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要約

本プロトコルは、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質を使用し、臨床スコアリングシステムを使用して疾患プロセスをモニタリングするマウスモデルにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘発を記載しています。実験的自己免疫性脳脊髄炎関連症状は、マウス大腿骨マイクロコンピューター断層撮影分析とオープンフィールドテストを使用して分析され、疾患プロセスを包括的に評価します。

要約

多発性硬化症(MS)は、炎症性浸潤、脱髄、および軸索損傷を特徴とする中枢神経系(CNS)の典型的な自己免疫疾患です。現在、MSを完全に治癒するための対策はありませんが、疾患の進行を制御および緩和するために、複数の疾患修飾療法(DMT)が利用可能です。実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)とMS患者のCNS病理学的特徴の間には有意な類似点がある。EAEは、MS薬の有効性を判断し、MS疾患の新しい治療法の開発を探索するための代表的なモデルとして広く使用されています。マウスにおけるEAEの能動的誘導は、安定かつ再現性のある効果を有し、自己免疫性神経炎症に対する薬物または遺伝子の効果を研究するのに特に適している。C57BL/6Jマウスにミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG35-55)を免疫する方法と、臨床スコアリングシステムを用いた疾患症状の日々の評価が主に共有されています。多様な臨床症状を伴うMSの複雑な病因を考えると、既存の臨床スコアリングシステムは疾患治療の評価を満たすことができません。単一の介入の欠点を回避するために、MS患者の不安様気分および骨粗鬆症の臨床症状に基づいてEAEを評価するための新しい指標が作成され、MS治療のより包括的な評価が提供されます。

概要

自己免疫疾患は、それ自体の抗原に対する免疫系の免疫応答によって引き起こされる一連の障害であり、組織の損傷または機能障害を引き起こします1。多発性硬化症(MS)は、中枢神経系(CNS)における多発ニューロパチーの慢性自己免疫疾患であり、炎症性浸潤、脱髄、およびニューロン軸索変性を特徴とする2,3。現在、MSは世界中で250万人もの人々に影響を与えており、主に20〜40歳の若者と中年の人々であり、家族や社会のバックボーンであることがよくあります。これは、家族や社会に多大な影響と害をもたらしました2,4。

MSは、多様で複雑な臨床症状を伴う多因子性疾患です。炎症性浸潤および脱髄を特徴とする古典的な神経障害に加えて、MSはしばしば視覚障害、四肢ジスキネジア、および認知および感情障害を示します5,6,7。MS患者が適切で正しい治療を受けない場合、その半数は20年後に車椅子で生活し、半数近くが抑うつ症状や不安症状を経験し、一般集団よりもはるかに高いレベルの自殺念慮につながります8,9。

長い研究期間にもかかわらず、MSの病因はとらえどころのないままであり、MSの病因はまだ解明されていません。MSの動物モデルは、げっ歯類とヒトの免疫系の間に大きな違いがあるにもかかわらず、同時にいくつかの基本原則を共有しながら、疾患の発症と新しい治療アプローチを探求するためのテストツールとして機能することを可能にしました。実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は現在、MSを研究するための理想的な動物モデルであり、ミエリンタンパク質からの自己抗原免疫を使用して感受性マウスのCNS成分に対する自己免疫を誘導し、完全なフロイントアジュバント(CFA)と百日咳毒素(PTX)を加えて体液性免疫応答を強化します。遺伝的背景および免疫抗原に応じて、MS10、11、12の様々な臨床形態を模倣するために、急性、再発寛解、または慢性を含む異なる疾患プロセスが得られる。EAEモデルの構築に一般的に使用される関連する免疫原は、ミエリン塩基性タンパク質(MBP)、プロテオリピドタンパク質(PLP)、またはミエリン希突起膠細胞糖タンパク質(MOG)などの自己CNSタンパク質に由来します。MBPまたはPLP免疫SJL/Lマウスは再発寛解型経過を発症し、MOGはC57BL/6マウスにおいて慢性進行性EAEを引き起こす11,12,13。

疾患修飾療法(DMT)の主な目的は、疾患の症状を最小限に抑え、機能を改善することです6。MSを緩和するために臨床的に使用されている薬剤はいくつかありますが、MSを完全に治癒するための薬剤はまだ使用されておらず、相乗的治療の必要性が明らかになりました。現在、トランスジェニックマウスの構築にはC57BL/6マウスが最も一般的に使用されており、この研究では、C57BL/6JマウスのMOG35-55 によって誘導されたEAEモデルを5点スケールで使用して、疾患の進行を監視しました。EAEモデルはまた、不安のような気分や骨量減少、および広く知られている脱髄病変に苦しんでいます。ここでは、オープンフィールドテストとマイクロコンピュータ断層撮影(マイクロCT)分析を用いてEAEの症状を多角的に評価する方法についても説明します。

プロトコル

同済大学の動物管理委員会は現在の作業を承認し、すべての動物飼育ガイドラインに従いました。8〜12週齢の雄または雌のC57BL / 6Jマウスを実験に使用しました。実験群では年齢と性別が同じであることが確認された。そうでなければ、病気に対する感受性が影響を受けました。マウスを、一定の条件(室温23±1°C、湿度50%±10%)で12時間の明暗サイクルを交互に行い、マウスの餌と水を自由に利用できる特定の病原体のない環境に収容しました。

1. MOG35-55 エマルジョンの調製

  1. 熱不活化凍結乾燥結核菌(MTB、H37Ra)を加えてフロイントアジュバント(それ自体に1 mg/mLの熱不活化MTB、H37Raを含む)を完成させ、最終的なMTB濃度は5 mg/mLになります( 材料の表を参照)。
    注意: 操作全体はバイオセーフティキャビネットで完了する必要があります。吹く空気を開けないでください。
  2. 凍結乾燥MOG35-55 ペプチド( 材料の表を参照)を滅菌予冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)(カルシウムおよびマグネシウムイオンなし、pH 7.4)で溶解し、2 mg/mLの濃度で抗原溶液を調製します。
  3. 清潔な2 mLマイクロ遠心チューブを取り、滅菌した5 mmスチールボール( 材料の表を参照)を各チューブに1つ追加します。
  4. 5 mg/mLのMTBと500 μLのMOG35-55 抗原溶液を含む500 μLの完全フロイントアジュバントを、1つのスチールボールを含む上記の微量遠心チューブに追加します。
  5. 上記のチューブをTissueLyser( 材料の表を参照)で10分間振動させ、氷上で10分間冷却し、4回繰り返してよく混合し、最終的に白色粘性溶液を形成します。
    注:良好な乳化はMOG35-55 エマルジョンを調製する上で重要なステップであるため、完全な混合が必要です。ティッシュライザーの速度は28Hzに設定されています。

2.百日咳毒素(PTX)の調製

  1. ddH2Oを含むPTXを100 μg/mLの濃度に調製し、4°Cで保存します。
  2. PTXストック溶液を滅菌1x PBS(カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンなし、pH 7.4)で50倍に希釈して、使用する200 ng/100 μL溶液を作ります。

3. EAE動物モデルの確立

  1. 8〜12週齢の雄または雌のC57BL / 6Jマウスを使用してEAEモデルを構築します。免疫する前に、マウスが摂食環境に適切に順応していることを確認してください。
  2. 調製したMOG35-55 エマルジョン(ステップ1)を4°Cで2-3秒間遠心分離し、装置の パルス ボタン( 材料表を参照)を押して、チューブの底部にすべてのエマルジョンを沈殿させた。
    注:MOG35-55 エマルジョンは、-20°Cで数日間保存できます。薬物の失敗を避けるために、できるだけ早くそれを使用することをお勧めします。
  3. 22 Gの針を1 mLシリンジバレルに取り付け、MOG 35-55エマルジョンを吸引し、MOG35-55エマルジョンを新しい1 mLシリンジバレルに移します。1 mLシリンジバレルと26 G針の間の接続をシーリングフィルムで固定します(材料の表を参照)。
    注意: MOG35-55 エマルジョンを1mLシリンジバレルに入れるときは、気泡を避けてください。
  4. 注射部位を70%エタノールで拭いて消毒します。
  5. MOG35-55 エマルジョンをマウスの背背脊椎の両側に皮下注射し、両側に100μLを注入する。注射操作が完了した後、マウスの背側の皮膚の下に球根状の腫瘤が自動的に形成されるのを観察する。
    注:経験豊富な実験者が免疫プロセスを実行し、マウスへの圧力を最小限に抑えるために注射が穏やかかつゆっくりと行われることを確認してください。
  6. 上記のマウスに100 μLのPTXを腹腔内に注射する(工程2)。
    注:予防接種の日は0日目です。また、マウスの尾部にカラーマーカーを用いるなど、その後の日々の評価のためにマウスを正確に識別できることを確認する。
  7. 予防接種後2日目に同じ用量のPTXを注射します。
  8. 野生型(WT)マウスとして未免疫マウスの群を準備する。

4. マウスの臨床モニタリング

  1. EAEおよびWTマウスの体重を毎日記録する。
    注:EAEの重症度はマウスの体重減少と正の相関があるため、体重も非常に重要なモニタリング指標です。
  2. 表1に列挙した0〜5スコアリングシステムを用いて、免疫後0〜21日目のマウスの状態をモニターする。
    注:その間の症状はプラスマイナス0.5ポイントとしてカウントされます。

5.オープンフィールドテスト

注:このステップで選択された実験動物は、早期発症、ピーク、および寛解期のEAEマウスです。また、対照としてWTマウスを用いた。EAEモデリングのために不安障害を有するマウスを除外するために、全てのマウスをモデリング前に不安様行動について試験したことに留意されたい。さらに、完全な運動能力不全を有するピークおよび寛解期のEAEマウスは試験から除外された。

  1. 40×40×40cm3のオープンフィールド反応チャンバーと移動活動(オープンフィールド)ビデオ分析システムを準備します(材料の表を参照)。
    注意: カメラはボックスを完全に覆う位置に設置され、反応室は均一に照らされ、テストルームは静かな場所にする必要があります。
  2. 実験開始の1時間前に、試験マウスを馴化のために試験室に置く。
  3. テストを開始する前に、領域全体に70%エタノールをスプレーし、清潔なペーパータオルで拭いて、反応チャンバーがきれいであることを確認します。
  4. 探索を開始する前に、ケージから各マウスを個別に取り出し、アリーナの同じ隅に置きます。
    注意: ボックスの下部は16のグリッドに分割されており、そのうち中央の4つのグリッド領域が中央領域であり、その周辺領域が周辺領域です。
  5. ビデオ分析システムのメニューバーにある[ キャプチャの開始 ]ボタンをクリックし、時間を記録して、撮影を開始します。
  6. テストルームでは静かにしてください。
  7. 記録プロセス中にマウスを5分間自由に動かします。
  8. アクイジションシステムを停止し、ビデオを保存します。
  9. マウスをアリーナから取り出し、ケージに戻し、次のマウスに進みます。
    注意: 臭いやその他の物質を除去するために、実行の合間に70%エタノールでテストエリアを清掃します。
  10. ビデオ分析システムを使用して結果を分析します。

6.骨表現型の分析

  1. EAEマウスとWTマウスを21日目に頸部脱臼により安楽死させる。
    注:頸部脱臼手術を行う担当者は、動物の死亡中に耐える痛みを最小限に抑えるために十分な訓練を受ける必要があります。
  2. マウスを解剖トレイに平らに置き、四肢を固定します。
  3. マウスの後肢の皮膚を鉗子で持ち、マウスの皮膚と筋肉組織をハサミで開きます。
  4. 大腿骨を脛骨と腰の骨からハサミで慎重に分離します。
  5. 大腿骨に付着した筋肉をハサミで取り除き、室温で70%エタノールに大腿骨を置きます。
  6. 等方性ボクセルサイズ10 μm、ピークX線管電圧70 kV、X線強度0.114 mAのマイクロCTシステム( 材料表を参照)を使用して遠位大腿骨をスキャンします。
    注:3Dガウスフィルターを使用すると、2Dしきい値画像のノイズ除去が可能になります。
  7. 中央大腿骨シャフトからスキャンされた100スライスを分析して、骨量、組織体積、骨塩密度、骨梁分離、骨梁数、小柱接続密度、小柱と皮質の厚さなどの大腿骨パラメータを測定します。
    注:マウスの大腿骨遠位成長板の近位端から始めて、骨端キャップ構造を完全に欠いているセクションが見つかり、骨端小柱を特定するために、皮質表面から離れたいくつかのボクセルで手動で輪郭を描いた大腿骨近位に向かって100スライスを伸ばし続けました。
  8. マイクロCTシステムの輪郭領域からしきい値の2D画像を積み重ねることにより、3D再構成を作成します。

結果

マウスの免疫後、マウスの体重が毎日記録され、それらの臨床症状が上記のプロトコルに従って評価される(ステップ4)。MOGペプチドを免疫したC57BL/6Jマウスでは、病変部位が主に脊髄に限定されるため、EAEマウスの病因は尾端から頭部に広がります。疾患の開始時に、EAEマウスは尾の脱力感および垂れ下がりを示し、続いて後肢の脱力感、協調性のない動き、および麻痺を示す。病気が悪化?...

ディスカッション

MSはCNSの脱髄炎症性疾患であり、若者に慢性障害を引き起こす最も一般的な神経障害の1つであり、家族や社会に大きな負担をかけています3,4。MSは常に臓器特異的T細胞媒介性自己免疫疾患として分類されており、自己免疫系がCNSをゆっくりと侵食するように誘導し、これは全身の複数の系を含むであろう27。典型的な臨床症状には...

開示事項

著者は開示するものは何もありません。

謝辞

著者らは、中国国家自然科学財団(32070768、31871404、31900658、32270754)および国家重点薬物研究所からの支援を認めている。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL syringe(with 26 G needle)Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd60017031
2 mL microcentrifuge tubeHAIKELASIKY-LXG2A
22 G needleShanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd60017208
Complete Freund’s AdjuvantSigmaF5881Stored at 4 °C, 1 mg of heat-inactivated MTB (H37Ra) per mL
Conditioned place preference systemShanghai Jiliang Software Technology Co., LtdAnimal behavior
EthanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10009218Stored at RT
Locomotion activity (open field) video analysis systemShanghai Jiliang Software Technology Co., LtdDigBehv-002Animal behavior
MOG35-55 peptideGill Biochemical Co., LtdGLS-Y-M-03590Stored at -20 °C
Mycobacterium tuberculosis H37RaBD231141Stored at 4 °C
Open field reaction chamberShanghai Jiliang Software Technology Co., LtdAnimal behavior
Pertussis toxinCalbiochem516560Stored at 4 °C
Phosphate Buffered SalineMade in our laboratory
ScissorShanghai Medical Instrument (group) Co., LtdJ21010
Sealing filmHeathrow ScientificHS 234526B
Sorvall Legend Micro 21R MicrocentrifugeThermo Scientific75002447
Steel ballQIAGEN69975
TissueLyser IIQIAGEN85300
TweezerShanghai Medical Instrument (group) Co., LtdJD1060
μCT 35 desktop microCT scannerScanco Medical AG, Bassersdorf, Switzerland

参考文献

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