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요약

본 프로토콜은 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질을 사용하는 마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염의 유도 및 임상 스코어링 시스템을 사용하여 질환 과정을 모니터링하는 것을 설명한다. 실험적 자가면역 뇌척수염 관련 증상은 마우스 대퇴골 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 분석 및 오픈 필드 테스트를 사용하여 분석되어 질병 과정을 종합적으로 평가합니다.

초록

다발성 경화증 (MS)은 염증성 침윤, 탈수초화 및 축삭 손상을 특징으로 하는 중추신경계(CNS)의 전형적인 자가면역 질환이다. 현재 MS를 완전히 치료할 수있는 조치는 없지만 질병 진행을 제어하고 완화하기 위해 여러 질병 수정 요법 (DMT)을 사용할 수 있습니다. 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE)과 MS 환자의 CNS 병리학적 특징 사이에는 상당한 유사성이 있다. EAE는 MS 약물의 효능을 결정하고 MS 질환에 대한 새로운 치료법 개발을 모색하는 대표적인 모델로 널리 사용되었습니다. 마우스에서 EAE의 활성 유도는 안정하고 재현 가능한 효과를 가지며,자가 면역 신경 염증에 대한 약물 또는 유전자의 효과를 연구하는데 특히 적합하다. C57BL/6J 마우스를 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(MOG35-55)로 면역화하는 방법과 임상 점수 시스템을 사용하여 질병 증상의 일일 평가가 주로 공유됩니다. 다양한 임상 증상을 가진 MS의 복잡한 병인을 감안할 때 기존 임상 점수 시스템은 질병 치료 평가를 만족시킬 수 없습니다. 단일 개입의 단점을 피하기 위해 MS 환자에서 불안과 유사한 기분 및 골다공증의 임상 증상을 기반으로 EAE를 평가하는 새로운 지표를 만들어 MS 치료에 대한보다 포괄적 인 평가를 제공합니다.

서문

자가면역질환은 자체 항원에 대한 면역계의 면역 반응으로 인해 조직 손상 또는 기능 장애를 초래하는 다양한 장애입니다1. 다발성 경화증 (MS)은 염증성 침윤, 탈수 초화 및 신경 축삭 변성 2,3을 특징으로하는 중추 신경계 (CNS)의 다발성 신경 병증의 만성자가 면역 질환입니다. 현재 MS는 전 세계적으로 250 만 명의 사람들에게 영향을 미쳤으며, 대부분 가족과 사회의 중추 인 20-40 세의 젊은 및 중년의 사람들입니다. 이것은 가족과 사회에 상당한 영향과 해를 끼쳤습니다 2,4.

MS는 다양하고 복잡한 임상 증상을 가진 다 인성 질환입니다. 염증성 침윤 및 탈수초화를 특징으로 하는 고전적인 신경 장애 외에도 MS는 종종 시각 장애, 사지 운동 이상증, 인지 및 정서 장애 5,6,7을 보여줍니다. MS 환자가 적절하고 올바른 치료를받지 못하면 절반은 20 년 후에 휠체어에서 살게되고 거의 절반이 우울 및 불안 증상을 경험하여 일반 인구보다 훨씬 높은 수준의 자살 충동을 느끼게됩니다 8,9.

오랜 연구 기간에도 불구하고 MS의 병인은 여전히 파악하기 어렵고 MS의 발병 기전은 아직 밝혀지지 않았습니다. MS의 동물 모델은 설치류와 인간 면역계의 중요한 차이에도 불구하고 질병 개발 및 새로운 치료법을 탐구하는 동시에 몇 가지 기본 원칙을 공유하는 테스트 도구 역할을 허용했습니다. 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 현재 MS 연구를 위한 이상적인 동물 모델로, 미엘린 단백질의 자가항원 면역을 사용하여 감수성 마우스에서 CNS 성분에 대한 자가면역을 유도하고 체액성 면역 반응을 향상시키기 위해 완전한 프로인트 보조제(CFA) 및 백일해 독소(PTX)를 추가합니다. 유전적 배경 및 면역 항원에 따라, MS10,11,12의 다양한 임상 형태를 모방하기 위해 급성, 재발-완화 또는 만성을 포함한 다양한 질병 과정이 얻어진다. EAE 모델의 구축에 일반적으로 사용되는 관련 면역원은 자가 CNS 단백질, 예컨대 미엘린 염기성 단백질 (MBP), 프로테오리피드 단백질 (PLP), 또는 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 (MOG)으로부터 유래한다. MBP- 또는 PLP-면역화된 SJL/L 마우스는 재발-완화 과정을 개발하고, MOG는 C57BL/6 마우스11,12,13에서 만성 진행성 EAE를 유발한다.

질병 수정 요법 (DMT)의 주요 목적은 질병 증상을 최소화하고 기능을 개선하는 것입니다6. MS를 완화하기 위해 여러 약물이 임상적으로 사용되지만 아직 완전히 치료하는 데 사용되는 약물은 없으므로 시너지 치료의 필요성이 드러납니다. C57BL/6 마우스는 현재 트랜스제닉 마우스를 구축하는데 가장 통상적으로 사용되며, 이 작업에서, 5점 척도를 갖는 C57BL/6J 마우스에서 MOG35-55 에 의해 유도된 EAE 모델을 사용하여 질환 진행을 모니터링하였다. EAE 모델은 또한 불안-유사 기분 및 골 손실, 및 널리 공지된 탈수초성 병변을 앓고 있다. 여기서, 개방 필드 테스트 및 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (Micro-CT) 분석을 사용하여 여러 관점에서 EAE의 증상을 평가하는 방법이 또한 설명된다.

프로토콜

동지 대학의 동물 관리위원회는 현재의 작업을 승인했으며 모든 동물 관리 지침을 따랐습니다. 8-12주령의 수컷 또는 암컷 C57BL/6J 마우스를 실험에 사용하였다. 실험 그룹에서 나이와 성별이 동일하다는 것이 보장되었습니다. 그렇지 않으면 질병에 대한 감수성이 영향을 받았습니다. 마우스는 일정한 조건 (실온 23 ± 1 ° C, 습도 50 % ± 10 %)에서 12 시간의 밝고 어두운 사이클을 번갈아 가며 마우스 음식과 물에 자유롭게 접근 할 수있는 특정 병원체가없는 환경에 수용되었습니다.

1. MOG35-55 에멀젼의 제조

  1. 열 불활성화 동결건조된 결핵균(MTB, H37Ra)을 추가하여 프로인트 보조제(자체 1mg/mL의 열 불활성화 MTB, H37Ra 함유)를 완성하여 최종 MTB 농도가 5mg/mL가 됩니다( 재료 표 참조).
    알림: 전체 작업은 생물 안전 캐비닛에서 완료해야합니다. 부는 공기를 열지 마십시오.
  2. 동결건조된 MOG35-55 펩타이드( 재료 표 참조)를 멸균 사전 냉각 인산완충식염수(PBS)(칼슘 및 마그네슘 이온 없음, pH 7.4)에 용해시켜 2mg/mL 농도의 항원 용액을 준비합니다.
  3. 깨끗한 2mL 미세 원심분리기 튜브를 가져다가 멸균된 5mm 강철 볼( 재료 표 참조) 하나를 각 튜브에 추가합니다.
  4. 5 mg / mL의 MTB와 500 μL의 MOG35-55 항원 용액을 포함하는 500 μL의 완전한 Freund의 보조제를 하나의 강구가 들어있는 위의 미세 원심 분리 튜브에 첨가하십시오.
  5. 위의 튜브를 TissueLyser( 재료 표 참조)에서 10분 동안 진동시키고 얼음에서 10분 동안 식힌 다음 4번 반복하여 잘 혼합하고 마지막으로 흰색 점성 용액을 형성합니다.
    알림: 우수한 유화는 MOG35-55 에멀젼을 준비하는 핵심 단계이므로 철저한 혼합이 필요합니다. TissueLyser는 28Hz의 속도로 설정됩니다.

2. 백일해 독소 (PTX)의 제조

  1. ddH2O로 PTX를 100 μg / mL 농도로 준비하고 4 ° C에서 보관하십시오.
  2. PTX 원액을 멸균 1x PBS(칼슘 및 마그네슘 이온 없음, pH 7.4)로 50배 희석하여 사용할 200ng/100μL 용액을 만듭니다.

3. EAE 동물모델 구축

  1. 8-12주령의 수컷 또는 암컷 C57BL/6J 마우스를 사용하여 EAE 모델을 구축하였다. 예방 접종 전에 마우스가 먹이 환경에 적절하게 순응하는지 확인하십시오.
  2. 준비된 MOG35-55 에멀젼(단계 1)을 장비의 펄스 버튼( 재료 표 참조)을 눌러 4°C에서 2-3초 동안 원심분리하여 튜브 바닥에 모든 에멀젼을 침전시킵니다.
    알림: MOG35-55 에멀젼은 -20°C에서 며칠 동안 보관할 수 있습니다. 약물 실패를 피하려면 가능한 한 빨리 사용하는 것이 좋습니다.
  3. 22G 바늘을 1mL 주사기 배럴에 부착하고 MOG 35-55 에멀젼을 흡인하고 MOG35-55 에멀젼을 새 1mL 주사기 배럴에 옮깁니다. 1mL 주사기 배럴과 밀봉 필름이 있는 26G 바늘 사이의 연결을 고정합니다( 재료 표 참조).
    알림: MOG35-55 에멀젼을 1mL 시린지 배럴에 넣을 때 기포를 피하십시오.
  4. 주사 부위를 70 % 에탄올로 닦고 소독하십시오.
  5. MOG35-55 에멀젼을 마우스의 등쪽 척추의 양쪽에 피하 주사하고 각 측면에 100 μL를 주입합니다. 주입 작업이 완료된 후 생쥐의 등쪽 피부 아래에 구근 덩어리가 자동으로 형성되는 것을 관찰하십시오.
    알림: 숙련 된 실험자가 예방 접종 과정을 수행하고 마우스에 가해지는 압력을 최소화하기 위해 주사가 부드럽고 천천히 수행되는지 확인하십시오.
  6. 위의 마우스에 100μL의 PTX를 복강내 주사한다(단계 2).
    참고: 예방 접종일은 0일째입니다. 또한, 마우스의 꼬리에 색상 마커를 사용하는 것과 같은 후속 일일 평가를 위해 마우스를 정확하게 식별할 수 있는지 확인하십시오.
  7. 예방 접종 후 2 일째에 동일한 용량의 PTX를 주사하십시오.
  8. 면역화되지 않은 마우스 그룹을 야생형(WT) 마우스로 준비한다.

4. 마우스의 임상 모니터링

  1. EAE 및 WT 마우스의 체중을 매일 기록한다.
    참고 : EAE의 중증도는 마우스의 체중 감소와 양의 상관 관계가 있으므로 체중도 매우 중요한 모니터링 지표입니다.
  2. 표 1에 나열된 0-5 점수 시스템을 사용하여 예방 접종 후 0-21 일에서 마우스의 상태를 모니터링합니다.
    알림: 그 사이의 증상은 플러스 또는 마이너스 0.5점으로 계산됩니다.

5. 오픈 필드 테스트

참고: 이 단계를 위해 선택된 실험 동물은 초기 발병, 피크 및 관해 기간의 EAE 마우스입니다. 또한, WT 마우스를 대조군으로 사용하였다. 모든 마우스는 EAE 모델링을 위해 불안 장애를 갖는 마우스를 배제하기 위해 모델링 전에 불안-유사 행동에 대해 시험되었다는 것을 주목해야 한다. 또한, 완전한 운동 불능력을 갖는 피크 및 관해 기간의 EAE 마우스는 시험에서 제외되었다.

  1. 40 × 40 × 40cm3 오픈 필드 반응 챔버 및 운동 활동(open field) 비디오 분석 시스템을 준비한다( 재료 표 참조).
    알림: 카메라는 상자를 완전히 덮는 위치에 설치되고 반응실은 고르게 조명되며 테스트 룸은 조용한 영역이어야 합니다.
  2. 실험을 시작하기 1시간 전에 습관화를 위해 테스트 마우스를 시험실에 두십시오.
  3. 테스트를 시작하기 전에 전체 영역에 70% 에탄올을 뿌리고 깨끗한 종이 타월로 닦아 반응 챔버가 깨끗한지 확인합니다.
  4. 탐험을 시작하기 전에 케이지에서 각 마우스를 개별적으로 제거하고 경기장의 같은 구석에 놓습니다.
    참고: 상자의 하단은 16개의 그리드로 나뉘며, 그 중 중간 4개의 그리드 영역은 중앙 영역이고 주변 영역은 주변 영역입니다.
  5. 비디오 분석 시스템의 메뉴 표시줄에서 캡처 시작 버튼을 클릭하고 시간을 기록하고 촬영을 시작합니다.
  6. 시험실에서 조용히 하십시오.
  7. 녹음 과정에서 마우스를 5분 동안 자유롭게 움직이십시오.
  8. 획득 시스템을 중지하고 비디오를 저장합니다.
  9. 마우스를 경기장에서 꺼내 케이지에 다시 넣고 다음 마우스로 진행합니다.
    알림: 냄새 및 기타 물질을 제거하기 위해 실행 사이에 70% 에탄올로 테스트 영역을 청소하십시오.
  10. 비디오 분석 시스템을 사용하여 결과를 분석합니다.

6. 뼈 표현형 분석

  1. EAE 및 WT 마우스를 21일째에 자궁경부 탈구에 의해 안락사시킨다.
    알림: 자궁 경부 탈구 수술을 수행하는 직원은 동물이 죽는 동안 견뎌내는 통증을 최소화하도록 잘 훈련되어야합니다.
  2. 마우스를 해부 트레이에 평평하게 놓고 사지를 고정하십시오.
  3. 집게로 마우스 뒷다리 피부를 잡고 가위로 마우스 피부와 근육 조직을 엽니 다.
  4. 가위로 경골과 엉덩이 뼈에서 대퇴골을 조심스럽게 분리하십시오.
  5. 대퇴골에 부착 된 근육을 가위로 제거하고 대퇴골을 실온에서 70 % 에탄올에 넣습니다.
  6. 등방성 복셀 크기가 10μm이고 피크 X선 튜브 전압이 70kV이고 X선 강도가 0.114mA인 micro-CT 시스템( 재료 표 참조)을 사용하여 원위 대퇴골을 스캔합니다.
    참고: 3D 가우스 필터를 사용하면 2D 임계값 이미지의 노이즈를 제거할 수 있습니다.
  7. 중간 대퇴골에서 스캔한 100개의 슬라이스를 분석하여 뼈 부피, 조직 부피, 골밀도, 섬유주 분리, 섬유주 수, 섬유주 연결 밀도, 섬유주 및 피질 두께를 포함한 대퇴골 매개변수를 측정합니다.
    참고 : 마우스의 원위 대퇴골 성장판의 근위 끝에서 시작하여 골단 캡 구조가 전혀없는 절편이 발견되어 근위 대퇴골쪽으로 100 개의 슬라이스를 계속 확장했으며, 이는 골단 섬유주를 식별하기 위해 내부 피질 표면에서 몇 복셀에서 수동으로 윤곽이 그려진 윤곽이었습니다.
  8. micro-CT 시스템의 윤곽 영역에서 임계값 2D 이미지를 쌓아 3D 재구성을 생성합니다.

결과

마우스의 면역화 후, 마우스의 체중을 매일 기록하고, 이들의 임상 증상을 상기 기재된 프로토콜에 따라 평가한다 (단계 4). MOG 펩타이드로 면역화 된 C57BL / 6J 마우스에서 병변의 위치는 주로 척수에 국한되어 있기 때문에 EAE 마우스의 병인은 꼬리 끝에서 머리로 퍼집니다. 질병의 시작 부분에서 EAE 마우스는 꼬리의 약점과 처짐을 나타내며 뒷다리의 약점, 조정되지 않은 움직임 및 마비가 뒤 따른?...

토론

MS는 CNS의 탈수초성 염증성 질환이며 젊은 사람들에게 만성 장애를 유발하는 가장 흔한 신경 질환 중 하나이며가족과 사회에 큰 부담을 줍니다3,4. MS는 항상 기관-특이적 T 세포-매개 자가면역 질환으로 분류되어, 자가면역계가 CNS를 천천히 침식하도록 유도하며, 이는 몸 전체에 걸쳐 다수의 시스템을 수반할 것이다27. 전형적인 임상 증...

공개

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 말

저자는 중국 국립 자연 과학 재단 (32070768, 31871404, 31900658, 32270754)과 국가 약물 연구 핵심 연구소의 지원을 인정합니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL syringe(with 26 G needle)Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd60017031
2 mL microcentrifuge tubeHAIKELASIKY-LXG2A
22 G needleShanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd60017208
Complete Freund’s AdjuvantSigmaF5881Stored at 4 °C, 1 mg of heat-inactivated MTB (H37Ra) per mL
Conditioned place preference systemShanghai Jiliang Software Technology Co., LtdAnimal behavior
EthanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10009218Stored at RT
Locomotion activity (open field) video analysis systemShanghai Jiliang Software Technology Co., LtdDigBehv-002Animal behavior
MOG35-55 peptideGill Biochemical Co., LtdGLS-Y-M-03590Stored at -20 °C
Mycobacterium tuberculosis H37RaBD231141Stored at 4 °C
Open field reaction chamberShanghai Jiliang Software Technology Co., LtdAnimal behavior
Pertussis toxinCalbiochem516560Stored at 4 °C
Phosphate Buffered SalineMade in our laboratory
ScissorShanghai Medical Instrument (group) Co., LtdJ21010
Sealing filmHeathrow ScientificHS 234526B
Sorvall Legend Micro 21R MicrocentrifugeThermo Scientific75002447
Steel ballQIAGEN69975
TissueLyser IIQIAGEN85300
TweezerShanghai Medical Instrument (group) Co., LtdJD1060
μCT 35 desktop microCT scannerScanco Medical AG, Bassersdorf, Switzerland

참고문헌

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