Avaliação da oxidação do substrato de energia in vitro com 14armadilhas de CO2

Resumo

Este protocolo descreve um método fácil de usar para examinar a oxidação do substrato rastreando ^{a produção de 14}CO₂ in vitro.

Resumo

Mitocôndrias hospedam o maquinário para o ciclo de ácido tricarboxílico (TCA) e cadeia de transporte de elétrons (ETC), que geram triptosfato de adenosina (ATP) para manter a homeostase energética. Glicose, ácidos graxos e aminoácidos são os principais substratos de energia que alimentam a respiração mitocondrial na maioria das células somáticas. Evidências mostram que diferentes tipos de células podem ter uma preferência distinta por certos substratos. No entanto, a utilização do substrato por várias células no esqueleto não foi estudada em detalhes. Além disso, como o metabolismo celular está sintonizado com alterações fisiológicas e fisiodicos, avaliações diretas da dependência de substratos em células esqueléticas podem fornecer insights importantes sobre a patogênese das doenças ósseas.

O protocolo a seguir baseia-se no princípio da liberação de dióxido de carbono de moléculas de substrato após a fosforilação oxidativa. Ao usar substratos contendo átomos de carbono radioativos rotulados (¹⁴C), o método fornece um ensaio sensível e fácil de usar para a taxa de oxidação de substrato na cultura celular. Um estudo de caso com preosteoblasts primários do calvário versus macrófagos derivados da medula óssea (MMC) demonstra diferente utilização dos principais substratos entre os dois tipos de células.

Introdução

A fosforilação oxidativa (OXPHOS) em eucariotes é o processo pelo qual os nutrientes são divididos dentro das mitocôndrias para liberar energia química na forma de ATP através do consumo de oxigênio.  O catabolismo de vários substratos dentro das mitocôndrias através do ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) gera poucas moléculas de ATP diretamente, mas armazena energia através da redução dos portadores de nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD⁺) e dinucleotídeo de adenina flavin (FAD⁺). Os portadores reduzidos são então oxidados por ETC localizados na membrana interna das mitocôndrias para gerar um gradiente de concentração de prótons através da membrana. Os prótons eventualmente fluem de volta para a matriz mitocondrial através da synthase ATP para produzir ATP. Oxphos é o meio mais eficiente de produção de ATP a partir de substratos de energia e geralmente preferido em ambientes aeróbicos. Anteriormente, a produção de glicólise aeróbica de lactato a partir da glicose, enquanto o oxigênio está presente- pensava-se ser fiofosiológica, muitas vezes uma marca registrada das células cancerosas. Cada vez mais, está sendo descoberto que alguns tipos normais de células usam glicolise aeróbica por razões que ainda não foram totalmente decifradas.

Flexibilidade metabólica é a capacidade de células ou organismos se adaptarem às mudanças nas demandas energéticas e às fontes de combustível disponíveis. Por exemplo, a demanda energética do músculo esquelético é atendida principalmente pelo OXPHOS em estado estável, mas por glicólise anaeróbica durante o exercício de alta intensidade¹. À medida que a duração do exercício aumenta, a oxidação da glicose e do ácido graxo contribuem mais para a produção global de energia². No entanto, o uso de substrato não depende apenas da disponibilidade, pois substratos competem antagonistamente durante a oxidação. Mais notavelmente, a oxidação por ácidos graxos tem sido demonstrada para inibir a utilização da glicose pelo músculo esquelético em um fenômeno conhecido como efeito Randle³. Um efeito recíproco foi demonstrado pelos estudos subsequentes ^4,5. Além disso, muitas doenças estão associadas à mudança na preferência por substrato e ao desenvolvimento da inflexibilidade metabólica nas células. Por exemplo, a oxidação por ácidos graxos é reduzida no músculo esquelético dos pacientes diabéticos tipo II em comparação com os sujeitos de controle normal⁶. As alterações metabólicas nos cenários da doença são objeto de intensa investigação, pois podem contribuir para a patogênese.

O metabolismo energético nos tipos de células esqueléticas é relativamente pouco estudado, mas ganhou atenção nos últimos anos⁷. Trabalhos anteriores mostraram que a glicólise aeróbica é a via de energia dominante nos osteoblastos calvariais, enquanto a oxidação da glicose através do ciclo TCA desempenha um papel na formação osteoclasta ^8,9. Outros forneceram evidências de ácidos graxos como fonte de energia para os osteoblastos¹⁰. O catabolismo da glutamina também tem sido demonstrado para apoiar a diferenciação do osteoblasto dos progenitores^11,12. No entanto, ainda falta uma compreensão abrangente da utilização de substratos por vários tipos de células esqueléticas. Além disso, espera-se que mudanças no metabolismo celular durante a diferenciação celular ou em resposta a sinais patológicos alterem a utilização do substrato de combustível. Descrito abaixo é um protocolo fácil de usar para avaliar a oxidação de substrato in vitro.

Protocolo

O uso de materiais radioativos (RAM) requer aprovação prévia por um comitê de segurança designado em cada instituição. Os RAMs usados neste protocolo foram aprovados pela Environmental Health & Radiation Safety (EHRS) na Universidade da Pensilvânia. O uso de animais requer aprovação prévia do Comitê Institucional de Atenção e Uso de Animais (IACUC) na instituição de origem. O estudo seguinte foi aprovado pela IACUC no Hospital Infantil da Filadélfia.

1. Preparação de soluções de estoque para substratos rotulados em ^C

1. Faça 4 mM de solução de estoque de soro bovino (BSA) misturando 11 g de BSA e 33,1 mL de soro tamponado de Dulbecco (DPBS) e sacudindo-o suavemente à temperatura ambiente por ~3 h até que a BSA esteja totalmente dissolvida. Aqueça a solução de estoque BSA em um banho de água de 70 °C antes de usar.
2. Ar seco 50 μCi ¹⁴C-oleate (50 μCi/μmol no etanol) no frasco com a tampa desligada por 8h em uma capa de trabalho RAM designada. Adicione 312,5 μL de H₂O e depois 3,5 mgs (11,5 μmol) de oleato de sódio. Homogeneizar.
3. Aqueça a solução resultante a 70 °C em banho-maria. Adicione 0,9375 mL da solução de estoque BSA pré-armada para produzir uma solução de estoque de oleato quente de 10 mM (contendo uma razão de 1:11,5 de ¹⁴C-oleate a oleato não rotulado). Aliquot a solução de estoque e armazene-a a -20 °C para uso a longo prazo.
4. Use ¹⁴C-glicose e ¹⁴C-glutamina diretamente após o descongelamento.

2. Preparação de meio contendo substratos rotulados em ^C

NOTA: Para garantir concentrações confiáveis de substratos de energia na mídia, as mídias personalizadas devem ser usadas com substratos frescos adicionados pouco antes do uso. Aqui, é utilizado um meio essencial mínimo personalizado (MEMα) sem glicose, piruvato, glutamina, vermelho fenol ou bicarbonato de sódio. No entanto, um meio ideal deve ser determinado para cada tipo de célula.

1. Reconstituir 8,67 g do pó médio em 1 L de água purificada. Adicione 2,2 g de bicarbonato de sódio para obter um pH de 7,4 e filtrar a solução usando filtragem de vácuo de 0,22 μm.
2. Adicione ingredientes frescos para obter o meio completo (cMEMα) com concentrações finais de glicose de 5,5 mM, glutamina de 2 mM, piruvato de 1 mM e 10% de soro bovino fetal (FBS). Suplementar cMEMα com L-carnitina de 100 mM e HEPES de 10 μM para facilitar a oxidação de ácidos graxos.
3. Imediatamente antes do uso, adicione substratos com ¹⁴C rotulados ao cMEMα recém-preparado para fazer mídia quente. Para fazer o meio quente oleato, adicione a solução de estoque de oleato quente de 10 mM ao cMEMα para uma concentração final de 100 μM oleate (diluição de 1:100, radioatividade final 0,4 μCi/mL).
   NOTA: O estoque de oleato quente de 10 mM contendo uma proporção de 1:11,5 de oleato quente:frio (ver passo 1.3) é usado para atingir um nível fisiológico de 100 μM total oleato na mídia, minimizando a quantidade de material radioativo.
4. Faça 10 mM de estoque de oleato sem rótulo adicionando 24,36 mg de oleato de sódio a 2 mL de H₂O em um banho de água a 70 °C por ~20 min até dissolver completamente antes de misturar rapidamente com 6 mL da solução de estoque BSA de 4 mM pré-rebocada a 70 °C. Transfira para um banho de água de 37 °C por 1h e filtre através de um filtro de 0,22 μm. Alíquota e armazenamento a -20 °C para uso a longo prazo.
5. Para tornar a glicose média quente, adicione ¹⁴C-glicose a uma concentração final de 1,333 μM (diluição de 1:4.125, radioatividade final 0,4 μCi/mL). Para fazer glutamina meio quente, adicione ¹⁴C-glutamina à concentração final de 2 μM (diluição de 1:1.000, radioatividade final 0,4 μCi/mL).
6. Suplemente o meio quente de glicose e glutamina com uma solução de estoque de 10 mM de oleato não rotulado a partir da etapa 2.4 para alcançar a concentração final de 100 μM oleato, o mesmo que no meio quente oleato.

3. Preparação de células

NOTA: Preosteoblasts calvariais e macrófagos de medula óssea são usados como exemplos aqui. Os usuários devem preparar seu tipo de escolha celular de acordo com os protocolos apropriados. Otimize a concentração de colagenase II para ser usada para digestão em experimentos piloto, pois a atividade enzimática pode variar entre diferentes lotes.

1. Isolamento e cultura de preosteoblasts calvariais
   1. Sacrifique filhotes pós-natal 3-5 (P3-5) por decapitação e transfira-os para DPBS gelado contendo Penicilina-Streptomycin (P/S).
   2. Exponha a calvária removendo a pele e o tecido mole. Recolher a região média cortando os tecidos circundantes de trás para frente na DPBS (Figura 1A). Coce as superfícies internas e externas da calvária suavemente usando pinças para ajudar a liberar as células após a digestão subsequente.
   3. Prepare uma solução de 2 mg/mL e uma solução de 4 mg/mL de Collagenase tipo II em DPBS e filtre cada solução com um filtro fresco de 0,22 μm. Digerir a calvaria limpa primeiro com a solução de colagenase de 2 mg/mL por 15 minutos e descartar a solução de digestão. Digerir as amostras limpas em 4 mg/mL solução de colagenase 3 vezes por 15 minutos cada vez, agrupando e salvando a solução de digestão.
   4. Filtre a solução de digestão através de cepas de células de 70 μm e centrifugar o filtrado a 300 × g por 5 min. Resuspende a pelota de célula em cMEMα (ver passo 2.2) contendo 10% de FBS e P/S.
   5. Conte e semee as células a 4 × 10⁴ células/cm² em placas de 10 cm. Cultura as células em uma incubadora de 37 °C com 5% de CO₂ durante 3 dias.
   6. Dissociar as células a 37 °C com 0,25% de trypsin-EDTA. Conte e semee as células em placas de cultura celular de 24 poços com cMEMα contendo 10% de FBS e P/S a 7,5 × 10⁵/cm². Semente pelo menos 4 poços por célula tipo por substrato e pelo menos três poços extras para cada tipo de célula para contagem celular antes do ensaio.
   7. Cultuize as células a 37 °C durante a noite antes que os ensaios de oxidação do substrato.
2. Isolamento e cultura de BMMs
   NOTA: A cultura dos BMMs requer fator estimulante para colônias de macrófagos (M-CSF), que pode ser adquirido comercialmente como uma proteína recombinante. O meio condicionado da linha celular CMG14-12 projetado para expressar M-CSF é uma alternativa econômica usada aqui¹³.
   1. Coletar fêmures e tíbias de camundongos de 8 semanas de idade depois de remover os tecidos musculares e conjuntivos. Corte e descarte as duas extremidades dos ossos com uma tesoura afiada.
   2. Retire a medula óssea de um fêmur e uma tíbia em uma placa de Petri de 10 cm com uma seringa equipada com uma agulha de 23 G contendo 15 mL de cMEMα com 10% de FBS, P/S e 10% cmg14-12 meio condicionado (meio BMM). Cultume as células da placa de Petri em uma incubadora de 37 °C com 5% de CO₂.
   3. Após 3 dias, descarte os meios de cultura e enxágue com DPBS. Dissociar as células anexadas a 37 °C com 0,25% de trypsin-EDTA por 5 min. Centrifugar e resuspensar a pelota celular no meio BMM.
   4. Conte e semee as células em placas de cultura celular de 24 poços a 7,5 × 10⁵/cm² da mesma forma descrita em 3.1.6. Cultura a 37 °C durante a noite no meio BMM antes de iniciar os ensaios.

4. Ensaio de oxidação de substrato com armadilha de CO₂

NOTA: Uma densidade de semeadura adequada deve ser determinada para que cada tipo de célula atinja 80-90% de confluência antes do início do ensaio. Note que a densidade celular pode afetar o estado metabólico das células.

1. Lave as células nos poços extras duas vezes com DPBS. Dissociar as células com 0,25% de trippsina-EDTA e células mistas de 20 μL resuspended em DPBS com 20 μL de laranja acridina/iodeto de propídio (AO/PI) solução de corante comercial pronta para uso. Determine o número de células vivas com um contador celular automatizado e regise o número para cálculos finais.
2. Lave as células nos poços de ensaio duas vezes com DPBS. Adicione 500 μL de meio quente a cada ensaio bem na capa de cultura de tecido designada pela RAM. Sele as placas com parafilm e incuba as células em uma incubadora designada pela RAM a 37 °C por 4h.
3. Durante a incubação, corte o papel filtro em pedaços circulares ligeiramente maiores que a área dentro da tampa de tubos de microcentrifus de microcentragem de 1,5 ml e insira o papel snugly na tampa (Figura 1B). Adicione 200 μL de ácido per polemérico de 1 M a cada tubo e 20 μL de hidróxido de sódio ao papel filtro instalado dentro da tampa.
4. Após a incubação das células, transfira 400 μL de meio de cultura de cada poço para os tubos preparados e feche as tampas imediatamente. Deixe os tubos em um rack de tubo em temperatura ambiente por 1h.
5. Durante a incubação, configure um frasco de cintilação para cada tubo e preencha-o com 4 mL de fluido de cintilação. Transfira cada pedaço de papel filtro para um frasco de cintilação e incubar à temperatura ambiente por 30 minutos.
6. Realizar testes de limpeza na capa de cultura tecidual, no banho de água (usado para a preparação de ¹⁴C-oleate), geladeira, incubadora, pia, terra e qualquer outra área de trabalho para possível contaminação por RAM. Coloque os lenços de papel em frascos de cintilação contendo fluido de cintilação.
7. Meça ^{radioatividade 14}C nos frascos de cintilação com um contador de cintilação. Regissuam os resultados da leitura. Descontaminar o ambiente de trabalho de acordo com as diretrizes de segurança da radiação, se necessário.

5. Análise de dados

NOTA: Supondo que cada substrato esteja totalmente oxidado para liberar CO₂, a taxa de oxidação do substrato pode ser calculada a partir da radioatividade de CO₂ preso.

1. Calcule a taxa de oxidação do substrato utilizando os valores Eq (1) e X, Y e Z dados na Tabela 1 para diferentes substratos.
   Taxa de oxidação do substrato (μmol/célula/h) =    (1)
   1. Calcule bem as desintegrações totais por minuto (DPM) para cada reação. Para X, use o valor DPM (leitura de contador de cintilação) a partir de 0,4 mL do meio de reação utilizado para captura de CO₂ de 0,5 mL do meio de reação total. Portanto, o DPM total de cada reação bem é X × 1,25.
   2. Divida o DPM total por um fator de 2.220.000 para converter para μCi.
   3. Converta a radioatividade em μCi para o número de ¹⁴moléculas rotuladas em C. Divida o valor μCi pela atividade específica (Y) de cada substrato rotulado. Utilize os seguintes valores Y (Tabela 1): ¹⁴C-glicose: 300 mCi/mmol; ¹⁴ C-glutamina: 200 mCi/mmol; ¹⁴ C-oleate: 50 mCi/mmol.
   4. Calcule o número total de moléculas oxidadas das moléculas oxidadas de ¹⁴C rotuladas multiplicando-as com o fator de diluição quente-total (Z). Utilizar os seguintes valores Z (Tabela 1): Glicose: 4.125; glutamina: 1.000; oleate: 12,5.
   5. Divida o produto resultante por número celular (célula#) e 4 (pelo tempo de reação de 4h) para determinar a taxa de oxidação do substrato por célula. Use a célula# determinada nos poços paralelos no início do ensaio.

Resultados

Neste exemplo, o método de captura de CO₂ é usado para comparar a oxidação do substrato por preosteoblasts pré-sísceros do calvário primário versus BMMs, que são frequentemente usados para a diferenciação de osteoblasto in vitro ou osteoclasta, respectivamente. Depois que as células primárias são passaged e cultivadas em cMEMα durante a noite, elas normalmente atingem 80-90% de confluência e exibem sua morfologia característica. Os preosteoblastas calvariais são notavelmente maiores ...

Discussão

O protocolo fornece um método fácil de usar para determinar a taxa de oxidação dos principais substratos de energia. É uma alternativa mais simples a outros protocolos que usam frascos contendo um poço central e tampados com rolhas de borracha 14,15,16. Embora o exemplo de estudo aqui seja realizado com cultura celular, o método pode ser facilmente adaptado para explantos teciduais ou homogeneizadores de tecidos contendo ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm filters	Sigma-Aldrich	SLGVM33RS	Used to filter BSA solution
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200056	Dissociate cells from cell culture plates
1.5 mL Eppendorf tubes	PR1MA	PR MCT17 RB	Used for reaction incubation
10 cm plates	TPP	93100	Used for cell culture
10 mL syringe	BD	302995	Used to flush marrow from long bones
10% FBS	Atlanta biologicals	S11550	For Cell culture medium preparation
14C-Glucose	PerkinElmer	NEC042X050UC	Used to make hot media
14C-glutamine	PerkinElmer	NEC451050UC	Used to make hot media
14C-oleate	PerkinElmer	NEC317050UC	Used to make hot media
23 G needle	BD	305120	Used to flush marrow from long bones
24-well plates	TPP	92024	Used for cell culture
70 μm cell strainers	MIDSCI	70CELL	Used to filter supernatant during cavarial digestion
Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) dye	Nexcelom Biosciences	CS2-0106	Stains live cells to determine seed density
Bovine Serum Ablumin	Proliant Biologicals	68700	Used for fatty acid conjugation
Cellometer Auto 2000	Nexcelom Biosciences		Determine the number of viable cells
Centrifuge	Thermo Fisher	Legend Micro 21R	Used to pellet cells
Collagenase type II	Worthington	LS004176	Dissociate cells from tissue
Custom MEM alpha	GIBCO	SKU: ME 18459P1	Used to create custom hot media
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Gibco	10010023	Used to dissolve and dilute reagents, and wash culture dishes
Filter Paper	Millipore-Sigma	WHA1001090	Traps CO2 with sodium hydroxide
Glucose	Sigma-Aldrich	g7528	Used to make custom media
HEPES	Gibco	15630080	Traps CO2 during cell culture
L-carnitine	Sigma-Aldrich	C0283	Supplemented for fatty acid oxidation
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	g3126	Used to make custom media
MEM alpha	Thermo	A10490	Cell culture medium
Parafilm	Pecheney Plastic Packaging	PM998	Used to seal cell culture dishes
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15140122	Prevents contamination in cell culture
Perchloric Acid	Sigma-Aldrich	244252	Releases CO2 during metabolic assay
Pyruvate	Sigma-Aldrich	p5280	Used to make custom media
Scintillation Counter	Beckman Coulter	LS6500	Determines radioactivity from the filter paper
Scintillation Fluid	MP Biomedicals	882453	Absorb the energy emitted by RAMs and re-emit it as flashes of light
Scintillation Vial	Fisher Scientific	03-337-1	Reaction containers for scintillation fluid
Sodium carbonate	Sigma-Aldrich	S5761	Balance buffer for medium
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	58045	Traps CO2 during metaboilc assay
Sodium oleate	SANTA CRUZ	SC-215879	BSA conjugated fatty acid preparation
Vaccum filtration 1000	TPP	99950	Filter cMEMα