14CO2トラップによるインビトロでのエネルギー基板酸化の評価

要約

このプロトコルは、インビトロで^14CO2産生を追跡することによって基板酸化を調べるための使いやすい方法を記載している。

要約

ミトコンドリアは、エネルギー恒常性を維持するためにアデノシン三リン酸(ATP)を生成するトリカルボン酸(TCA)サイクルと電子輸送鎖(ETC)の機構をホストします。グルコース、脂肪酸、およびアミノ酸は、ほとんどの体細胞においてミトコンドリア呼吸を促進する主要なエネルギー基質である。証拠は、異なる細胞型が特定の基質に対して明確な選好を有し得ることを示している。しかしながら、骨格中の各種細胞による基質利用は詳細に検討されていない。さらに、細胞代謝は生理学的および病態生理学的変化に順応しているため、骨格細胞における基質依存性の直接評価は、骨疾患の病因に関する重要な洞察を提供する可能性がある。

以下のプロトコールは、酸化的リン酸化に続く基質分子からの二酸化炭素放出の原理に基づいている。放射性標識された炭素原子(^14C)を含む基質を使用することにより、この方法は、細胞培養における基質酸化速度について、高感度で使いやすいアッセイを提供する。原発性頭蓋骨前骨芽細胞と骨髄由来マクロファージ(BMM)とのケーススタディは、2つの細胞型間で主要な基質の利用率が異なることを示しています。

概要

真核生物における酸化的リン酸化(OXPHOS)は、栄養素がミトコンドリア内で分解され、酸素の消費を通じてATPの形で化学エネルギーを放出するプロセスである。 トリカルボン酸(TCA)サイクルを介したミトコンドリア内部の様々な基質の異化作用は、少数のATP分子を直接生成するが、むしろ電子伝達体ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD⁺)およびフラビンアデニンジヌクレオチド(FAD⁺)の還元によってエネルギーを貯蔵する。次いで、還元された担体は、ミトコンドリアの内膜に位置するETCによって酸化され、膜を横切ってプロトン濃度勾配を生成する。プロトンは最終的にATP合成酵素を介してミトコンドリアマトリックスに勾配を流れ込み、ATPを生成する。OXPHOSは、エネルギー基質からのATP生産の最も効率的な手段であり、好気性環境で一般的に好ましい。以前は、好気性解糖系 - 酸素が存在する間にグルコースから乳酸を生成する - は病態生理学的であると考えられており、しばしば癌細胞の特徴である。いくつかの正常な細胞型が、まだ完全に解読されていない理由で好気性解糖系を使用することがますます発見されています。

代謝の柔軟性は、細胞または生物が変化するエネルギー需要および利用可能な燃料源に適応する能力である。例えば、骨格筋のエネルギー需要は、主に定常状態ではOXPHOSによって満たされるが、高強度運動中の嫌気性解糖系によって満たされ^る1。運動時間が長くなるにつれて、グルコースと脂肪酸の酸化は全体的なエネルギー生産に大きく寄与します²。しかしながら、基質の使用は、基質が酸化中に拮抗的に競合するため、入手可能性にのみ依存するものではない。最も顕著なのは、脂肪酸酸化が、ランドル効果³として知られる現象において骨格筋によるグルコース利用を阻害することが示されている。相反効果は、その後の研究^4、5によって実証された。さらに、多くの疾患は、基質嗜好の変化および細胞における代謝不柔軟性の発症と関連している。例えば、脂肪酸酸化は、正常対照被験者⁶と比較してII型糖尿病患者の骨格筋において減少している。疾患設定における代謝変化は、病因に寄与する可能性があるため、激しい調査の対象となっている。

骨格細胞型におけるエネルギー代謝は比較的研究されていないが、近年注目されている⁷。これまでの研究は、好気性解糖系が歯蓋骨芽細胞における支配的なエネルギー経路であり、TCAサイクルを介したグルコース酸化が破骨細胞形成において役割を果たすことを示している^8,9。その他は、骨芽細胞のエネルギー源としての脂肪酸の証拠を提供している¹⁰。グルタミン異化作用はまた、前駆細胞^11、12からの骨芽細胞分化を支持することが示されている。しかしながら、様々な骨格細胞型による基質利用の包括的な理解は、依然として欠けている。さらに、細胞分化中または病理学的シグナルに応答した細胞代謝の変化は、燃料基質の利用率を変化させると予想される。以下に説明するのは、インビトロで基質酸化をアッセイするための使いやすいプロトコールです。

プロトコル

放射性物質(RAM)の使用には、各機関の指定安全委員会による事前の承認が必要です。このプロトコルで使用されるRAMは、ペンシルベニア大学のEnvironmental Health & Radiation Safety(EHRS)によって承認されています。動物の使用には、在宅施設の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)による事前の承認が必要です。以下の研究は、フィラデルフィア小児病院でIACUCによって承認された。

1. ^14種類のC標識基質用原液の調製

1. 11 gのBSAと33.1 mLのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)を混合し、BSAが完全に溶解するまで室温で約3時間穏やかに振とうすることにより、4 mMのウシ血清アルブミン(BSA)ストック溶液を作ります。使用前にBSA原液を70°Cの水浴中で温めてください。
2. バイアル瓶内の50μCi ^14C-オレイン酸塩(エタノール中50μCi/μmol)を空気乾燥し、指定されたRAM作業フードで蓋を8時間外します。312.5 μLの_H2Oを加え、次に3.5 mg (11.5 μmol) のオレイン酸ナトリウムを加える。徹底的に混ぜる。
3. 得られた溶液を水浴中で70°Cに加温する。予温したBSA原液0.9375mLを加えて、10mMの熱いオレイン酸原液(非標識オレイン酸塩に対する1:11.5の比 ^の14C-オレイン酸を含む)を得た。原液をアリコートし、長期間使用するために-20°Cで保存する。
4. 解凍直後に14 C-グルコースと¹⁴C-グルタミンを使用してください。

^14C標識基質を含む培地の調製

注:媒体中のエネルギー基質の信頼できる濃度を確保するために、カスタムメイドの媒体は、使用直前に新鮮な基質を添加して使用する必要があります。ここでは、グルコース、ピルビン酸、グルタミン、フェノールレッド、または炭酸水素ナトリウムを含まないカスタムメイドの最小必須培地(MEMα)が使用される。しかしながら、最適な培地は、細胞タイプごとに決定されるべきである。

1. 培地粉末8.67gを精製水1Lで再構成する。2.2gの炭酸水素ナトリウムを加えてpH7.4を達成し、0.22μm真空濾過を用いて溶液を濾過する。
2. 新鮮な成分を加えて、最終濃度5.5 mMグルコース、2 mMグルタミン、1 mMピルビン酸、および10%ウシ胎児血清(FBS)を含む完全培地(cMEMα)を得た。さらに、cMEMαに100 mM L-カルニチンと10 μM HEPESを補給して脂肪酸酸化を促進します。
3. 使用直前に、新しく調製したcMEMαに ¹⁴個のC標識基質を加えてホットメディアを作ります。オレイン酸ホット培地を作るには、10 mMホットオレイン酸ストック溶液をcMEMαに添加し、終濃度100 μMのオレイン酸塩(1:100希釈、最終放射能0.4 μCi/mL)にします。
   注:1:11.5のホット:コールドオレイン酸塩の比率を含む10mMのホットオレイン酸塩ストック(ステップ1.3を参照)は、放射性物質の量を最小限に抑えながら、媒体中の100μMの総オレイン酸塩の生理学的レベルを達成するために使用されます。
4. 70°Cのウォーターバス中で2mLの_H2Oに24.36mgのオレイン酸ナトリウムを加えて10mMの非標識オレイン酸ストックを作り、完全に溶解するまで約20分間、70°Cに予温した6mLの4mM BSAストックと素早く混合する。 37°Cの水浴に1時間移し、0.22μmのフィルターでろ過します。アリコートし、長期間使用するために-20°Cで保存してください。
5. グルコースを高温培地にするには、終濃度1.333 μM(1:4,125希釈、最終放射能0.4 μCi/mL)に ¹⁴C-グルコースを加えます。グルタミンを高温培地にするには、 ^14C-グルタミンを終濃度2μM(1:1,000希釈、最終放射能0.4μCi/mL)まで加える。
6. グルコースおよびグルタミン高温培地に、ステップ2.4からの非標識オレイン酸塩の10 mMストック溶液を補充し、オレイン酸ホット培地と同じ100μMオレイン酸塩の最終濃度を達成する。

3. 細胞の作製

注:歯槽骨前芽細胞および骨髄マクロファージがここで例として使用されている。ユーザーは、適切なプロトコルに従って選択した細胞タイプを準備する必要があります。酵素活性が異なるロット間で異なる可能性があるため、パイロット実験で消化に使用するコラゲナーゼIIの濃度を最適化します。

1. 頭蓋骨前骨芽細胞の単離と培養
   1. 出生後3-5日目(P3-5)の仔犬を断頭して犠牲にし、ペニシリン - ストレプトマイシン(P / S)を含む氷冷DPBSに移す。
   2. 皮膚および軟部組織を除去することによって頭蓋骨を露出させる。DPBSで周囲の組織を後ろから前へ切り取って中央領域を収集します(図1A)。ピンセットを使用して頭蓋骨の内面と外面を優しく傷つけ、その後の消化時に細胞を解放するのを助けます。
   3. DPBS中のコラゲナーゼII型2mg/mLおよび4mg/mL溶液を調製し、各溶液を新鮮な0.22μmフィルターで濾過する。洗浄した頭蓋骨をまず2mg/mLのコラゲナーゼ溶液で15分間消化し、消化液を捨てる。洗浄したサンプルを4mg/mLのコラゲナーゼ溶液で3回、15分間消化し、消化液をプールして保存します。
   4. 消化液を70 μmのセルストレーナーでろ過し、ろ液を300 × g で5分間遠心分離します。細胞ペレットを、10%FBSおよびP/Sを含むcMEMα(ステップ2.2参照)に再懸濁する。
   5. 10 cmプレートに4×10^{4 cells} /^cm2で細胞を数えて播種する。細胞を5%_CO2 と共に37°Cのインキュベーター内で3日間培養する。
   6. 0.25%トリプシン-EDTAで37°Cで細胞を解離させる。細胞を数え、10%FBSおよびP/Sを含むcMEMαを7.5 × 10⁵/^{cm2で含む24}ウェル細胞培養プレートに細胞を播種する。基質当たり細胞タイプ当たり少なくとも4ウェルをシードし、アッセイ前の細胞計数のために各細胞タイプについて少なくとも3つの余分なウェルを播種する。
   7. 基質酸化アッセイの前に一晩37°Cで細胞を培養する。
2. BMMの単離と培養
   注:BMMの培養にはマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)が必要であり、これは組換えタンパク質として商業的に購入することができる。M-CSFを発現するように操作された細胞株CMG14-12からの馴化培地は、ここで使用される経済的な代替手段である¹³。
   1. 筋肉および結合組織を除去した後、8週齢のマウスから大腿骨および脛骨を採取する。骨の両端を鋭いはさみで切って捨てます。
   2. 10% FBS、P/S、および10% CMG14-12馴化培地(BMM培地)を含む15mLのcMEMαを含む23G針を取り付けたシリンジを備えた10cmペトリ皿に骨髄を10cmペトリ皿に洗い流す。シャーレ内の細胞を5%_CO2を有する37°Cのインキュベーター内で培養する。
   3. 3日後、培養培地を捨て、DPBSですすいでください。付着した細胞を0.25%トリプシン-EDTAで37°Cで5分間解離させる。遠心分離機により、細胞ペレットをBMM培地に再懸濁する。
   4. 3.1.6に記載したのと同じ方法で、7.5×¹⁰⁵/^cm2で24 ウェル細胞培養プレートに細胞をカウントし、播種する。アッセイを開始する前にBMM培地中で37°Cで一晩培養した。

4._CO2 トラップによる基質酸化アッセイ

注: アッセイの開始前に 80 ~ 90% の合流点を達成するために、細胞タイプごとに適切な播種密度を決定する必要があります。細胞密度は、細胞の代謝状態に影響を与え得ることに留意されたい。

1. 余分なウェル内の細胞をDPBSで2回洗浄する。細胞を0.25%トリプシン-EDTAで解離させ、20 μLの細胞をDPBSに再懸濁し、20 μLのアクリジンオレンジ/ヨウ化プロピジウム(AO/PI)すぐに使用できる市販の色素溶液と混合する。自動セルカウンターで生細胞の数を決定し、最終的な計算のためにその数を記録します。
2. アッセイウェル内の細胞をDPBSで2回洗浄する。RAM指定の組織培養フード内の各アッセイウェルに500μLの高温培地を加える。プレートをパラフィルムでシールし、RAM指定のインキュベーター内で細胞を37°Cで4時間インキュベートする。
3. インキュベーション中は、ろ紙を1.5ml微量遠心チューブのキャップ内の面積よりわずかに大きい円形に切り、紙をキャップにぴったりと挿入します(図1B)。各チューブに200 μLの1 M過塩素酸を加え、キャップの内側に取り付けたろ紙に20 μLの水酸化ナトリウムを加えます。
4. 細胞のインキュベーション後、各ウェルから調製したチューブに400 μLの培養培地を移し、直ちにキャップを閉じる。チューブを室温でチューブラックに1時間放置する。
5. インキュベーション中に、各チューブにシンチレーションバイアルをセットアップし、4mLのシンチレーション液で満たします。ろ紙の各片をシンチレーションバイアルに移し、室温で30分間インキュベートする。
6. 組織培養フード、ウォーターバス( ¹⁴C-オレイン酸塩調製に使用)、冷蔵庫、インキュベーター、シンク、地面、および潜在的なRAM汚染のための他の作業領域でワイプテストを実行します。紙ワイプをシンチレーション液を含むシンチレーションバイアルに入れます。
7. シンチレーションバイアル内の ^14C放射能をシンチレーションカウンターで測定する。読み取り結果を記録します。必要に応じて、放射線安全ガイドラインに従って作業環境を除染してください。

5. データ解析

注:各基質がCO2を放出するために完全に酸化されていると仮定すると、基質酸化速度は、捕捉された_CO2放射能から計算することができる。

1. Eq(1)と、異なる基板について表1に示すX、Y、Z値を用いて基板酸化速度を計算する。
   基板酸化速度(μmol/cell/h)=  (1)
   1. 各反応ウェルの1分あたりの総崩壊量(DPM)を計算する。Xについては、全反応媒体の0.5mLのうち_CO2 トラップに使用した反応媒体の0.4mLからのDPM値(シンチレーションカウンター読み取り値)を使用する。したがって、各反応ウェルからの総DPMはX×1.25である。
   2. DPMの合計を2,220,000倍で割ってμCiに変換します。
   3. μCi単位の放射能を ^14個のC標識分子の数に変換します。μCi値を各標識基質の比活性(Y)で割る。次のY値を使用してください(表1): ¹⁴C-グルコース:300 mCi/mmol; ¹⁴名C-グルタミン: 200 ミリシー/ミリモル; ¹⁴名C-オレイン酸塩:50ミリシー/ミリモル。
   4. 酸化された ¹⁴個のC標識分子から、後者に高温から全希釈係数(Z)を掛けることによって、酸化された分子の総数を計算する。以下のZ値を使用する(表1):グルコース:4,125;グルタミン:1,000;オレエート:12.5。
   5. 得られた生成物を細胞数(cell#)および4(反応時間4時間の場合)で除算し、細胞当たりの基質酸化速度を求めた。アッセイの開始時に平行ウェルで決定した細胞#を使用する。

結果

この例では、_CO2 トラップ法を使用して、原発性頭蓋骨前骨芽細胞による基質酸化と、それぞれ in vitro 骨芽細胞または破骨細胞分化に頻繁に使用されるBMMを比較する。初代細胞を継代し、cMEMα中で一晩培養した後、それらは典型的にはコンフルエントの80〜90%に達し、その特徴的な形態を示す。頭蓋骨前骨芽細胞はBMMよりも顕著に大きい(図2)。各細胞型は?...

ディスカッション

このプロトコルは、主要なエネルギー基板の酸化速度を決定するための使いやすい方法を提供します。これは、中央ウェルを含むフラスコを使用し、ゴム栓14、^15、16で蓋をする他のプロトコルに代わるより簡単な代替手段である。ここでの実施例研究は細胞培養を用いて行われるが、この方法は、先に説明したように、無...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm filters	Sigma-Aldrich	SLGVM33RS	Used to filter BSA solution
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200056	Dissociate cells from cell culture plates
1.5 mL Eppendorf tubes	PR1MA	PR MCT17 RB	Used for reaction incubation
10 cm plates	TPP	93100	Used for cell culture
10 mL syringe	BD	302995	Used to flush marrow from long bones
10% FBS	Atlanta biologicals	S11550	For Cell culture medium preparation
14C-Glucose	PerkinElmer	NEC042X050UC	Used to make hot media
14C-glutamine	PerkinElmer	NEC451050UC	Used to make hot media
14C-oleate	PerkinElmer	NEC317050UC	Used to make hot media
23 G needle	BD	305120	Used to flush marrow from long bones
24-well plates	TPP	92024	Used for cell culture
70 μm cell strainers	MIDSCI	70CELL	Used to filter supernatant during cavarial digestion
Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) dye	Nexcelom Biosciences	CS2-0106	Stains live cells to determine seed density
Bovine Serum Ablumin	Proliant Biologicals	68700	Used for fatty acid conjugation
Cellometer Auto 2000	Nexcelom Biosciences		Determine the number of viable cells
Centrifuge	Thermo Fisher	Legend Micro 21R	Used to pellet cells
Collagenase type II	Worthington	LS004176	Dissociate cells from tissue
Custom MEM alpha	GIBCO	SKU: ME 18459P1	Used to create custom hot media
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Gibco	10010023	Used to dissolve and dilute reagents, and wash culture dishes
Filter Paper	Millipore-Sigma	WHA1001090	Traps CO2 with sodium hydroxide
Glucose	Sigma-Aldrich	g7528	Used to make custom media
HEPES	Gibco	15630080	Traps CO2 during cell culture
L-carnitine	Sigma-Aldrich	C0283	Supplemented for fatty acid oxidation
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	g3126	Used to make custom media
MEM alpha	Thermo	A10490	Cell culture medium
Parafilm	Pecheney Plastic Packaging	PM998	Used to seal cell culture dishes
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15140122	Prevents contamination in cell culture
Perchloric Acid	Sigma-Aldrich	244252	Releases CO2 during metabolic assay
Pyruvate	Sigma-Aldrich	p5280	Used to make custom media
Scintillation Counter	Beckman Coulter	LS6500	Determines radioactivity from the filter paper
Scintillation Fluid	MP Biomedicals	882453	Absorb the energy emitted by RAMs and re-emit it as flashes of light
Scintillation Vial	Fisher Scientific	03-337-1	Reaction containers for scintillation fluid
Sodium carbonate	Sigma-Aldrich	S5761	Balance buffer for medium
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	58045	Traps CO2 during metaboilc assay
Sodium oleate	SANTA CRUZ	SC-215879	BSA conjugated fatty acid preparation
Vaccum filtration 1000	TPP	99950	Filter cMEMα