Induction et divers indicateurs d’évaluation de l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale

Résumé

Le présent protocole décrit l’induction d’une encéphalomyélite auto-immune expérimentale dans un modèle murin utilisant la glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline et la surveillance du processus de la maladie à l’aide d’un système de notation clinique. Les symptômes expérimentaux liés à l’encéphalomyélite auto-immune sont analysés à l’aide d’une micro-tomodensitométrie du fémur de souris et d’un test en plein champ pour évaluer le processus de la maladie de manière exhaustive.

Résumé

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune typique du système nerveux central (SNC) caractérisée par une infiltration inflammatoire, une démyélinisation et des lésions axonales. À l’heure actuelle, il n’existe aucune mesure pour guérir complètement la SP, mais de multiples traitements modificateurs de la maladie (DMT) sont disponibles pour contrôler et atténuer la progression de la maladie. Il existe des similitudes significatives entre les caractéristiques pathologiques du SNC des patients atteints d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) et de SEP. L’EAE a été largement utilisée comme modèle représentatif pour déterminer l’efficacité des médicaments contre la SP et explorer la mise au point de nouveaux traitements contre la SP. L’induction active de l’EAE chez la souris a un effet stable et reproductible et est particulièrement adaptée à l’étude des effets des médicaments ou des gènes sur la neuroinflammation auto-immune. La méthode d’immunisation des souris C57BL/6J avec la glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline (MOG_35-55) et l’évaluation quotidienne des symptômes de la maladie à l’aide d’un système de notation clinique sont principalement partagées. Compte tenu de l’étiologie complexe de la SEP avec diverses manifestations cliniques, le système de notation clinique existant ne peut pas satisfaire l’évaluation du traitement de la maladie. Pour éviter les lacunes d’une seule intervention, de nouveaux indicateurs permettant d’évaluer l’EAE en fonction des manifestations cliniques d’humeurs anxieuses et d’ostéoporose chez les patients atteints de SEP sont créés afin de fournir une évaluation plus complète du traitement de la SEP.

Introduction

Les maladies auto-immunes sont un spectre de troubles causés par la réponse immunitaire du système immunitaire à ses propres antigènes entraînant des lésions tissulaires ou un dysfonctionnement¹. La sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune chronique de polyneuropathie du système nerveux central (SNC), caractérisée par une infiltration inflammatoire, une démyélinisation et une dégénérescence axonale neuronale ^2,3. À l’heure actuelle, la SEP a touché jusqu’à 2,5 millions de personnes dans le monde, principalement des jeunes et des personnes d’âge moyen âgées de 20 à 40 ans, qui sont souvent l’épine dorsale de leur famille et de la société. Cela a eu un impact et un préjudice considérables pour les familles et la société ^2,4.

La SEP est une maladie multifactorielle aux manifestations cliniques diverses et complexes. En plus des troubles neurologiques classiques caractérisés par une infiltration inflammatoire et une démyélinisation, la SEP présente souvent une déficience visuelle, une dyskinésie des membres et des troubles cognitifs et émotionnels ^5,6,7. Si les patients atteints de SEP ne reçoivent pas le traitement approprié et correct, la moitié d’entre eux vivront dans des fauteuils roulants après 20 ans, et près de la moitié d’entre eux éprouveront des symptômes dépressifs et anxieux, conduisant à des niveaux beaucoup plus élevés d’idées suicidaires que la population générale ^8,9.

Malgré une longue période de recherche, l’étiologie de la SP reste insaisissable et la pathogenèse de la SEP n’a pas encore été élucidée. Les modèles animaux de SP ont permis de servir d’outils de test pour explorer le développement de maladies et de nouvelles approches thérapeutiques, malgré les différences significatives entre les systèmes immunitaire des rongeurs et humains, tout en partageant certains principes de base. L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est actuellement le modèle animal idéal pour étudier la SEP, qui utilise l’immunité autoantigénique des protéines de myéline pour induire une auto-immunité aux composants du SNC chez les souris sensibles, avec l’ajout d’adjuvant de Freund complet (CFA) et de toxine de la coqueluche (PTX) pour améliorer la réponse immunitaire humorale. Selon le bagage génétique et les antigènes immunitaires, différents processus pathogènes, y compris aigus, récurrents-rémittents ou chroniques, sont obtenus pour imiter diverses formes cliniques de SEP^10,11,12. Les immunogènes pertinents couramment utilisés dans la construction des modèles EAE proviennent de protéines auto-SNC, telles que la protéine basique de myéline (MBP), la protéine protéolipide (PLP) ou la glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline (MOG). Les souris SJL/L immunisées par MBP ou PLP développent une évolution cyclique récurrente-rémittente et le MOG déclenche une EAE progressive chronique chez les souris C57BL/6^11,12,13.

L’objectif principal du traitement modificateur de la maladie (DMT) est de minimiser les symptômes de la maladie et d’améliorer la fonction⁶. Plusieurs médicaments sont utilisés cliniquement pour soulager la SEP, mais aucun médicament n’a encore été utilisé pour la guérir complètement, révélant la nécessité d’un traitement synergique. Les souris C57BL / 6 sont actuellement les plus couramment utilisées pour construire des souris transgéniques, et dans ce travail, un modèle EAE induit par MOG_35-55 chez les souris C57BL / 6J avec une échelle de 5 points a été utilisé pour surveiller la progression de la maladie. Les modèles EAE souffrent également d’humeurs anxieuses et de perte osseuse, ainsi que des lésions démyélinisantes largement connues. Ici, la méthode pour évaluer les symptômes de l’EAE à partir de perspectives multiples à l’aide d’un test en plein champ et d’une analyse de micro-tomodensitométrie (Micro-CT) est également décrite.

Protocole

Le Comité de protection des animaux de l’Université de Tongji a approuvé le présent travail et toutes les directives en matière de soins aux animaux ont été suivies. Des souris C57BL / 6J mâles ou femelles âgées de 8 à 12 semaines ont été utilisées pour les expériences. On s’est assuré que l’âge et le sexe étaient les mêmes dans les groupes expérimentaux; sinon, la susceptibilité à la maladie a été affectée. Les souris ont été logées dans un environnement spécifique exempt d’agents pathogènes avec des cycles alternés de lumière et d’obscurité de 12 h dans des conditions constantes (température ambiante 23 ± 1 °C, humidité 50% ± 10%), avec libre accès à la nourriture et à l’eau des souris.

1. Préparation de l’émulsion MOG_35-55

1. Ajouter Mycobacterium tuberculosis lyophilisé inactivé par la chaleur (MTB, H37Ra) pour compléter l’adjuvant de Freund (lui-même contenant 1 mg/mL de MTB inactivé par la chaleur, H37Ra), ce qui donne une concentration finale de MTB de 5 mg/mL (voir le tableau des matières).
   NOTE: Toute l’opération doit être terminée dans l’enceinte de biosécurité; N’ouvrez pas l’air soufflé.
2. Dissoudre le peptide MOG_35-55 lyophilisé (voir le tableau des matières) avec du phosphate tamponné salin (PBS) prérefroidi stérile (sans ions calcium et magnésium, pH 7,4) pour préparer la solution antigénique à la concentration de 2 mg/mL.
3. Prenez un tube microcentrifuge propre de 2 ml et ajoutez une bille d’acier stérilisée de 5 mm (voir le tableau des matériaux) à chaque tube.
4. Ajouter 500 μL d’adjuvant de Freund complet contenant 5 mg/mL de MTB et 500 μL de solution d’antigène MOG_35-55 au tube microcentrifuge ci-dessus contenant une bille d’acier.
5. Osciller le tube ci-dessus sur un TissueLyser (voir le tableau des matériaux) pendant 10 min, refroidir sur de la glace pendant 10 min, et répéter quatre fois pour bien mélanger et finalement former une solution visqueuse blanche.
   REMARQUE: Une bonne émulsification est une étape clé dans la préparation de l’émulsion MOG_35-55 , un mélange minutieux est donc nécessaire. Le TissueLyser est réglé sur une vitesse de 28 Hz.

2. Préparation de la toxine coqueluche (PTX)

1. Préparer PTX avec ddH₂O à une concentration de 100 μg/mL et conserver à 4 °C.
2. Diluer la solution mère PTX 50 fois avec 1x PBS stérile (sans ions calcium et magnésium, pH 7,4) pour obtenir une solution de 200 ng/100 μL à utiliser.

3. Mise en place d’un modèle animal EAE

1. Construire le modèle EAE en utilisant les souris C57BL/6J mâles ou femelles âgées de 8 à 12 semaines. S’assurer que les souris sont adéquatement acclimatées à l’environnement d’alimentation avant l’immunisation.
2. Centrifuger l’émulsion MOG_35-55 préparée (étape 1) à 4 °C pendant 2-3 s en appuyant sur le bouton Pulse de l’équipement (voir tableau des matériaux) pour précipiter toutes les émulsions au fond du tube.
   REMARQUE: L’émulsion MOG_35-55 peut être conservée à -20 °C pendant plusieurs jours. Pour éviter l’échec du médicament, il est recommandé de l’utiliser dès que possible.
3. Fixez une aiguille de 22 G à un baril de seringue de 1 mL, aspirez l’émulsion MOG 35-55 et transférez l’émulsion MOG_35-55 dans un nouveau corps de seringue de 1 mL. Fixez la connexion entre le corps de la seringue de 1 mL et une aiguille de 26 G avec un film d’étanchéité (voir le tableau des matériaux).
   REMARQUE: Évitez les bulles d’air lors du chargement de l’émulsion MOG_35-55 dans des barils de seringue de 1 mL.
4. Essuyez et désinfectez le site d’injection avec de l’éthanol à 70%.
5. Injecter l’émulsion MOG_{35-55 par voie sous-cutanée} de chaque côté de l’épine dorsale des souris, 100 μL de chaque côté. Observez la formation automatique de masses bulbeuses sous la peau du dos des souris une fois l’opération d’injection terminée.
   REMARQUE : Assurez-vous que des expérimentateurs expérimentés effectuent le processus d’immunisation et que l’injection se fait doucement et lentement pour minimiser la pression sur les souris.
6. Injectez les souris ci-dessus par voie intrapéritonéale avec 100 μL de PTX (étape 2).
   REMARQUE : Le jour de la vaccination est le jour 0. Assurez-vous également que les souris peuvent être identifiées avec précision pour une évaluation quotidienne ultérieure, comme l’utilisation d’un marqueur de couleur sur la queue des souris.
7. Injectez la même dose de PTX le jour 2 après la vaccination.
8. Préparer un groupe de souris non immunisées en tant que souris de type sauvage (WT).

4. Surveillance clinique des souris

1. Enregistrez quotidiennement le poids corporel des souris EAE et WT.
   REMARQUE: La gravité de l’EAE est positivement corrélée avec la perte de poids des souris, de sorte que le poids corporel est également un indice de surveillance très important.
2. Surveiller l’état des souris de 0 à 21 jours après l’immunisation à l’aide du système de notation de 0 à 5 indiqué au tableau 1.
   REMARQUE: Les symptômes entre les deux sont comptés comme plus ou moins 0,5 points.

5. Test en champ ouvert

REMARQUE : Les animaux de laboratoire sélectionnés pour cette étape sont des souris EAE dans les périodes d’apparition précoce, de pic et de rémission. En outre, des souris WT ont été utilisées comme témoin. Il est à noter que toutes les souris ont été testées pour un comportement anxieux avant la modélisation afin d’exclure les souris souffrant de troubles anxieux pour la modélisation EAE. De plus, les souris EAE en période de pointe et de rémission avec incapacité motrice complète ont été exclues du test.

1. Préparer une chambre de réaction en champ ouvert de 40 × 40 × 40 cm³ et un système d’analyse vidéo de l’activité de locomotion (champ ouvert) (voir le tableau des matériaux).
   REMARQUE: La caméra est installée dans une position qui recouvre complètement la boîte, la salle de réaction est uniformément éclairée et la salle de test doit être une zone calme.
2. Placer les souris d’essai dans la salle d’essai pour l’habituation 1 h avant de commencer l’expérience.
3. Vaporisez toute la zone avec de l’éthanol à 70% et essuyez avec une serviette en papier propre pour vous assurer que la chambre de réaction est propre avant de commencer le test.
4. Retirez chaque souris individuellement de sa cage et placez-la dans le même coin de l’arène avant de commencer à explorer.
   REMARQUE: Le bas de la boîte est divisé en 16 grilles, dont la zone des quatre grilles du milieu est la zone centrale et la zone environnante est la zone périphérique.
5. Cliquez sur le bouton Démarrer la capture dans la barre de menu du système d’analyse vidéo, enregistrez le temps et commencez la prise de vue.
6. Restez silencieux dans la salle de test.
7. Laissez la souris se déplacer librement pendant 5 minutes pendant le processus d’enregistrement.
8. Arrêtez le système d’acquisition et enregistrez la vidéo.
9. Sortez la souris de l’arène, remettez-la dans la cage et passez à la souris suivante.
   REMARQUE : Nettoyez la zone d’essai avec de l’éthanol à 70 % entre les cycles pour éliminer les odeurs et autres substances.
10. Analysez les résultats à l’aide du système d’analyse vidéo.

6. Analyse du phénotype osseux

1. Euthanasier les souris EAE et WT par luxation cervicale le 21e jour.
   REMARQUE : Le personnel qui effectue les opérations de luxation cervicale doit être bien formé pour minimiser la douleur endurée lors de la mort de l’animal.
2. Faites reposer la souris à plat dans un plateau de dissection et fixez les extrémités.
3. Tenez la peau du membre postérieur de la souris avec une pince et ouvrez la peau et le tissu musculaire de la souris avec des ciseaux.
4. Séparez soigneusement le fémur du tibia et de l’os de la hanche avec des ciseaux.
5. Enlevez le muscle adhérant au fémur avec des ciseaux et placez le fémur dans de l’éthanol à 70% à température ambiante.
6. Scanner le fémur distal à l’aide d’un système micro-CT (voir le tableau des matériaux) avec une taille de voxel isotrope de 10 μm, avec une tension maximale du tube radiogène de 70 kV et une intensité de rayons X de 0,114 mA.
   REMARQUE: Un filtre gaussien 3D permet le débruitage d’images de seuil 2D.
7. Analyser les 100 tranches scannées à partir de la tige fémorale moyenne pour mesurer les paramètres du fémur, y compris le volume osseux, le volume tissu, la densité minérale osseuse, la séparation trabéculaire, le nombre trabéculaire, la densité de connexion trabéculaire et l’épaisseur trabéculaire et corticale.
   NOTE: À partir de l’extrémité proximale de la plaque de croissance distale du fémur chez la souris, des sections complètement dépourvues de structures de calotte épiphysaire ont été trouvées et ont continué à s’étendre sur 100 tranches vers le fémur proximal, qui ont été tracées manuellement à plusieurs voxels de la surface corticale interne pour identifier les trabécules épiphysaires.
8. Créez les reconstructions 3D en empilant des images 2D de seuil à partir de régions de contour dans le système micro-CT.

Résultats

Après immunisation des souris, le poids corporel des souris est enregistré quotidiennement et leurs symptômes cliniques sont évalués selon le protocole décrit ci-dessus (étape 4). Chez les souris C57BL / 6J immunisées avec le peptide MOG, parce que l’emplacement de la lésion est principalement confiné à la moelle épinière, la pathogenèse des souris EAE se propage de l’extrémité de la queue à la tête. Au début de la maladie, les souris EAE présentent une faiblesse et un affaissement de la queue, su...

Discussion

La SEP est une maladie inflammatoire démyélinisante du SNC et est l’un des troubles neurologiques les plus courants causant une invalidité chronique chez les jeunes, imposant un fardeau énorme aux familles et à la société ^3,4. La SEP a toujours été classée comme une maladie auto-immune à médiation par les lymphocytes T spécifiques aux organes, incitant le système auto-immun à éroder lentement le SNC, ce qui impliquera plusieurs systèmes dans to...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe(with 26 G needle)	Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd	60017031
2 mL microcentrifuge tube	HAIKELASI	KY-LXG2A
22 G needle	Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd	60017208
Complete Freund’s Adjuvant	Sigma	F5881	Stored at 4 °C, 1 mg of heat-inactivated MTB (H37Ra) per mL
Conditioned place preference system	Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd		Animal behavior
Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10009218	Stored at RT
Locomotion activity (open field) video analysis system	Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd	DigBehv-002	Animal behavior
MOG35-55 peptide	Gill Biochemical Co., Ltd	GLS-Y-M-03590	Stored at -20 °C
Mycobacterium tuberculosis H37Ra	BD	231141	Stored at 4 °C
Open field reaction chamber	Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd		Animal behavior
Pertussis toxin	Calbiochem	516560	Stored at 4 °C
Phosphate Buffered Saline			Made in our laboratory
Scissor	Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd	J21010
Sealing film	Heathrow Scientific	HS 234526B
Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge	Thermo Scientific	75002447
Steel ball	QIAGEN	69975
TissueLyser II	QIAGEN	85300
Tweezer	Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd	JD1060
μCT 35 desktop microCT scanner	Scanco Medical AG, Bassersdorf, Switzerland