 더욱이, 세포 대사가 생리학적 및 병리생리학적 변화에 적응함에 따라, 골격 세포에서의 기질 의존성에 대한 직접적인 평가는 뼈 질환의 발병기전에 대한 중요한 통찰을 제공할 수 있다.

다음 프로토콜은 산화 인산화 후 기질 분자로부터 이산화탄소가 방출되는 원리에 기초한다. 방사성으로 표지된 탄소 원자(^14C)를 함유하는 기질을 사용함으로써, 이 방법은 세포 배양물에서 기질 산화의 속도에 대한 민감하고 사용하기 쉬운 검정을 제공한다. 일차 calvarial preosteoblasts 대 골수 유래 대식세포 (BMMs)를 사용한 사례 연구는 두 세포 유형 사이의 주요 기질의 다른 활용을 보여줍니다.

서문

진핵생물의 산화적 인산화(OXPHOS)는 미토콘드리아 내부에서 영양분이 분해되어 산소 소비를 통해 ATP 형태로 화학 에너지를 방출하는 과정입니다.  트리카르복실산(TCA) 사이클을 통해 미토콘드리아 내부의 다양한 기질의 이화작용은 직접 ATP 분자를 거의 생성하지 않지만, 오히려 전자 운반체인 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드(NAD+) 및 플라빈 아데닌 디뉴클레오타이드(FAD⁺)의 환원을 통해 에너지를 저장한다. 환원된 담체는 이어서 미토콘드리아의 내막에 위치한 ETC에 의해 산화되어 막을 가로질러 양성자 농도 구배를 생성한다. 양성자는 결국 ATP 신타제를 통해 미토콘드리아 매트릭스로 다시 구배를 흘러 ATP를 생성합니다. OXPHOS는 에너지 기질로부터 ATP를 생산하는 가장 효율적인 수단이며 일반적으로 호기성 환경에서 선호됩니다. 이전에, 호기성 글리코분해-산소가 존재하는 동안 글루코스로부터의 락테이트의 생산-병리생리학적, 종종 암 세포의 특징인 것으로 생각되었다. 점점 더 많은 수의 정상적인 세포 유형이 아직 완전히 해독되지 않은 이유로 호기성 글리코 분해를 사용한다는 것이 발견되고 있습니다.

대사 유연성은 세포 또는 유기체가 변화하는 에너지 요구와 사용 가능한 연료 원에 적응할 수있는 능력입니다. 예를 들어, 골격근의 에너지 수요는 주로 정상 상태에서 OXPHOS에 의해 충족되지만 고강도 운동 중 혐기성 당분해에 의해 충족됩니다¹. 운동 기간이 증가함에 따라 포도당과 지방산 산화는 전반적인 에너지 생산에 더 많은 기여^{를합니다 2}. 그러나, 기질 사용은 기질이 산화 동안 적대적으로 경쟁하기 때문에 가용성에만 의존하지 않는다. 가장 주목할 만하게, 지방산 산화는 랜들 효과³로 알려진 현상으로 골격근에 의한 글루코스 이용을 억제하는 것으로 나타났다. 상호 효과는 후속 연구 ^4,5에 의해 입증되었다. 또한, 많은 질병들은 기질 선호도의 변화 및 세포에서의 대사 유연성의 발달과 관련된다. 예를 들어, 지방산 산화는 정상 대조군 피험자⁶에 비해 II형 당뇨병 환자의 골격근에서 감소된다. 질병 설정의 대사 변화는 병인에 기여할 수 있기 때문에 집중적 인 조사의 대상입니다.

골격 세포 유형의 에너지 대사는 상대적으로 과소 연구되었지만 최근 몇 년 동안 주목을 받고 있습니다⁷. 이전의 연구는 호기성 당분해가 calvarial 조골 세포에서 지배적 인 에너지 경로이며, TCA 사이클을 통한 포도당 산화가 파골세포 형성 ^8,9에서 중요한 역할을한다는 것을 보여주었습니다. 다른 사람들은 조골 세포¹⁰의 에너지 원으로서 지방산에 대한 증거를 제공했습니다. 글루타민 이화작용은 또한 선조(^11,12)로부터의 조골세포 분화를 지지하는 것으로 나타났다. 그러나, 다양한 골격 세포 유형에 의한 기질 이용에 대한 포괄적인 이해는 여전히 부족하다. 또한, 세포 분화 동안 또는 병리학적 신호에 반응하여 세포 대사의 변화는 연료 기질 이용을 변화시킬 것으로 예상된다. 이하에 기재된 것은 시험관내에서 기질 산화를 검정하기 위한 사용하기 쉬운 프로토콜이다.

프로토콜

방사성 물질(RAM)을 사용하려면 각 기관의 지정된 안전위원회의 사전 승인이 필요합니다. 이 프로토콜에 사용되는 RAM은 펜실베니아 대학의 환경 보건 및 방사선 안전 (EHRS)의 승인을 받았습니다. 동물을 사용하려면 가정 기관의 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee)의 사전 승인이 필요합니다. 다음 연구는 필라델피아 아동 병원의 IACUC의 승인을 받았습니다.

1. ¹⁴C 표지 기판에 대한 스톡 용액 제조

1. BSA 11g과 둘베코 인산완충식염수(DPBS) 33.1mL를 혼합하여 4mM 소혈청알부민(BSA) 원액을 만들고 BSA가 완전히 용해될 때까지 실온에서 ~3시간 동안 부드럽게 흔들어 준다. BSA 원액을 사용 전에 70°C 수조에서 가온한다.
2. 공기 건조 50 μCi ¹⁴C-올레에이트 (에탄올 중 50 μCi / μmol)를 지정된 RAM 작업 후드에서 8 시간 동안 뚜껑을 떼어 낸 바이알에 넣으세요. 312.5 μL의_H2O를 첨가한 다음, 3.5 mg(11.5 μmol)의 올레산나트륨을 첨가한다. 철저히 섞으십시오.
3. 생성된 용액을 수조에서 70°C로 가온한다. 예열된 BSA 원액 0.9375 mL를 첨가하여 10 mM 핫 올레에이트 원액(표지되지 않은 올레에이트에 대한 ^14C-올레에이트의 1:11.5 비를 함유함)을 수득하였다. 원액을 분취하고, 장기간 사용을 위해 -20°C에서 보관한다.
4. 해동 직후에 14 C-글루코스와 ¹⁴C-글루타민을 사용하십시오.

2. ^14개의C 표지된 기질을 함유하는 배지의 제조

참고: 매체에서 에너지 기판의 신뢰할 수 있는 농도를 보장하기 위해, 맞춤형 매체는 사용 직전에 추가된 신선한 기판과 함께 사용해야 합니다. 여기서, 글루코스, 피루베이트, 글루타민, 페놀 레드 또는 중탄산나트륨이 없는 맞춤형 최소 필수 배지(MEMα)가 사용된다. 그러나, 최적의 배지는 각 세포 유형에 대해 결정되어야 한다.

1. 배지 분말 8.67 g을 정제수 1 L에 재구성한다. 2.2 g의 중탄산나트륨을 첨가하여 pH 7.4를 달성하고 0.22 μm 진공 여과를 사용하여 용액을 여과한다.
2. 신선한 성분을 첨가하여 최종 농도가 5.5 mM 포도당, 2 mM 글루타민, 1 mM 피루베이트 및 10% 소 태아 혈청(FBS)을 갖는 완전한 배지(cMEMα)를 얻었다. 지방산 산화를 촉진하기 위해 cMEMα를 100 mM L-카르니틴 및 10 μM HEPES로 추가로 보충하십시오.
3. 사용 직전에 ¹⁴C 라벨이 붙은 기질을 새로 준비된 cMEMα에 첨가하여 핫 미디어를 만드십시오. 올레에이트 고온 배지를 만들기 위해, 10 mM 핫 올레에이트 원액을 cMEMα에 첨가하여 최종 농도 100 μM 올레에이트(1:100 희석, 최종 방사능 0.4 μCi/mL)를 가한다.
   참고: 1:11.5의 비율로 함유된 10mM 핫 올레에이트 스톡(단계 1.3 참조)은 방사성 물질의 양을 최소화하면서 배지 내의 100 μM 총 올레에이트의 생리학적 수준을 달성하기 위해 사용된다.
4. 70°C의 수조에서 H2O 2 mL에 올레산나트륨 24.36 mg을 가하여 70°C로 예열된 4 mM BSA 원액 6 mL와 신속하게 혼합하기 전에 완전히 용해될 때까지 ∼20분 동안 10 mM 비표지된 올레에이트 스톡을 만든다. 1 h 동안 37°C 수조로 옮기고 0.22 μm 필터를 통해 여과한다. 분취량은 장기간 사용을 위해 -20°C에서 보관한다.
5. 포도당을 고온 배지로 만들려면 ¹⁴C 포도당을 최종 농도 1.333 μM (1:4,125 희석, 최종 방사능 0.4 μCi / mL)에 첨가하십시오. 글루타민을 고온 배지로 만들려면 ^14C-글루타민을 최종 농도 2μM(1:1,000 희석, 최종 방사능 0.4μCi/mL)에 첨가합니다.
6. 글루코스 및 글루타민 핫 배지를 단계 2.4로부터의 표지되지 않은 올레에이트의 10 mM 원액으로 보충하여 올레에이트 핫 배지에서와 동일한 100 μM 올레에이트의 최종 농도를 달성한다.

3. 세포의 제조

참고 : 갈변 전골 세포와 골수 대식세포가 여기에 예제로 사용됩니다. 사용자는 적절한 프로토콜에 따라 선택한 세포 유형을 준비해야합니다. 효소 활성이 상이한 로트들 사이에서 변할 수 있기 때문에 파일럿 실험에서 소화에 사용되는 콜라게나제 II의 농도를 최적화한다.

1. calvarial preosteoblasts의 분리 및 문화
   1. 출생 후 3-5 일 (P3-5) 새끼를 감금하여 희생시키고 페니실린 - 스트렙토 마이신 (P / S)을 함유 한 얼음처럼 차가운 DPBS로 옮깁니다.
   2. 피부와 연조직을 제거하여 갈변을 노출시킵니다. DPBS에서 주변 조직을 뒤에서 앞쪽으로 잘라내어 중간 영역을 수집합니다(그림 1A). 칼바리아의 내부 및 외부 표면을 핀셋을 사용하여 부드럽게 긁어 후속 소화시 세포를 방출하는 데 도움을줍니다.
   3. DPBS에 2mg/mL와 콜라게나제 유형 II의 4mg/mL 용액을 준비하고 각 용액을 신선한 0.22μm 필터로 여과합니다. 먼저 세척한 갈변을 2mg/mL 콜라게나제 용액으로 15분 동안 소화하고 소화액을 버립니다. 세척 된 샘플을 4 mg / mL 콜라게나제 용액에서 매번 15 분 동안 3 번 소화하여 소화 용액을 풀링하고 저장하십시오.
   4. 소화 용액을 70 μm 세포 스트레이너를 통해 여과하고, 여액을 300 × g 에서 5분 동안 원심분리한다. 세포 펠릿을 10% FBS 및 P/S를 함유하는 cMEMα (단계 2.2 참조)에 재현탁시킨다.
   5. 세포를 10cm 플레이트에 4 × 10⁴ 세포 /^cm2로 계수하고 시드하십시오. 세포를 3일 동안 5%_CO2 가 있는 37°C 배양기에서 배양하였다.
   6. 세포를 37°C에서 0.25% 트립신-EDTA로 해리시킨다. 세포를 계수하고 7.5 × 10^5/cm2에서 10% FBS 및 P/S를 함유하는 cMEMα가 있는²⁴-웰 세포 배양 플레이트에 시드한다. 기질 당 세포 유형 당 적어도 4 웰을 시드하고 분석 전에 세포 계수를 위해 각 세포 유형에 대해 적어도 세 개의 여분의 웰을 시드하십시오.
   7. 기질 산화 분석 전에 밤새 37°C에서 세포를 배양한다.
2. BMM의 분리 및 문화
   참고: BMMs의 배양은 재조합 단백질로서 상업적으로 구입할 수 있는 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF)를 필요로 한다. M-CSF를 발현하도록 조작된 세포주 CMG14-12로부터의 컨디셔닝 배지는 여기서 사용되는 경제적인 대안이다¹³.
   1. 근육과 결합 조직을 제거한 후 8 주 된 마우스에서 대퇴골과 tibias를 수집하십시오. 날카로운 가위로 뼈의 양쪽 끝을 자르고 버립니다.
   2. 대퇴골 하나와 경골 1개에서 골수를 10% FBS, P/S 및 10% CMG14-12 컨디셔닝 배지(BMM 배지)와 함께 cMEMα 15mL가 들어있는 23G 바늘이 장착된 주사기가 장착된 10cm 페트리 접시에 담아 내뿜습니다. 세포를 5%_CO2가 있는 37°C 배양기에서 페트리 접시에서 배양한다.
   3. 3일 후, 배양 배지를 버리고 DPBS로 헹구십시오. 부착된 세포를 37°C에서 5분 동안 0.25% 트립신-EDTA로 해리시킨다. 원심분리하고, 세포 펠릿을 BMM 배지에 재현탁시킨다.
   4. 세포를 계수하고 3.1.6에 기재된 것과 동일한 방법으로 7.5 × 10⁵/^{cm2의 24} -웰 세포 배양 플레이트에 시드한다. 분석을 시작하기 전에 BMM 배지에서 하룻밤 동안 37°C에서 배양하였다.

4._CO2 트랩을 이용한 기질 산화 분석

참고: 분석 시작 전에 80-90% 합류를 달성하기 위해 각 세포 유형에 대해 적절한 시딩 밀도를 결정해야 합니다. 세포 밀도는 세포의 대사 상태에 영향을 줄 수 있습니다.

1. 여분의 웰에있는 세포를 DPBS로 두 번 씻으십시오. 세포를 0.25% 트립신-EDTA로 해리시키고 DPBS에 재현탁된 20μL 세포를 20μL의 아크리딘 오렌지/프로피듐 요오드화물(AO/PI) 즉시 사용 가능한 상업용 염료 용액과 혼합합니다. 자동화된 셀 카운터를 사용하여 라이브 셀의 수를 결정하고 최종 계산을 위해 숫자를 기록합니다.
2. 분석 웰에서 세포를 DPBS로 두 번 세척하십시오. 500 μL의 고온 배지를 RAM 지정 조직 배양 후드의 각 분석 웰에 첨가한다. 플레이트를 파라필름으로 밀봉하고, 세포를 37°C에서 4시간 동안 RAM 지정 인큐베이터에서 인큐베이션한다.
3. 인큐베이션 중에 여과지를 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브의 캡 내부 영역보다 약간 큰 원형 조각으로 자르고 용지를 뚜껑에 꼭 삽입합니다(그림 1B). 각 튜브에 200μL의 1M 과염소산과 20μL의 수산화나트륨을 캡 내부에 장착된 여과지에 첨가한다.
4. 세포를 배양한 후, 각 웰로부터 400 μL의 배양 배지를 준비된 튜브로 옮기고 즉시 캡을 닫는다. 튜브를 실온에서 1 시간 동안 튜브 랙에 두십시오.
5. 인큐베이션 중에 각 튜브에 섬광 바이알을 설치하고 4mL의 섬광 유체로 채 웁니다. 여과지의 각 조각을 섬광 바이알로 옮기고 실온에서 30 분 동안 인큐베이션하십시오.
6. 조직 배양 후드, 수조( ¹⁴C-oleate 제제에 사용됨), 냉장고, 인큐베이터, 싱크대, 접지 및 기타 RAM 오염 가능성에 대한 작업 공간에 대해 닦아 테스트를 수행합니다. 종이 물티슈를 섬광액이 들어있는 섬광 바이알에 넣으십시오.
7. 섬광 계수기를 사용하여 섬광 바이알에서 ^14C방사능을 측정하십시오. 판독 결과를 기록한다. 필요한 경우 방사선 안전 지침에 따라 작업 환경을 오염시킵니다.

5. 데이터 분석

주: 각 기질이 CO2를 방출하기 위해 완전히 산화된다고 가정하면, 기질 산화율은 포획된_CO2 방사능으로부터 계산될 수 있다.

1. Eq(1) 및 상이한 기판에 대해 표 1에 제시된 X, Y 및 Z 값을 사용하여 기질 산화 율을 계산한다.
   기질 산화율 (μmol/cell/h) =    (1)
   1. 각 반응 웰에 대한 분당 총 붕해(DPM)를 계산한다. X의 경우, 총 반응 매질의 0.5 mL 밖으로_CO2 포획에 사용되는 반응 매질의 0.4 mL로부터의 DPM 값(섬광 카운터 판독)을 사용한다. 따라서, 각 반응 웰로부터의 총 DPM은 X× 1.25이다.
   2. 총 DPM을 2,220,000배로 나누어 μCi로 변환합니다.
   3. μCi의 방사능을 ^14개의C 표지된 분자의 수로 변환한다. μCi 값을 각 표지된 기질의 특정 활성(Y)으로 나눈다. 다음의 Y 값을 사용하십시오 (표 1): ^14C-글루코오스: 300 mCi/mmol; ¹⁴ C- 글루타민 : 200 mCi / mmol; ¹⁴ C- 올레 에이트 : 50 mCi / mmol.
   4. 후자를 핫 투 토탈 희석 인자 (Z)와 곱하여 산화 된 ^14C표지 분자로부터 산화 된 분자의 총 수를 계산하십시오. 다음의 Z 값을 사용하십시오 (표 1): 글루코스: 4,125; 글루타민: 1,000; 올레 에이트 : 12.5.
   5. 생성된 생성물을 셀 수(cell#)와 4(반응 시간 4 h)로 나누어 세포당 기질 산화율을 결정한다. 분석 시작 시 병렬 웰에서 결정된 세포#를 사용하십시오.

결과

이 예에서,_CO2 포획 방법은 각각 시험관내 조골세포 또는 파골세포 분화에 자주 사용되는 BMMs와 일차 갈변 전조골세포에 의한 기질 산화를 비교하기 위해 사용된다. 일차 세포가 계대배양되고 cMEMα에서 하룻밤 동안 배양된 후, 이들은 전형적으로 합류의 80-90%에 도달하고 그들의 특징적인 형태학을 나타낸다. calvarial preosteoblasts는 BMMs보다 현저하게 더 큽니다 (그림 2

토론

이 프로토콜은 주요 에너지 기판의 산화 속도를 결정하는 데 사용하기 쉬운 방법을 제공합니다. 중앙 우물을 포함하고 고무 마개^14,15,16으로 덮인 플라스크를 사용하는 다른 프로토콜에 대한 간단한 대안^입니다. 여기서 예시적인 연구가 세포 배양과 함께 수행되지만, 상기 방법은 앞서 기술된 바와 같이 무손상 미토콘드리아를...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm filters	Sigma-Aldrich	SLGVM33RS	Used to filter BSA solution
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200056	Dissociate cells from cell culture plates
1.5 mL Eppendorf tubes	PR1MA	PR MCT17 RB	Used for reaction incubation
10 cm plates	TPP	93100	Used for cell culture
10 mL syringe	BD	302995	Used to flush marrow from long bones
10% FBS	Atlanta biologicals	S11550	For Cell culture medium preparation
14C-Glucose	PerkinElmer	NEC042X050UC	Used to make hot media
14C-glutamine	PerkinElmer	NEC451050UC	Used to make hot media
14C-oleate	PerkinElmer	NEC317050UC	Used to make hot media
23 G needle	BD	305120	Used to flush marrow from long bones
24-well plates	TPP	92024	Used for cell culture
70 μm cell strainers	MIDSCI	70CELL	Used to filter supernatant during cavarial digestion
Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) dye	Nexcelom Biosciences	CS2-0106	Stains live cells to determine seed density
Bovine Serum Ablumin	Proliant Biologicals	68700	Used for fatty acid conjugation
Cellometer Auto 2000	Nexcelom Biosciences		Determine the number of viable cells
Centrifuge	Thermo Fisher	Legend Micro 21R	Used to pellet cells
Collagenase type II	Worthington	LS004176	Dissociate cells from tissue
Custom MEM alpha	GIBCO	SKU: ME 18459P1	Used to create custom hot media
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Gibco	10010023	Used to dissolve and dilute reagents, and wash culture dishes
Filter Paper	Millipore-Sigma	WHA1001090	Traps CO2 with sodium hydroxide
Glucose	Sigma-Aldrich	g7528	Used to make custom media
HEPES	Gibco	15630080	Traps CO2 during cell culture
L-carnitine	Sigma-Aldrich	C0283	Supplemented for fatty acid oxidation
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	g3126	Used to make custom media
MEM alpha	Thermo	A10490	Cell culture medium
Parafilm	Pecheney Plastic Packaging	PM998	Used to seal cell culture dishes
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15140122	Prevents contamination in cell culture
Perchloric Acid	Sigma-Aldrich	244252	Releases CO2 during metabolic assay
Pyruvate	Sigma-Aldrich	p5280	Used to make custom media
Scintillation Counter	Beckman Coulter	LS6500	Determines radioactivity from the filter paper
Scintillation Fluid	MP Biomedicals	882453	Absorb the energy emitted by RAMs and re-emit it as flashes of light
Scintillation Vial	Fisher Scientific	03-337-1	Reaction containers for scintillation fluid
Sodium carbonate	Sigma-Aldrich	S5761	Balance buffer for medium
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	58045	Traps CO2 during metaboilc assay
Sodium oleate	SANTA CRUZ	SC-215879	BSA conjugated fatty acid preparation
Vaccum filtration 1000	TPP	99950	Filter cMEMα