实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导及多样评价指标

摘要

本协议描述了使用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白在小鼠模型中诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎，并使用临床评分系统监测疾病过程。采用小鼠股骨显微计算机断层扫描分析和开放现场试验分析实验性自身免疫性脑脊髓炎相关症状，全面评估疾病过程。

摘要

多发性硬化症 （MS） 是一种典型的中枢神经系统 （CNS） 自身免疫性疾病，其特征是炎症浸润、脱髓鞘和轴索损伤。目前，没有完全治愈MS的措施，但有多种疾病改善疗法（DMT）可用于控制和减轻疾病进展。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）和MS患者的CNS病理特征有显着相似之处。EAE已被广泛用作确定MS药物疗效和探索MS疾病新疗法开发的代表性模型。在小鼠中主动诱导EAE具有稳定且可重复的作用，特别适用于研究药物或基因对自身免疫性神经炎症的影响。主要分享用髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白（MOG_35-55）免疫C57BL / 6J小鼠的方法和使用临床评分系统的疾病症状的日常评估。鉴于MS病因复杂，临床表现多样，现有的临床评分体系无法满足疾病治疗的评估。为了避免单一干预的缺点，创建了基于MS患者焦虑样情绪和骨质疏松症的临床表现来评估EAE的新指标，以提供更全面的MS治疗评估。

引言

自身免疫性疾病是由免疫系统对其自身抗原的免疫反应引起的一系列疾病，导致组织损伤或功能障碍¹。多发性硬化症（MS）是中枢神经系统（CNS）多发性神经病的慢性自身免疫性疾病，其特征是炎症浸润，脱髓鞘和神经元轴突变性^2，3。目前，MS已影响全球多达250万人，其中大多数是20-40岁的年轻人和中年人，他们往往是家庭和社会的支柱。这对家庭和社会造成了相当大的影响和伤害^2，4。

MS是一种多因素疾病，临床表现多样且复杂。除了以炎症浸润和脱髓鞘为特征的经典神经系统疾病外，MS还经常表现出视力障碍，肢体运动障碍以及认知和情绪障碍⁵，^6，7。如果MS患者没有得到适当和正确的治疗，其中一半将在20年后生活在轮椅上，其中近一半会出现抑郁和焦虑症状，导致自杀意念水平比^{一般人群高}得多8^，9。

尽管研究时间较长，但MS的病因仍然难以捉摸，MS的发病机制尚未阐明。尽管啮齿动物和人类免疫系统之间存在显着差异，但MS的动物模型允许作为探索疾病发展和新治疗方法的测试工具，同时共享一些基本原理。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是目前研究MS的理想动物模型，利用髓鞘蛋白自身抗原免疫诱导易感小鼠对CNS成分的自身免疫，并加入完全弗氏佐剂（CFA）和百日咳毒素（PTX）增强体液免疫应答。根据遗传背景和免疫抗原，获得不同的疾病过程，包括急性、复发缓解或慢性，以模拟各种临床形式的 MS 10，^11，12。构建EAE模型常用的相关免疫原来自自身CNS蛋白，如髓鞘碱性蛋白（MBP）、蛋白脂蛋白（PLP）或髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）。MBP或PLP免疫的SJL / L小鼠发展复发 - 缓解过程，MOG触发C57BL / 6小鼠的慢性进行性EAE11，^12，13。

疾病修正疗法（DMT）的主要目的是尽量减少疾病症状并改善功能⁶。临床上有几种药物用于缓解MS，但尚未使用任何药物来完全治愈它，这表明协同治疗的必要性。C57BL/6小鼠是目前最常用于构建转基因小鼠的方法，本工作采用MOG_35-55 诱导的5点量表C57BL/6J小鼠EAE模型监测疾病进展。EAE模型还患有焦虑样情绪和骨质流失，以及广为人知的脱髓鞘病变。在这里，还描述了使用开放现场测试和显微计算机断层扫描（Micro-CT）分析从多个角度评估EAE症状的方法。

研究方案

同济大学动物护理委员会批准了目前的工作，并遵循了所有动物护理指南。使用8-12周龄的雄性或雌性C57BL / 6J小鼠进行实验。确保实验组的年龄和性别相同;否则，对该疾病的易感性受到影响。将小鼠饲养在特定的无病原体环境中，在恒定条件下（室温23±1°C，湿度50%±10%）交替进行12小时的光照和黑暗循环，并自由获取小鼠食物和水。

1.MOG_35-55 乳液的制备

1. 加入热灭活冻干结核分枝杆菌（MTB，H37Ra）以完成弗氏佐剂（本身含有1mg / mL热灭活MTB，H37Ra），最终MTB浓度为5mg / mL（见 材料表）。
   注意:整个操作必须在生物安全柜中完成;不要打开吹风。
2. 用无菌预冷磷酸盐缓冲盐水（PBS）（不含钙和镁离子，pH 7.4）溶解冻干的MOG_35-55 肽（参见 材料表），以制备浓度为2mg / mL的抗原溶液。
3. 取一个干净的 2 mL 微量离心管，向每个管中添加一个灭菌的 5 mm 钢球（参见 材料表）。
4. 将 500 μL 含有 5 mg/mL MTB 和 500 μL MOG_35-55 抗原溶液的完整弗氏佐剂加入上述含有一个钢球的微量离心管中。
5. 将上述管在TissueLyser（见 材料表）上振荡10分钟，在冰上冷却10分钟，重复四次以充分混合，最后形成白色粘稠溶液。
   注意:良好的乳化是制备MOG_35-55 乳液的关键步骤，因此需要彻底混合。组织裂解器的速度设置为 28 Hz。

2. 百日咳毒素（PTX）的制备

1. 将含有ddH₂O的PTX制备成100μg/ mL浓度，并储存在4°C。
2. 用无菌 1x PBS（不含钙和镁离子，pH 7.4）稀释 PTX 储备溶液 50 倍，制成 200 ng/100 μL 溶液以供使用。

3. EAE动物模型的建立

1. 使用8-12周龄的雄性或雌性C57BL / 6J小鼠构建EAE模型。确保小鼠在免疫接种前充分适应喂养环境。
2. 通过按下设备的脉冲按钮（参见材料表）在4°C下离心制备的MOG_35-55乳液（步骤1）2-3秒，以沉淀管底部的所有乳液。
   注意:MOG_35-55 乳液可在-20°C下储存数天。为避免药物失败，建议尽快使用。
3. 将 22 G 针头连接到 1 mL 注射器筒上，吸出 MOG 35-55 乳液，然后将 MOG_35-55 乳液转移到新的 1 mL 注射器筒中。固定 1 mL 注射器筒和带密封膜的 26 G 针头之间的连接（参见材料表）。
   注意:将 MOG_35-55 乳液装入 1 mL 注射器筒中时，避免气泡。
4. 用70%乙醇擦拭和消毒注射部位。
5. 在小鼠背脊的每一侧皮下注射MOG_35-55 乳剂，每侧100μL。观察注射操作完成后小鼠背部皮肤下球状肿块的自动形成。
   注意:确保有经验的实验者执行免疫过程，并且注射轻柔缓慢地完成，以尽量减少对小鼠的压力。
6. 腹膜内注射上述小鼠100μLPTX（步骤2）。
   注意:免疫接种当天是第 0 天。此外，确保可以准确识别小鼠以进行后续的日常评估，例如在小鼠尾巴上使用颜色标记。
7. 在免疫接种后第 2 天注射相同剂量的 PTX。
8. 准备一组未免疫的小鼠作为野生型（WT）小鼠。

4.小鼠的临床监测

1. 每天记录EAE和WT小鼠的体重。
   注意:EAE的严重程度与小鼠的体重减轻呈正相关，因此体重也是一个非常重要的监测指标。
2. 使用 表1中列出的0-5评分系统监测免疫后0-21天的小鼠状态。
   注意:介于两者之间的症状计为正负 0.5 分。

5. 露天试验

注意:为此步骤选择的实验动物是处于早期发作，峰值和缓解期的EAE小鼠。此外，WT小鼠用作对照。需要注意的是，在建模之前对所有小鼠进行了焦虑样行为测试，以排除患有焦虑症的小鼠进行EAE建模。此外，完全运动丧失能力的高峰期和缓解期的EAE小鼠被排除在测试之外。

1. 准备一个40×40×40cm³ 开放场反应室和一个运动活动（开放场）视频分析系统（见 材料表）。
   注意:相机安装在完全覆盖盒子的位置，反应室光线均匀，测试室要求为安静区域。
2. 在开始实验前1小时将测试小鼠置于测试室中习惯化。
3. 在开始测试之前，用70%乙醇喷洒整个区域，并用干净的纸巾擦拭以确保反应室清洁。
4. 在开始探索之前，将每只老鼠从笼子中单独取出，并将其放在竞技场的同一角落。
   注:盒子底部分为16个网格，其中中间四个网格区域为中心区域，周围区域为外围区域。
5. 点击视频分析系统菜单栏中的开始拍摄按钮，记录时间，开始 拍摄 。
6. 考场内保持安静。
7. 在录制过程中让鼠标自由移动5分钟。
8. 停止采集系统并保存视频。
9. 将鼠标带出竞技场，将其放回笼子中，然后继续下一只鼠标。
   注意:在运行之间用70%乙醇清洁测试区域，以去除异味和其他物质。
10. 使用视频分析系统分析结果。

6. 骨表型分析

1. 在第21天通过颈椎脱位对EAE和WT小鼠实施安乐死。
   注意:进行颈椎脱位手术的人员必须经过良好的培训，以尽量减少动物死亡期间所承受的疼痛。
2. 使鼠标平躺在解剖托盘中并固定四肢。
3. 用镊子握住小鼠后肢皮肤，用剪刀打开小鼠皮肤和肌肉组织。
4. 用剪刀小心地将股骨与胫骨和髋骨分开。
5. 用剪刀去除粘附在股骨上的肌肉，并在室温下将股骨放入70%乙醇中。
6. 使用各向同性体素大小为10μm，峰值X射线管电压为70 kV，X射线强度为0.114 mA的显微CT系统（见 材料表）扫描股骨远端。
   注意: 3D 高斯滤波器允许对 2D 阈值图像进行去噪。
7. 分析从股骨干中部扫描的 100 个切片以测量股骨参数，包括骨体积、组织体积、骨矿物质密度、小梁分离、小梁数、小梁连接密度以及小梁和皮质厚度。
   注意:从小鼠股骨远端生长板的近端开始，发现完全没有骨骺帽结构的切片，并继续向股骨近端延伸100个切片，在远离内皮质表面的几个体素处手动勾勒轮廓以识别骨骺小梁。
8. 通过在显微 CT 系统中堆叠来自轮廓区域的阈值 2D 图像来创建 3D 重建。

结果

小鼠免疫后，每天记录小鼠的体重，并根据上述方案评估其临床症状（步骤4）。在免疫MOG肽的C57BL/6J小鼠中，由于病变的位置主要局限于脊髓，EAE小鼠的发病机制从尾端扩散到头部。在疾病开始时，EAE小鼠表现出尾巴无力和下垂，随后是后肢无力，运动不协调和瘫痪。随着病情的恶化，逐渐发展为前肢无力，瘫痪，严重时导致小鼠移动困难，甚至濒临死亡。如图 1A所示，具?...

讨论

MS是中枢神经系统的脱髓鞘炎症性疾病，是导致年轻人慢性残疾的最常见神经系统疾病之一，给家庭和社会带来巨大负担3^，4。MS一直被归类为器官特异性T细胞介导的自身免疫性疾病，诱导自身免疫系统缓慢侵蚀CNS，这将涉及全身的多个系统²⁷。典型的临床症状包括视力障碍、运动障碍、认知和情绪障碍等6^，

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe(with 26 G needle)	Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd	60017031
2 mL microcentrifuge tube	HAIKELASI	KY-LXG2A
22 G needle	Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd	60017208
Complete Freund’s Adjuvant	Sigma	F5881	Stored at 4 °C, 1 mg of heat-inactivated MTB (H37Ra) per mL
Conditioned place preference system	Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd		Animal behavior
Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10009218	Stored at RT
Locomotion activity (open field) video analysis system	Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd	DigBehv-002	Animal behavior
MOG35-55 peptide	Gill Biochemical Co., Ltd	GLS-Y-M-03590	Stored at -20 °C
Mycobacterium tuberculosis H37Ra	BD	231141	Stored at 4 °C
Open field reaction chamber	Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd		Animal behavior
Pertussis toxin	Calbiochem	516560	Stored at 4 °C
Phosphate Buffered Saline			Made in our laboratory
Scissor	Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd	J21010
Sealing film	Heathrow Scientific	HS 234526B
Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge	Thermo Scientific	75002447
Steel ball	QIAGEN	69975
TissueLyser II	QIAGEN	85300
Tweezer	Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd	JD1060
μCT 35 desktop microCT scanner	Scanco Medical AG, Bassersdorf, Switzerland