Évaluation de l’oxydation du substrat énergétique in vitro avec piégeage de 14CO2

Résumé

Ce protocole décrit une méthode facile à utiliser pour examiner l’oxydation du substrat en suivant la production de ¹⁴CO₂ in vitro.

Résumé

Les mitochondries hébergent la machinerie du cycle de l’acide tricarboxylique (TCA) et de la chaîne de transport d’électrons (ETC), qui génèrent de l’adénosine triphosphate (ATP) pour maintenir l’homéostasie énergétique. Le glucose, les acides gras et les acides aminés sont les principaux substrats énergétiques alimentant la respiration mitochondriale dans la plupart des cellules somatiques. Les preuves montrent que différents types de cellules peuvent avoir une préférence distincte pour certains substrats. Cependant, l’utilisation du substrat par diverses cellules du squelette n’a pas été étudiée en détail. De plus, comme le métabolisme cellulaire est adapté aux changements physiologiques et physiopathologiques, des évaluations directes de la dépendance au substrat dans les cellules squelettiques peuvent fournir des informations importantes sur la pathogenèse des maladies osseuses.

Le protocole suivant est basé sur le principe de la libération de dioxyde de carbone par les molécules de substrat après phosphorylation oxydative. En utilisant des substrats contenant des atomes de carbone marqués radioactivement (¹⁴C), la méthode fournit un test sensible et facile à utiliser pour le taux d’oxydation du substrat en culture cellulaire. Une étude de cas avec des préostéoblastes calvariaires primaires par rapport à des macrophages dérivés de la moelle osseuse (MGM) démontre une utilisation différente des principaux substrats entre les deux types de cellules.

Introduction

La phosphorylation oxydative (OXPHOS) chez les eucaryotes est le processus par lequel les nutriments sont décomposés à l’intérieur des mitochondries pour libérer de l’énergie chimique sous forme d’ATP par la consommation d’oxygène.  Le catabolisme de divers substrats à l’intérieur des mitochondries par le cycle de l’acide tricarboxylique (TCA) génère directement peu de molécules d’ATP, mais stocke plutôt de l’énergie par réduction des transporteurs d’électrons nicotinamide adénine dinucléotide (NAD⁺) et flavine adénine dinucléotide (FAD⁺). Les porteurs réduits sont ensuite oxydés par ETC situé sur la membrane interne des mitochondries pour générer un gradient de concentration de protons à travers la membrane. Les protons finissent par descendre leur gradient dans la matrice mitochondriale à travers l’ATP synthase pour produire de l’ATP. OXPHOS est le moyen le plus efficace de production d’ATP à partir de substrats énergétiques et généralement préféré dans les environnements aérobies. Auparavant, la glycolyse aérobie - la production de lactate à partir du glucose alors que l’oxygène est présent - était considérée comme physiopathologique, souvent une caractéristique des cellules cancéreuses. De plus en plus, on découvre que certains types de cellules normales utilisent la glycolyse aérobie pour des raisons qui n’ont pas encore été entièrement déchiffrées.

La flexibilité métabolique est la capacité des cellules ou des organismes à s’adapter à l’évolution des demandes d’énergie et des sources de carburant disponibles. Par exemple, la demande énergétique du muscle squelettique est principalement satisfaite par OXPHOS à l’état d’équilibre mais par la glycolyse anaérobie lors d’exercices de haute intensité¹. À mesure que la durée de l’exercice augmente, l’oxydation du glucose et des acides gras contribue davantage à la production globale d’énergie². Cependant, l’utilisation du substrat ne dépend pas seulement de la disponibilité, car les substrats rivalisent de manière antagoniste lors de l’oxydation. Plus particulièrement, il a été démontré que l’oxydation des acides gras inhibe l’utilisation du glucose par le muscle squelettique dans un phénomène connu sous le nom d’effet Randle³. Un effet réciproque a été démontré par des études ultérieures ^4,5. En outre, de nombreuses maladies sont associées à un changement de préférence de substrat et au développement d’une rigidité métabolique dans les cellules. Par exemple, l’oxydation des acides gras est réduite dans le muscle squelettique des patients diabétiques de type II par rapport aux sujets témoins normaux⁶. Les changements métaboliques dans les contextes de la maladie font l’objet d’une enquête intense car ils peuvent contribuer à la pathogenèse.

Le métabolisme énergétique dans les types de cellules squelettiques est relativement peu étudié, mais a attiré l’attention ces dernières années⁷. Des travaux antérieurs ont montré que la glycolyse aérobie est la voie énergétique dominante dans les ostéoblastes calvariaires, tandis que l’oxydation du glucose par le cycle TCA joue un rôle dans la formation d’ostéoclastes ^8,9. D’autres ont fourni des preuves que les acides gras étaient une source d’énergie pour les ostéoblastes¹⁰. Il a également été démontré que le catabolisme de la glutamine favorise la différenciation des ostéoblastes par rapport aux progéniteurs^11,12. Cependant, une compréhension globale de l’utilisation du substrat par divers types de cellules squelettiques fait encore défaut. En outre, les changements dans le métabolisme cellulaire au cours de la différenciation cellulaire ou en réponse à des signaux pathologiques devraient modifier l’utilisation du substrat de carburant. Décrit ci-dessous est un protocole facile à utiliser pour tester l’oxydation du substrat in vitro.

Protocole

L’utilisation de matières radioactives (RAM) nécessite l’approbation préalable d’un comité de sûreté désigné dans chaque établissement. Les RAM utilisés dans ce protocole ont été approuvés par Environmental Health & Radiation Safety (EHRS) de l’Université de Pennsylvanie. L’utilisation d’animaux nécessite l’approbation préalable du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’établissement d’origine. L’étude suivante a été approuvée par l’IACUC à l’hôpital pour enfants de Philadelphie.

1. Préparation de solutions mères pour ¹⁴substrats marqués C

1. Préparer une solution mère d’albumine sérique bovine (BSA) de 4 mM en mélangeant 11 g de BSA et 33,1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco et en la agitant doucement à température ambiante pendant environ 3 h jusqu’à ce que la BSA soit complètement dissoute. Réchauffer la solution mère BSA dans un bain-marie à 70 °C avant utilisation.
2. Sécher à l’air libre 50 μCi ¹⁴C-oléate (50 μCi/μmol dans l’éthanol) dans le flacon avec le couvercle fermé pendant 8 h dans une hotte de travail RAM désignée. Ajouter 312,5 μL de_H2O puis 3,5 mg (11,5 μmol) d’oléate de sodium. Mélanger.
3. Réchauffer la solution obtenue à 70 °C au bain-marie. Ajouter 0,9375 mL de la solution mère de BSA préavertie pour obtenir une solution mère d’oléate chaud de 10 mM (contenant un rapport de 1:11,5 de ¹⁴anéate C par rapport à l’oléate non marqué). Aliquotez la solution mère et conservez-la à -20 °C pour une utilisation à long terme.
4. Utilisez ¹⁴C-glucose et ¹⁴C-glutamine directement après la décongélation.

2. Préparation d’un milieu contenant ¹⁴substrats marqués C

REMARQUE: Pour assurer des concentrations fiables de substrats énergétiques dans les milieux, les milieux sur mesure doivent être utilisés avec des substrats frais ajoutés peu de temps avant utilisation. Ici, un milieu essentiel minimum (MEMα) sur mesure sans glucose, pyruvate, glutamine, rouge de phénol ou bicarbonate de sodium est utilisé. Cependant, un milieu optimal doit être déterminé pour chaque type de cellule.

1. Reconstituer 8,67 g de la poudre moyenne dans 1 L d’eau purifiée. Ajouter 2,2 g de bicarbonate de sodium pour obtenir un pH de 7,4 et filtrer la solution à l’aide d’une filtration sous vide de 0,22 μm.
2. Ajouter des ingrédients frais pour obtenir le milieu complet (cMEMα) avec des concentrations finales de 5,5 mM de glucose, 2 mM de glutamine, 1 mM de pyruvate et 10% de sérum fœtal bovin (FBS). Complétez en outre cMEMα avec 100 mM de L-carnitine et 10 μM d’HEPES pour faciliter l’oxydation des acides gras.
3. Immédiatement avant utilisation, ajouter ¹⁴substrats marqués C au cMEMα fraîchement préparé pour obtenir un milieu chaud. Pour rendre le milieu oléate chaud, ajouter la solution mère d’oléate chaud de 10 mM à cMEMα pour une concentration finale de 100 μM d’oléate (dilution 1:100, radioactivité finale 0,4 μCi/mL).
   REMARQUE : Le stock d’oléate chaud de 10 mM contenant un rapport de 1:11,5 d’oléate chaud/froid (voir l’étape 1.3) est utilisé pour atteindre un niveau physiologique de 100 μM d’oléate total dans le milieu tout en minimisant la quantité de matière radioactive.
4. Préparer 10 mM d’oléate non marqué en ajoutant 24,36 mg d’oléate de sodium à 2 mL de_H2O au bain-marie à 70 °C pendant environ 20 min jusqu’à dissolution complète avant de mélanger rapidement avec 6 mL de la solution mère de BSA de 4 mM préavertilée à 70 °C. Transférer dans un bain-marie à 37 °C pendant 1 h et filtrer à travers un filtre de 0,22 μm. Aliquote et conserver à -20 °C pour une utilisation à long terme.
5. Pour rendre le glucose chaud, ajouter ¹⁴C-glucose à une concentration finale de 1,333 μM (dilution 1:4 125, radioactivité finale 0,4 μCi/mL). Pour rendre la glutamine en milieu chaud, ajouter ¹⁴C-glutamine à la concentration finale de 2 μM (dilution 1:1 000, radioactivité finale 0,4 μCi/mL).
6. Compléter le milieu chaud de glucose et de glutamine avec une solution mère de 10 mM d’oléate non marqué de l’étape 2.4 pour atteindre la concentration finale de 100 μM d’oléate, la même que celle du milieu chaud oléate.

3. Préparation des cellules

REMARQUE: Les préostéoblastes calvariaires et les macrophages de la moelle osseuse sont utilisés comme exemples ici. Les utilisateurs doivent préparer le type de cellule de leur choix selon les protocoles appropriés. Optimiser la concentration de collagénase II à utiliser pour la digestion dans des expériences pilotes, car l’activité enzymatique peut varier d’un lot à l’autre.

1. Isolement et culture des préostéoblastes calvariaires
   1. Sacrifiez les chiots du jour postnatal 3-5 (P3-5) par décapitation et transférez-les dans un DPBS glacé contenant de la pénicilline-streptomycine (P / S).
   2. Exposez le calvaire en enlevant la peau et les tissus mous. Prélever la région médiane en coupant les tissus environnants de l’arrière vers l’avant dans le DPBS (Figure 1A). Grattez doucement les surfaces interne et externe de la calvarie à l’aide d’une pince à épiler pour aider à libérer les cellules lors de la digestion ultérieure.
   3. Préparer une solution de 2 mg/mL et une solution de 4 mg/mL de collagénase de type II dans du DPBS et filtrer chaque solution avec un filtre frais de 0,22 μm. Digérer d’abord la calvaire nettoyée avec la solution de collagénase de 2 mg/mL pendant 15 min et jeter la solution de digestion. Digérer les échantillons nettoyés dans une solution de collagénase de 4 mg/mL 3 fois pendant 15 min à chaque fois, en regroupant et en sauvegardant la solution de digestion.
   4. Filtrer la solution de digestion à travers des tamis cellulaires de 70 μm et centrifuger le filtrat à 300 × g pendant 5 min. Remettre en suspension la pastille de cellule en cMEMα (voir étape 2.2) contenant 10 % de FBS et de P/S.
   5. Compter et ensemencer les cellules à 4 × 10⁴ cellules/cm² dans des plaques de 10 cm. Cultivez les cellules dans un incubateur à 37 °C avec 5% de CO₂ pendant 3 jours.
   6. Dissocier les cellules à 37 °C avec 0,25 % de trypsine-EDTA. Compter et ensemencer les cellules dans des plaques de culture cellulaire à 24 puits avec cMEMα contenant 10% de FBS et P/S à 7,5 × 10⁵/cm². Ensemencez au moins 4 puits par type de cellule et par substrat et au moins trois puits supplémentaires pour chaque type de cellule pour le comptage cellulaire avant le test.
   7. Cultiver les cellules à 37 °C pendant la nuit avant les essais d’oxydation du substrat.
2. Isolement et culture des BMM
   REMARQUE: La culture des MMO nécessite un facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF), qui peut être acheté commercialement en tant que protéine recombinante. Le milieu conditionné de la lignée cellulaire CMG14-12 conçu pour exprimer le M-CSF est une alternative économique utilisée ici¹³.
   1. Recueillir les fémurs et les tibias de souris de 8 semaines après avoir enlevé le muscle et les tissus conjonctifs. Coupez et jetez les deux extrémités des os avec des ciseaux tranchants.
   2. Débusquez la moelle osseuse d’un fémur et d’un tibia dans une boîte de Petri de 10 cm avec une seringue équipée d’une aiguille de 23 G contenant 15 mL de cMEMα avec 10% de FBS, P / S et 10% de milieu conditionné CMG14-12 (milieu BMM). Cultiver les cellules dans la boîte de Pétri dans un incubateur à 37 °C avec 5% de CO₂.
   3. Après 3 jours, jeter le milieu de culture et rincer avec du DPBS. Dissocier les cellules attachées à 37 °C avec 0,25 % de trypsine-EDTA pendant 5 min. Centrifuger et remettre en suspension la pastille de cellule dans le milieu BMM.
   4. Compter et ensemencer les cellules dans des plaques de culture cellulaire à 24 puits à 7,5 × 10⁵/^cm2 de la même manière que celle décrite au point 3.1.6. Culture à 37 °C pendant la nuit dans le milieu BMM avant de commencer les essais.

4. Dosage d’oxydation du substrat avec piège à CO₂

REMARQUE: Une densité d’ensemencement appropriée doit être déterminée pour chaque type de cellule afin d’atteindre une confluence de 80 à 90% avant le début de l’essai. Notez que la densité cellulaire peut affecter l’état métabolique des cellules.

1. Lavez les cellules dans les puits supplémentaires deux fois avec DPBS. Dissocier les cellules avec 0,25 % de trypsine-EDTA et mélanger des cellules de 20 μL remises en suspension dans du DPBS avec 20 μL de solution de colorant commercial prêt à l’emploi d’acridine orange/iodure de propidium (AO/PI). Déterminez le nombre de cellules vivantes à l’aide d’un compteur de cellules automatisé et enregistrez le nombre pour les calculs finaux.
2. Lavez les cellules dans les puits d’essai deux fois avec DPBS. Ajouter 500 μL de milieu chaud à chaque puits d’essai dans la hotte de culture tissulaire désignée ram. Scellez les plaques avec un parafilm et incubez les cellules dans un incubateur désigné RAM à 37 °C pendant 4 h.
3. Pendant l’incubation, coupez le papier filtre en morceaux circulaires légèrement plus grands que la zone à l’intérieur du capuchon des tubes de microcentrifugation de 1,5 ml et insérez le papier bien dans le capuchon (Figure 1B). Ajouter 200 μL d’acide perchlorique 1 M dans chaque tube et 20 μL d’hydroxyde de sodium sur le papier filtre inséré à l’intérieur du bouchon.
4. Après l’incubation des cellules, transférer 400 μL de milieu de culture de chaque puits vers les tubes préparés et fermer immédiatement les bouchons. Laisser les tubes dans un porte-tubes à température ambiante pendant 1 h.
5. Pendant l’incubation, installez un flacon de scintillation pour chaque tube et remplissez-le de 4 mL de liquide de scintillation. Transférer chaque morceau de papier filtre dans un flacon de scintillation et incuber à température ambiante pendant 30 min.
6. Effectuez des tests d’essuyage sur la hotte de culture tissulaire, le bain-marie (utilisé pour ^{la préparation de 14}C-oléate), le réfrigérateur, l’incubateur, l’évier, le sol et toute autre zone de travail pour une contamination potentielle par la RAM. Mettez les lingettes en papier dans des flacons de scintillation contenant du liquide de scintillation.
7. Mesurez la radioactivité ^{de 14}C dans les flacons de scintillation avec un compteur de scintillation. Enregistrez les résultats de lecture. Décontaminer l’environnement de travail selon les directives de radioprotection si nécessaire.

5. Analyse des données

REMARQUE: En supposant que chaque substrat est complètement oxydé pour libérer du CO₂, le taux d’oxydation du substrat peut être calculé à partir de la radioactivité du CO₂ piégé.

1. Calculez le taux d’oxydation du substrat à l’aide de Eq (1) et des valeurs X, Y et Z indiquées dans le tableau 1 pour différents substrats.
   Taux d’oxydation du substrat (μmol/cellule/h) =    (1)
   1. Calculer les désintégrations totales par min (DPM) pour chaque puits de réaction. Pour X, utilisez la valeur DPM (lecture du compteur de scintillation) à partir de 0,4 mL du milieu réactionnel utilisé pour le piégeage du CO₂ sur 0,5 mL du milieu réactionnel total. Par conséquent, le DPM total de chaque puits de réaction est de X × 1,25.
   2. Divisez le DPM total par un facteur de 2 220 000 pour convertir en μCi.
   3. Convertir la radioactivité en μCi en nombre de ¹⁴molécules marquées C. Divisez la valeur μCi par l’activité spécifique (Y) de chaque substrat marqué. Utilisez les valeurs Y suivantes (tableau 1) : ¹⁴C-glucose : 300 mCi/mmol ; ¹⁴ C-glutamine : 200 mCi/mmol ; ¹⁴ C-oléate : 50 mCi/mmol.
   4. Calculer le nombre total de molécules oxydées à partir des ¹⁴molécules oxydées marquées C en multipliant ces dernières par le facteur de dilution chaud à total (Z). Utilisez les valeurs Z suivantes (tableau 1) : Glucose : 4 125; glutamine : 1 000; oléate: 12,5.
   5. Divisez le produit résultant par nombre de cellules (cellule#) et 4 (pour un temps de réaction de 4 h) pour déterminer le taux d’oxydation du substrat par cellule. Utilisez la cellule# déterminée dans les puits parallèles au début de l’essai.

Résultats

Dans cet exemple, la méthode de piégeage du CO₂ est utilisée pour comparer l’oxydation du substrat par les préostéoblastes calvariaires primaires par rapport aux MBM, qui sont fréquemment utilisés pour la différenciation in vitro des ostéoblastes ou des ostéoclastes, respectivement. Une fois que les cellules primaires sont passées et cultivées dans cMEMα pendant la nuit, elles atteignent généralement 80 à 90% de la confluence et présentent leur morphologie caractéristique. Les pré...

Discussion

Le protocole fournit une méthode facile à utiliser pour déterminer le taux d’oxydation des principaux substrats énergétiques. C’est une alternative plus simple aux autres protocoles qui utilisent des flacons contenant un puits central et coiffés de bouchons en caoutchouc 14,15,16. Bien que l’exemple d’étude ici soit réalisé avec une culture cellulaire, la méthode peut être facilement adaptée pour les explante...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm filters	Sigma-Aldrich	SLGVM33RS	Used to filter BSA solution
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200056	Dissociate cells from cell culture plates
1.5 mL Eppendorf tubes	PR1MA	PR MCT17 RB	Used for reaction incubation
10 cm plates	TPP	93100	Used for cell culture
10 mL syringe	BD	302995	Used to flush marrow from long bones
10% FBS	Atlanta biologicals	S11550	For Cell culture medium preparation
14C-Glucose	PerkinElmer	NEC042X050UC	Used to make hot media
14C-glutamine	PerkinElmer	NEC451050UC	Used to make hot media
14C-oleate	PerkinElmer	NEC317050UC	Used to make hot media
23 G needle	BD	305120	Used to flush marrow from long bones
24-well plates	TPP	92024	Used for cell culture
70 μm cell strainers	MIDSCI	70CELL	Used to filter supernatant during cavarial digestion
Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) dye	Nexcelom Biosciences	CS2-0106	Stains live cells to determine seed density
Bovine Serum Ablumin	Proliant Biologicals	68700	Used for fatty acid conjugation
Cellometer Auto 2000	Nexcelom Biosciences		Determine the number of viable cells
Centrifuge	Thermo Fisher	Legend Micro 21R	Used to pellet cells
Collagenase type II	Worthington	LS004176	Dissociate cells from tissue
Custom MEM alpha	GIBCO	SKU: ME 18459P1	Used to create custom hot media
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Gibco	10010023	Used to dissolve and dilute reagents, and wash culture dishes
Filter Paper	Millipore-Sigma	WHA1001090	Traps CO2 with sodium hydroxide
Glucose	Sigma-Aldrich	g7528	Used to make custom media
HEPES	Gibco	15630080	Traps CO2 during cell culture
L-carnitine	Sigma-Aldrich	C0283	Supplemented for fatty acid oxidation
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	g3126	Used to make custom media
MEM alpha	Thermo	A10490	Cell culture medium
Parafilm	Pecheney Plastic Packaging	PM998	Used to seal cell culture dishes
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15140122	Prevents contamination in cell culture
Perchloric Acid	Sigma-Aldrich	244252	Releases CO2 during metabolic assay
Pyruvate	Sigma-Aldrich	p5280	Used to make custom media
Scintillation Counter	Beckman Coulter	LS6500	Determines radioactivity from the filter paper
Scintillation Fluid	MP Biomedicals	882453	Absorb the energy emitted by RAMs and re-emit it as flashes of light
Scintillation Vial	Fisher Scientific	03-337-1	Reaction containers for scintillation fluid
Sodium carbonate	Sigma-Aldrich	S5761	Balance buffer for medium
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	58045	Traps CO2 during metaboilc assay
Sodium oleate	SANTA CRUZ	SC-215879	BSA conjugated fatty acid preparation
Vaccum filtration 1000	TPP	99950	Filter cMEMα