אינדוקציה ומדדי הערכה מגוונים של אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר אינדוקציה של אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית במודל עכברי המשתמש בגליקופרוטאין מיאלין אוליגודנדרוציטים וניטור תהליך המחלה באמצעות מערכת ניקוד קלינית. תסמינים אוטואימוניים ניסיוניים הקשורים לאנצפלומיאליטיס מנותחים באמצעות ניתוח טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת של עצם הירך ובדיקת שדה פתוח כדי להעריך את תהליך המחלה באופן מקיף.

Abstract

טרשת נפוצה (MS) היא מחלה אוטואימונית טיפוסית של מערכת העצבים המרכזית (CNS) המאופיינת בחדירה דלקתית, דה-מיאלינציה ונזק אקסונאלי. נכון לעכשיו, אין אמצעים לריפוי מלא של טרשת נפוצה, אך קיימים טיפולים רבים המשנים את המחלה (DMT) כדי לשלוט בהתקדמות המחלה ולמתן אותה. ישנם קווי דמיון משמעותיים בין התכונות הפתולוגיות של מערכת העצבים המרכזית של אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) לבין חולי טרשת נפוצה. EAE נמצא בשימוש נרחב כמודל מייצג כדי לקבוע את היעילות של תרופות לטרשת נפוצה ולחקור את הפיתוח של טיפולים חדשים למחלת טרשת נפוצה. אינדוקציה פעילה של EAE בעכברים היא בעלת השפעה יציבה וניתנת לשחזור והיא מתאימה במיוחד לחקר ההשפעות של תרופות או גנים על דלקת עצבית אוטואימונית. השיטה לחיסון עכברי C57BL/6J עם גליקופרוטאין אוליגודנדרוציטים מיאלין (MOG_35-55) וההערכה היומית של תסמיני המחלה באמצעות מערכת ניקוד קלינית משותפת בעיקר. בהתחשב באטיולוגיה המורכבת של טרשת נפוצה עם ביטויים קליניים מגוונים, מערכת הניקוד הקלינית הקיימת אינה יכולה לספק את הערכת הטיפול במחלה. כדי למנוע את החסרונות של התערבות אחת, אינדיקטורים חדשים להערכת EAE בהתבסס על ביטויים קליניים של מצבי רוח דמויי חרדה ואוסטאופורוזיס בחולי טרשת נפוצה נוצרים כדי לספק הערכה מקיפה יותר של טיפול בטרשת נפוצה.

Introduction

מחלות אוטואימוניות הן ספקטרום של הפרעות הנגרמות על ידי התגובה החיסונית של מערכת החיסון לאנטיגנים שלה וכתוצאה מכך נזק לרקמות או תפקוד לקוי¹. טרשת נפוצה (MS) היא מחלה אוטואימונית כרונית של פולינוירופתיה במערכת העצבים המרכזית (CNS), המאופיינת בחדירה דלקתית, דה-מיאלינציה וניוון אקסונאלי עצבי ^2,3. נכון לעכשיו, טרשת נפוצה השפיעה על לא פחות מ-2.5 מיליון אנשים ברחבי העולם, רובם צעירים ואנשים בגיל העמידה בגילאי 20-40, שהם לעתים קרובות עמוד השדרה של משפחותיהם והחברה. זה גרם להשפעה רבה ופגיעה במשפחות ובחברה ^2,4.

טרשת נפוצה היא מחלה רב-גורמית בעלת ביטויים קליניים מגוונים ומורכבים. בנוסף להפרעות נוירולוגיות קלאסיות המאופיינות בחדירה דלקתית ודה-מיאלינציה, טרשת נפוצה מראה לעתים קרובות ליקוי ראייה, דיסקינזיה של הגפיים והפרעות קוגניטיביות ורגשיות ^5,6,7. אם חולי טרשת נפוצה לא יקבלו את הטיפול הנכון והראוי, מחציתם יחיו בכיסאות גלגלים לאחר 20 שנה, וכמעט מחציתם יחוו תסמיני דיכאון וחרדה, מה שיוביל לרמות גבוהות בהרבה של מחשבות אובדניות מאשר האוכלוסייה הכללית ^8,9.

למרות תקופת מחקר ארוכה, האטיולוגיה של טרשת נפוצה נותרה חמקמקה, והפתוגנזה של טרשת נפוצה עדיין לא הובהרה. מודלים חייתיים של טרשת נפוצה אפשרו לשמש ככלי בדיקה לחקר התפתחות מחלות וגישות טיפוליות חדשות, למרות ההבדלים המשמעותיים בין מערכת החיסון של המכרסם למערכת החיסון האנושית, ובמקביל חולקים כמה עקרונות בסיסיים. אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) היא כיום המודל החי האידיאלי לחקר טרשת נפוצה, המשתמשת בחסינות אוטואנטיגנית מחלבוני מיאלין כדי לגרום לאוטואימוניות למרכיבי CNS בעכברים רגישים, בתוספת אדג'ובנט מלא של פרוינד (CFA) ורעלן שעלת (PTX) כדי לשפר את התגובה החיסונית ההומורלית. בהתאם לרקע הגנטי ולאנטיגנים החיסוניים, מתקבלים תהליכי מחלה שונים, כולל חריפים, חוזרים-חוזרים או כרוניים, כדי לחקות צורות קליניות שונות של טרשת נפוצה^10,11,12. האימונוגנים הרלוונטיים המשמשים בדרך כלל לבניית מודלים של EAE מגיעים מחלבוני CNS עצמיים, כגון חלבון בסיסי מיאלין (MBP), חלבון פרוטאוליפיד (PLP), או גליקופרוטאין אוליגודנדרוציטים (MOG). עכברי SJL/L מחוסני MBP או PLP מפתחים מסלול חוזר-חוזר, ו-MOG מפעיל EAE פרוגרסיבי כרוני בעכברי C57BL/6^11,12,13.

המטרה העיקרית של טיפול משנה מחלה (DMT) היא למזער את תסמיני המחלה ולשפר את התפקוד⁶. מספר תרופות משמשות קלינית כדי להקל על טרשת נפוצה, אך עדיין לא נעשה שימוש בתרופה כדי לרפא אותה לחלוטין, מה שחושף את הצורך בטיפול סינרגטי. עכברי C57BL/6 הם כיום הנפוצים ביותר לבניית עכברים מהונדסים, ובעבודה זו, מודל EAE המושרה על ידי MOG_35-55 בעכברי C57BL/6J עם סולם של 5 נקודות שימש לניטור התקדמות המחלה. דוגמניות EAE סובלות גם ממצבי רוח דמויי חרדה ואובדן עצם, ומהנגעים הידועים בדמילין. כאן מתוארת גם השיטה להעריך את הסימפטומים של EAE מנקודות מבט מרובות באמצעות בדיקת שדה פתוח וניתוח טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (Micro-CT).

Protocol

הוועדה לטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת טונג'י אישרה את העבודה הנוכחית, וכל ההנחיות לטיפול בבעלי חיים בוצעו. עכברי C57BL/6J זכרים או נקבות בגילאי 8-12 שבועות שימשו לניסויים. הובטח כי הגיל והמין יהיו זהים בקבוצות הניסוי; אחרת, הרגישות למחלה הושפעה. עכברים שוכנו בסביבה ספציפית נטולת פתוגנים עם מחזורי אור וחושך מתחלפים של 12 שעות בתנאים קבועים (טמפרטורת החדר 23 ± 1 מעלות צלזיוס, לחות 50% ± 10%), עם גישה חופשית למזון ולמים של עכברים.

1. הכנת תחליב_{MOG 35-55}

1. הוסף שחפת מיקובקטריום מומת בחום (MTB, H37Ra) כדי להשלים את האדג'ובנט של פרוינד (עצמו מכיל 1 מ"ג/מ"ל של MTB מומת בחום, H37Ra), וכתוצאה מכך ריכוז MTB סופי של 5 מ"ג/מ"ל (ראו טבלת חומרים).
   הערה: יש להשלים את הפעולה כולה בארון הבטיחות הביולוגית; אין לפתוח את האוויר הנושב.
2. ממיסים את פפטיד MOG_35-55 שעבר ליאופיליזציה (ראו טבלת חומרים) עם תמיסת מלח חצובה (PBS) סטרילית מקוררת מראש (PBS) (ללא יוני סידן ומגנזיום, pH 7.4) כדי להכין את תמיסת האנטיגן בריכוז של 2 מ"ג/מ"ל.
3. קח צינור מיקרוצנטריפוגה נקי של 2 מ"ל והוסף כדור פלדה אחד מעוקר בקוטר 5 מ"מ (ראה טבלת חומרים) לכל צינור.
4. הוסף 500 μL של אדג'ובנט שלם של פרוינד המכיל 5 מ"ג/מ"ל של MTB ו-500 μL של תמיסת אנטיגן MOG_35-55 לצינור המיקרוצנטריפוגה הנ"ל המכיל כדור פלדה אחד.
5. מנדנדים את הצינור הנ"ל על TissueLyser (ראו טבלת חומרים) במשך 10 דקות, מצננים על קרח במשך 10 דקות, וחוזרים על הפעולה ארבע פעמים כדי לערבב אותו היטב ולבסוף יוצרים תמיסה צמיגה לבנה.
   הערה: תחליב טוב הוא שלב מפתח בהכנת תחליב MOG_35-55 , ולכן נדרש ערבוב יסודי. ה- TissueLyser מוגדר למהירות של 28 הרץ.

2. הכנת רעלן שעלת (PTX)

1. הכן PTX עם ddH₂O לתוך ריכוז 100 מיקרוגרם / מ"ל ולאחסן ב 4 °C.
2. דלל את תמיסת המלאי PTX 50 פעמים עם PBS סטרילי 1x (ללא יוני סידן ומגנזיום, pH 7.4) כדי ליצור תמיסה של 200 ננוגרם/100 מיקרון לשימוש.

3. הקמת מודל בעלי חיים EAE

1. בנה את מודל EAE באמצעות עכברי C57BL/6J זכריים או נקביים בני 8-12 שבועות. ודאו שהעכברים התאקלמו כראוי בסביבת ההזנה לפני החיסון.
2. צנטריפוגה של תחליב MOG_35-55 מוכן (שלב 1) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 2-3 שניות על ידי לחיצה על כפתור הדופק של הציוד (ראה טבלת חומרים) כדי לזרז את כל התחליבים בתחתית הצינור.
   הערה: ניתן לאחסן תחליב MOG_35-55 בטמפרטורה של -20°C למשך מספר ימים. כדי למנוע כישלון סמים, מומלץ להשתמש בו בהקדם האפשרי.
3. חברו מחט של 22 גרם לחבית מזרק של 1 מ"ל, שאפו את תחליב MOG 35-55 והעבירו את תחליב MOG_35-55 לחבית מזרק חדשה של 1 מ"ל. אבטחו את החיבור בין חבית מזרק 1 מ"ל למחט 26 גרם עם סרט איטום (ראו טבלת חומרים).
   הערה: יש להימנע מבועות אוויר בעת טעינת תחליב MOG_35-55 לתוך חביות מזרק 1 מ"ל.
4. נגב וחטא את אתר ההזרקה עם 70% אתנול.
5. להזריק את תחליב MOG_35-55 תת עורית בכל צד של עמוד השדרה הגבי של העכברים, 100 μL בכל צד. שימו לב להיווצרות האוטומטית של המוני בולבוסים מתחת לעור הגב של העכברים לאחר השלמת פעולת ההזרקה.
   הערה: ודא שנסיינים מנוסים מבצעים את תהליך החיסון ושההזרקה מתבצעת בעדינות ובאיטיות כדי למזער את הלחץ על עכברים.
6. להזריק לעכברים הנ"ל באופן תוך-צפקי 100 μL של PTX (שלב 2).
   הערה: יום החיסון הוא יום 0. כמו כן, ודא שניתן לזהות את העכברים במדויק לצורך הערכה יומית עוקבת, כגון שימוש בסמן צבע על זנב העכברים.
7. להזריק את אותו מינון של PTX ביום 2 לאחר החיסון.
8. הכינו קבוצה של עכברים לא מחוסנים כעכברים מסוג בר (WT).

4. ניטור קליני של עכברים

1. רשום את משקל הגוף של עכברי EAE ו- WT מדי יום.
   הערה: חומרת EAE מתואמת באופן חיובי עם ירידה במשקל של עכברים, ולכן משקל הגוף הוא גם מדד ניטור חשוב מאוד.
2. עקוב אחר מצב העכברים בין 0-21 יום לאחר החיסון באמצעות שיטת הניקוד 0-5 המפורטת בטבלה 1.
   הערה: התסמינים שביניהם נספרים כפלוס או מינוס 0.5 נקודות.

5. מבחן שדה פתוח

הערה: חיות הניסוי שנבחרו לשלב זה הן עכברי EAE בתקופות ההתחלה, השיא וההפוגה המוקדמות. בנוסף, עכברי WT שימשו כבקרה. יש לציין כי כל העכברים נבדקו להתנהגות דמוית חרדה לפני הדוגמנות כדי להוציא עכברים עם הפרעות חרדה למודלים של EAE. בנוסף, עכברי EAE בתקופות שיא והפוגה עם אי כושר מוטורי מלא לא נכללו במבחן.

1. הכינו תא תגובת שדה פתוח בגודל 40 × 40 × 40 ס"מ³ ומערכת ניתוח וידאו של פעילות תנועה (שדה פתוח) (ראו טבלת חומרים).
   הערה: המצלמה מותקנת במצב המכסה לחלוטין את הקופסה, חדר התגובה מואר באופן שווה, וחדר הבדיקה נדרש להיות אזור שקט.
2. הניחו את עכברי הבדיקה בחדר הבדיקה לצורך הרגלה של שעה לפני תחילת הניסוי.
3. יש לרסס את כל האזור ב-70% אתנול ולנגב במגבת נייר נקייה כדי לוודא שתא התגובה נקי לפני תחילת הבדיקה.
4. הסר כל עכבר בנפרד מהכלוב שלו והנח אותו באותה פינה של הזירה לפני שתתחיל לחקור.
   הערה: החלק התחתון של התיבה מחולק ל-16 רשתות, מתוכן אזור ארבע הרשתות האמצעיות הוא האזור המרכזי והסביבה היא האזור ההיקפי.
5. לחץ על התחל ללכוד כפתור בשורת התפריטים של מערכת ניתוח הווידאו, הקלט זמן והתחל לצלם.
6. שמרו על השקט בחדר הבדיקה.
7. תן לעכבר לנוע בחופשיות במשך 5 דקות במהלך תהליך ההקלטה.
8. עצור את מערכת הרכישה ושמור את הסרטון.
9. הוציאו את העכבר מהזירה, החזירו אותו לכלוב והמשיכו לעכבר הבא.
   הערה: נקו את אזור הבדיקה עם 70% אתנול בין הריצות כדי להסיר ריחות וחומרים אחרים.
10. נתח את התוצאות באמצעות מערכת ניתוח הווידאו.

6. ניתוח של פנוטיפ העצם

1. הרדימו את עכברי EAE ו-WT על ידי נקע צוואר הרחם ביום ה-21.
   הערה: אנשי צוות המבצעים ניתוחי נקע צוואר הרחם חייבים להיות מאומנים היטב כדי למזער את הכאב הנגרם במהלך מותו של החיה.
2. הפוך את העכבר לשכב שטוח במגש ניתוח ולתקן את הגפיים.
3. החזק את עור הגפיים האחוריות של העכבר עם מלקחיים ופתח את עור העכבר ורקמת השריר עם מספריים.
4. מפרידים בזהירות את עצם הירך מהשוקה ואת עצם הירך בעזרת מספריים.
5. הסר את השריר הנדבק לעצם הירך עם מספריים והנח את עצם הירך ב 70% אתנול בטמפרטורת החדר.
6. סרוק את עצם הירך הדיסטלית באמצעות מערכת מיקרו-CT (ראו טבלת חומרים) בגודל ווקסל איזוטרופי של 10 מיקרומטר, עם מתח שיא של צינור רנטגן של 70 קילו-וולט ועוצמת רנטגן של 0.114 mA.
   הערה: מסנן גאוס תלת-ממדי מאפשר סימון של תמונות סף דו-ממדיות.
7. נתחו את 100 הפרוסות שנסרקו מפיר הירך האמצעי כדי למדוד פרמטרים של עצם הירך, כולל נפח עצם, נפח רקמה, צפיפות מינרלים בעצם, הפרדה טרבקולרית, מספר טרבקולרי, צפיפות חיבור טרבקולרי ועובי טרבקולרי וקליפת המוח.
   הערה: החל מהקצה הפרוקסימלי של לוחית הגדילה הדיסטלית של עצם הירך בעכברים, נמצאו מקטעים נטולי מבנים אפיפיזיים לחלוטין והמשיכו להרחיב 100 פרוסות לכיוון עצם הירך הפרוקסימלית, אשר שורטטו ידנית קווי מתאר בכמה ווקסלים הרחק מהמשטח קליפתי הפנימי כדי לזהות טרבקולה אפיפיזית.
8. צור את השחזורים התלת-ממדיים על-ידי ערימת תמונות סף דו-ממדיות מאזורי קווי מתאר במערכת micro-CT.

תוצאות

לאחר חיסון העכברים, משקל הגוף של העכברים נרשם מדי יום, והתסמינים הקליניים שלהם מוערכים על פי הפרוטוקול שתואר לעיל (שלב 4). בעכברי C57BL/6J המחוסנים בפפטיד MOG, מכיוון שמיקום הנגע מוגבל בעיקר לחוט השדרה, הפתוגנזה של עכברי EAE מתפשטת מקצה הזנב לראש. בתחילת המחלה, עכברי EAE מפגינים חולשה וצניחה של הזנב, ...

Discussion

טרשת נפוצה היא מחלה דלקתית של מערכת העצבים המרכזית והיא אחת ההפרעות הנוירולוגיות הנפוצות ביותר הגורמות לנכות כרונית בקרב צעירים, ומטילה נטל עצום על המשפחות והחברה ^3,4. טרשת נפוצה תמיד סווגה כמחלה אוטואימונית ספציפית לתאי T בתיווך, מה שגורם למערכת האוטואימונ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe(with 26 G needle)	Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd	60017031
2 mL microcentrifuge tube	HAIKELASI	KY-LXG2A
22 G needle	Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd	60017208
Complete Freund’s Adjuvant	Sigma	F5881	Stored at 4 °C, 1 mg of heat-inactivated MTB (H37Ra) per mL
Conditioned place preference system	Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd		Animal behavior
Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10009218	Stored at RT
Locomotion activity (open field) video analysis system	Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd	DigBehv-002	Animal behavior
MOG35-55 peptide	Gill Biochemical Co., Ltd	GLS-Y-M-03590	Stored at -20 °C
Mycobacterium tuberculosis H37Ra	BD	231141	Stored at 4 °C
Open field reaction chamber	Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd		Animal behavior
Pertussis toxin	Calbiochem	516560	Stored at 4 °C
Phosphate Buffered Saline			Made in our laboratory
Scissor	Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd	J21010
Sealing film	Heathrow Scientific	HS 234526B
Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge	Thermo Scientific	75002447
Steel ball	QIAGEN	69975
TissueLyser II	QIAGEN	85300
Tweezer	Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd	JD1060
μCT 35 desktop microCT scanner	Scanco Medical AG, Bassersdorf, Switzerland