Évaluation de l’oxydation du substrat énergétique in vitro avec piégeage de 14CO2

Résumé

Ce protocole décrit une méthode facile à utiliser pour examiner l’oxydation du substrat en suivant la production de ¹⁴CO₂ in vitro.

Résumé

Les mitochondries hébergent la machinerie du cycle de l’acide tricarboxylique (TCA) et de la chaîne de transport d’électrons (ETC), qui génèrent de l’adénosine triphosphate (ATP) pour maintenir l’homéostasie énergétique. Le glucose, les acides gras et les acides aminés sont les principaux substrats énergétiques alimentant la respiration mitochondriale dans la plupart des cellules somatiques. Les preuves montrent que différents types de cellules peuvent avoir une préférence distincte pour certains substrats. Cependant, l’utilisation du substrat par diverses cellules du squelette n’a pas été étudiée en détail. De plus, comme le métabolisme cellulaire est adapté aux changements physiologiques et physiopathologiques, des évaluations directes de la dépendance au substrat dans les cellules squelettiques peuvent fournir des informations importantes sur la pathogenèse des maladies osseuses.

Le protocole suivant est basé sur le principe de la libération de dioxyde de carbone par les molécules de substrat après phosphorylation oxydative. En utilisant des substrats contenant des atomes de carbone marqués radioactivement (¹⁴C), la méthode fournit un test sensible et facile à utiliser pour le taux d’oxydation du substrat en culture cellulaire. Une étude de cas avec des préostéoblastes calvariaires primaires par rapport à des macrophages dérivés de la moelle osseuse (MGM) démontre une utilisation différente des principaux substrats entre les deux types de cellules.

Introduction

La phosphorylation oxydative (OXPHOS) chez les eucaryotes est le processus par lequel les nutriments sont décomposés à l’intérieur des mitochondries pour libérer de l’énergie chimique sous forme d’ATP par la consommation d’oxygène.  Le catabolisme de divers substrats à l’intérieur des mitochondries par le cycle de l’acide tricarboxylique (TCA) génère directement peu de molécules d’ATP, mais stocke plutôt de l’énergie par réduction des transporteurs d’électrons nicotinamide adénine dinucléotide (NAD⁺) et flavine adénine dinucléotide (FAD⁺). Les porteurs réduits sont ensuite oxydés par ETC situé sur la membrane interne des mitochondries pour génére....

Protocole

L’utilisation de matières radioactives (RAM) nécessite l’approbation préalable d’un comité de sûreté désigné dans chaque établissement. Les RAM utilisés dans ce protocole ont été approuvés par Environmental Health & Radiation Safety (EHRS) de l’Université de Pennsylvanie. L’utilisation d’animaux nécessite l’approbation préalable du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’établissement d’origine. L’étude suivante a été approuvée par l’IACUC à l’hôpital pour enfants de Philadelphie.

1. Préparation de solutions mères pour ¹⁴substrats marqués C

1. Préparer une solution mère d’a....

Résultats

Dans cet exemple, la méthode de piégeage du CO₂ est utilisée pour comparer l’oxydation du substrat par les préostéoblastes calvariaires primaires par rapport aux MBM, qui sont fréquemment utilisés pour la différenciation in vitro des ostéoblastes ou des ostéoclastes, respectivement. Une fois que les cellules primaires sont passées et cultivées dans cMEMα pendant la nuit, elles atteignent généralement 80 à 90% de la confluence et présentent leur morphologie caractéristique. Les pré.......

Discussion

Le protocole fournit une méthode facile à utiliser pour déterminer le taux d’oxydation des principaux substrats énergétiques. C’est une alternative plus simple aux autres protocoles qui utilisent des flacons contenant un puits central et coiffés de bouchons en caoutchouc 14,15,16. Bien que l’exemple d’étude ici soit réalisé avec une culture cellulaire, la méthode peut être facilement adaptée pour les explante.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm filters	Sigma-Aldrich	SLGVM33RS	Used to filter BSA solution
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200056	Dissociate cells from cell culture plates
1.5 mL Eppendorf tubes	PR1MA	PR MCT17 RB	Used for reaction incubation
10 cm plates	TPP	93100	Used for cell culture
10 mL syringe	BD	302995	Used to flush marrow from long bones
10% FBS	Atlanta biologicals	S11550	For Cell culture medium preparation
14C-Glucose	PerkinElmer	NEC042X050UC	Used to make hot media
14C-glutamine	PerkinElmer	NEC451050UC	Used to make hot media
14C-oleate	PerkinElmer	NEC317050UC	Used to make hot media
23 G needle	BD	305120	Used to flush marrow from long bones
24-well plates	TPP	92024	Used for cell culture
70 μm cell strainers	MIDSCI	70CELL	Used to filter supernatant during cavarial digestion
Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) dye	Nexcelom Biosciences	CS2-0106	Stains live cells to determine seed density
Bovine Serum Ablumin	Proliant Biologicals	68700	Used for fatty acid conjugation
Cellometer Auto 2000	Nexcelom Biosciences		Determine the number of viable cells
Centrifuge	Thermo Fisher	Legend Micro 21R	Used to pellet cells
Collagenase type II	Worthington	LS004176	Dissociate cells from tissue
Custom MEM alpha	GIBCO	SKU: ME 18459P1	Used to create custom hot media
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Gibco	10010023	Used to dissolve and dilute reagents, and wash culture dishes
Filter Paper	Millipore-Sigma	WHA1001090	Traps CO2 with sodium hydroxide
Glucose	Sigma-Aldrich	g7528	Used to make custom media
HEPES	Gibco	15630080	Traps CO2 during cell culture
L-carnitine	Sigma-Aldrich	C0283	Supplemented for fatty acid oxidation
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	g3126	Used to make custom media
MEM alpha	Thermo	A10490	Cell culture medium
Parafilm	Pecheney Plastic Packaging	PM998	Used to seal cell culture dishes
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15140122	Prevents contamination in cell culture
Perchloric Acid	Sigma-Aldrich	244252	Releases CO2 during metabolic assay
Pyruvate	Sigma-Aldrich	p5280	Used to make custom media
Scintillation Counter	Beckman Coulter	LS6500	Determines radioactivity from the filter paper
Scintillation Fluid	MP Biomedicals	882453	Absorb the energy emitted by RAMs and re-emit it as flashes of light
Scintillation Vial	Fisher Scientific	03-337-1	Reaction containers for scintillation fluid
Sodium carbonate	Sigma-Aldrich	S5761	Balance buffer for medium
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	58045	Traps CO2 during metaboilc assay
Sodium oleate	SANTA CRUZ	SC-215879	BSA conjugated fatty acid preparation
Vaccum filtration 1000	TPP	99950	Filter cMEMα