Indução e Diversos Indicadores de Avaliação da Encefalomielite Autoimune Experimental

Resumo

O presente protocolo descreve a indução de encefalomielite autoimune experimental em um modelo de camundongo utilizando glicoproteína de oligodendrócitos de mielina e monitorando o processo da doença usando um sistema de pontuação clínica. Os sintomas experimentais relacionados à encefalomielite autoimune são analisados usando tomografia microcomputadorizada de fêmur de camundongo e teste de campo aberto para avaliar o processo da doença de forma abrangente.

Resumo

A esclerose múltipla (EM) é uma doença autoimune típica do sistema nervoso central (SNC) caracterizada por infiltração inflamatória, desmielinização e dano axonal. Atualmente, não há medidas para curar completamente a EM, mas várias terapias modificadoras da doença (DMT) estão disponíveis para controlar e mitigar a progressão da doença. Existem semelhanças significativas entre as características patológicas do SNC da encefalomielite autoimune experimental (EAE) e pacientes com EM. O EAE tem sido amplamente utilizado como um modelo representativo para determinar a eficácia dos medicamentos para EM e explorar o desenvolvimento de novas terapias para a doença da EM. A indução ativa de EAE em camundongos tem um efeito estável e reprodutível e é particularmente adequada para estudar os efeitos de drogas ou genes na neuroinflamação autoimune. O método de imunização de camundongos C57BL/6J com glicoproteína de oligodendrócitos de mielina (MOG_35-55) e a avaliação diária dos sintomas da doença usando um sistema de pontuação clínica são compartilhados principalmente. Dada a complexa etiologia da SM com diversas manifestações clínicas, o sistema de pontuação clínica existente não pode satisfazer a avaliação do tratamento da doença. Para evitar as deficiências de uma única intervenção, novos indicadores para avaliar EAE com base nas manifestações clínicas de humor semelhante à ansiedade e osteoporose em pacientes com EM são criados para fornecer uma avaliação mais abrangente do tratamento da EM.

Introdução

As doenças autoimunes são um espectro de distúrbios causados pela resposta imune do sistema imunológico aos seus próprios antígenos, resultando em danos ou disfunção tecidual¹. A esclerose múltipla (EM) é uma doença autoimune crônica de polineuropatia no sistema nervoso central (SNC), caracterizada por infiltração inflamatória, desmielinização e degeneração axonal neuronal ^2,3. Atualmente, a EM afetou até 2,5 milhões de pessoas em todo o mundo, principalmente jovens e pessoas de meia-idade com idades entre 20 e 40 anos, que são muitas vezes a espinha dorsal de suas famílias e da sociedade. Isso tem causado considerável impacto e danos às famílias e à sociedade ^2,4.

A SM é uma doença multifatorial com manifestações clínicas diversas e complexas. Além dos distúrbios neurológicos clássicos caracterizados por infiltração inflamatória e desmielinização, a SM frequentemente apresenta deficiência visual, discinesia de membros e distúrbios cognitivos e emocionais ^5,6,7. Se os pacientes com EM não receberem o tratamento adequado e correto, metade deles viverá em cadeiras de rodas após 20 anos, e quase metade deles experimentará sintomas depressivos e de ansiedade, levando a níveis muito mais elevados de ideação suicida do que a população em geral ^8,9.

Apesar de um longo período de pesquisa, a etiologia da EM permanece indescritível, e a patogênese da EM ainda não foi elucidada. Modelos animais de EM permitiram servir como ferramentas de teste para explorar o desenvolvimento de doenças e novas abordagens terapêuticas, apesar das diferenças significativas entre os sistemas imunológico de roedores e humanos, ao mesmo tempo em que compartilhavam alguns princípios básicos. A encefalomielite autoimune experimental (EAE) é atualmente o modelo animal ideal para o estudo da EM, que usa a imunidade de autoantígenos das proteínas da mielina para induzir a autoimunidade aos componentes do SNC em camundongos suscetíveis, com a adição de adjuvante de Freund completo (CFA) e toxina pertussis (PTX) para melhorar a resposta imune humoral. Dependendo do contexto genético e dos antígenos imunológicos, diferentes processos patológicos, incluindo agudos, remitentes-recorrentes ou crônicos, são obtidos para mimetizar várias formas clínicas de SM^10,11,12. Os imunógenos relevantes comumente usados na construção de modelos EAE vêm de proteínas do auto-SNC, como a proteína básica de mielina (MBP), a proteína proteolipídica (PLP) ou a glicoproteína de oligodendrócitos de mielina (MOG). Camundongos SJL/L imunizados com MBP ou PLP desenvolvem um curso remitente-recorrente, e o MOG desencadeia EAE crônica progressiva em camundongos C57BL/6^11,12,13.

O principal objetivo da terapia modificadora da doença (DMT) é minimizar os sintomas da doença e melhorar a função⁶. Várias drogas são usadas clinicamente para aliviar a EM, mas nenhuma droga ainda foi usada para curá-la completamente, revelando a necessidade de tratamento sinérgico. Os camundongos C57BL/6 são atualmente os mais comumente utilizados para a construção de camundongos transgênicos e, neste trabalho, um modelo EAE induzido pelo MOG_35-55 em camundongos C57BL/6J com uma escala de 5 pontos foi usado para monitorar a progressão da doença. Os modelos EAE também sofrem de humor semelhante à ansiedade e perda óssea, e as lesões desmielinizantes amplamente conhecidas. Aqui, o método para avaliar os sintomas de EAE a partir de múltiplas perspectivas usando teste de campo aberto e análise de tomografia micro-computadorizada (Micro-CT) também é descrito.

Protocolo

O Comitê de Cuidados com os Animais da Universidade de Tongji aprovou o presente trabalho, e todas as diretrizes de cuidados com os animais foram seguidas. Camundongos C57BL/6J machos ou fêmeas entre 8-12 semanas de idade foram utilizados para os experimentos. Garantiu-se que a idade e o sexo fossem os mesmos nos grupos experimentais; caso contrário, a suscetibilidade à doença foi afetada. Os camundongos foram alojados em um ambiente específico livre de patógenos com ciclos alternados de 12 h de luz e escuridão sob condições constantes (temperatura ambiente de 23 ± 1 °C, umidade de 50% ± 10%), com livre acesso a alimentos e água de camundongos.

1. Preparação da emulsão MOG_35-55

1. Adicionar o Mycobacterium tuberculosis liofilizado inativado pelo calor (MTB, H37Ra) para completar o adjuvante de Freund (ele próprio contendo 1 mg/mL de MTB inativado pelo calor, H37Ra), resultando em uma concentração final de MTB de 5 mg/mL (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: Toda a operação deve ser concluída no gabinete de biossegurança; não abra o ar soprando.
2. Dissolva o peptídeo MOG_35-55 liofilizado (ver Tabela de Materiais) com solução salina tamponada com fosfato (PBS) estéril pré-resfriado (sem íons cálcio e magnésio, pH 7,4) para preparar a solução antigênica na concentração de 2 mg/mL.
3. Pegue um tubo de microcentrífuga limpo de 2 mL e adicione uma esfera de aço esterilizada de 5 mm (consulte Tabela de Materiais) a cada tubo.
4. Adicionar 500 μL de adjuvante completo de Freund contendo 5 mg/mL de MTB e 500 μL de solução antigênica MOG_35-55 ao tubo de microcentrífuga acima contendo uma esfera de aço.
5. Oscile o tubo acima em um TissueLyser (ver Tabela de Materiais) por 10 min, esfrie no gelo por 10 min e repita quatro vezes para misturá-lo bem e, finalmente, formar uma solução viscosa branca.
   NOTA: Uma boa emulsificação é um passo fundamental na preparação da emulsão MOG_35-55 , por isso é necessária uma mistura completa. O TissueLyser é ajustado para uma velocidade de 28 Hz.

2. Preparação da toxina pertussis (PTX)

1. Preparar a PTX com ddH₂O numa concentração de 100 μg/ml e conservar a 4 °C.
2. Diluir a solução-mãe de PTX 50 vezes com PBS estéril 1x (sem iões de cálcio e magnésio, pH 7,4) para obter uma solução de 200 ng/100 μL para utilização.

3. Estabelecimento do modelo animal EAE

1. Construa o modelo EAE usando os camundongos C57BL/6J machos ou fêmeas de 8 a 12 semanas de idade. Certifique-se de que os ratos estejam adequadamente aclimatados ao ambiente de alimentação antes da imunização.
2. Centrifugar a emulsão MOG_35-55 preparada (passo 1) a 4 °C durante 2-3 s premindo o botão Pulso do equipamento (ver Tabela de Materiais) para precipitar todas as emulsões no fundo do tubo.
   NOTA: A emulsão MOG_35-55 pode ser armazenada a -20 °C durante vários dias. Para evitar a falha do medicamento, recomenda-se usá-lo o mais rápido possível.
3. Ligue uma agulha de 22 G a um tambor de seringa de 1 ml, aspirar a emulsão MOG 35-55 e transferir a emulsão MOG_35-55 para um novo tambor de seringa de 1 ml. Fixe a ligação entre o tambor da seringa de 1 ml e uma agulha de 26 G com película de vedação (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: Evite bolhas de ar ao carregar a emulsão MOG_35-55 em barris de seringa de 1 mL.
4. Limpe e desinfete o local de injeção com etanol a 70%.
5. Injete a emulsão MOG_35-55 por via subcutânea em cada lado da coluna dorsal dos camundongos, 100 μL de cada lado. Observe a formação automática de massas bulbosas sob a pele do dorso dos ratos após a conclusão da operação de injeção.
   NOTA: Certifique-se de que experimentadores experientes realizem o processo de imunização e que a injeção seja feita de forma suave e lenta para minimizar a pressão sobre os camundongos.
6. Injete os ratos acima por via intraperitoneal com 100 μL de PTX (passo 2).
   NOTA: O dia da imunização é o dia 0. Além disso, certifique-se de que os ratos possam ser identificados com precisão para avaliação diária subsequente, como o uso de um marcador de cor na cauda dos camundongos.
7. Injete a mesma dose de PTX no dia 2 após a imunização.
8. Prepare um grupo de camundongos não imunizados como camundongos do tipo selvagem (WT).

4. Monitorização clínica de ratinhos

1. Registre o peso corporal de camundongos EAE e WT diariamente.
   NOTA: A gravidade do EAE está positivamente correlacionada com a perda de peso dos ratos, de modo que o peso corporal também é um índice de monitoramento muito importante.
2. Monitore o status dos camundongos de 0 a 21 dias após a imunização usando o sistema de pontuação 0 a 5 listado na Tabela 1.
   NOTA: Os sintomas intermediários são contados como mais ou menos 0,5 pontos.

5. Teste de campo aberto

NOTA: Os animais experimentais selecionados para esta etapa são camundongos EAE nos períodos de início precoce, pico e remissão. Além disso, camundongos WT foram utilizados como controle. Deve-se notar que todos os ratos foram testados para o comportamento semelhante à ansiedade antes da modelagem para excluir ratos com transtornos de ansiedade para modelagem EAE. Além disso, camundongos EAE em períodos de pico e remissão com incapacidade motora completa foram excluídos do teste.

1. Prepare uma câmara de reação de campo aberto de 40 × 40 × 40 cm³ e um sistema de análise de vídeo de atividade de locomoção (campo aberto) (consulte Tabela de Materiais).
   NOTA: A câmera é instalada em uma posição que cobre completamente a caixa, a sala de reação é uniformemente iluminada e a sala de teste deve ser uma área silenciosa.
2. Coloque os ratos de teste na sala de teste para habituação 1 h antes de iniciar o experimento.
3. Pulverize toda a área com etanol a 70% e limpe com uma toalha de papel limpa para garantir que a câmara de reação esteja limpa antes de iniciar o teste.
4. Remova cada mouse individualmente de sua gaiola e coloque-o no mesmo canto da arena antes de começar a explorar.
   NOTA: A parte inferior da caixa é dividida em 16 grades, das quais a área das quatro grades do meio é a área central e a área circundante é a área periférica.
5. Clique no botão Iniciar captura na barra de menus do sistema de análise de vídeo, registre o tempo e comece a fotografar.
6. Mantenha-se quieto na sala de testes.
7. Deixe o mouse se mover livremente por 5 minutos durante o processo de gravação.
8. Pare o sistema de aquisição e salve o vídeo.
9. Tire o mouse da arena, coloque-o de volta na gaiola e prossiga para o próximo mouse.
   NOTA: Limpe a área de teste com etanol a 70% entre as corridas para remover odores e outras substâncias.
10. Analise os resultados usando o sistema de análise de vídeo.

6. Análise do fenótipo ósseo

1. Eutanasiar os camundongos EAE e WT por luxação cervical no 21º dia.
   NOTA: O pessoal que realiza operações de luxação cervical deve ser bem treinado para minimizar a dor sofrida durante a morte do animal.
2. Faça o rato deitado em uma bandeja de dissecação e fixe as extremidades.
3. Segure a pele do membro posterior do rato com fórceps e abra a pele do rato e o tecido muscular com uma tesoura.
4. Separe o fêmur da tíbia e do osso do quadril cuidadosamente com uma tesoura.
5. Remova o músculo aderente ao fêmur com uma tesoura e coloque o fêmur em etanol a 70% à temperatura ambiente.
6. Escaneie o fêmur distal usando um sistema de micro-TC (ver Tabela de Materiais) com um tamanho de voxel isotrópico de 10 μm, com uma tensão de pico do tubo de raios-X de 70 kV e uma intensidade de raios-X de 0,114 mA.
   NOTA: Um filtro Gaussiano 3D permite a denoising de imagens de limiar 2D.
7. Analise os 100 cortes escaneados da diáfise femoral média para medir os parâmetros do fêmur, incluindo volume ósseo, volume tecidual, densidade mineral óssea, separação trabecular, número trabecular, densidade de conexão trabecular e espessura trabecular e cortical.
   NOTA: A partir da extremidade proximal da placa distal de crescimento do fêmur em camundongos, seções completamente desprovidas de estruturas da tampa epifisária foram encontradas e continuaram a estender 100 cortes em direção ao fêmur proximal, que foram contornos manualmente delineados em vários voxels longe da superfície cortical interna para identificar trabéculas epifisárias.
8. Crie as reconstruções 3D empilhando imagens 2D de limiar de regiões de contorno no sistema de micro-CT.

Resultados

Após a imunização dos camundongos, o peso corporal dos camundongos é registrado diariamente, e seus sintomas clínicos são avaliados de acordo com o protocolo descrito acima (etapa 4). Em camundongos C57BL / 6J imunizados com peptídeo MOG, porque a localização da lesão está confinada principalmente à medula espinhal, a patogênese dos camundongos EAE se espalha da extremidade da cauda até a cabeça. No início da doença, os camundongos EAE exibem fraqueza e queda da cauda, seguidos por fraqueza dos membros p...

Discussão

A SM é uma doença inflamatória desmielinizante do SNC e é um dos distúrbios neurológicos mais comuns causadores de incapacidade crônica em jovens, impondo um enorme fardo às famílias e à sociedade ^3,4. A SM sempre foi classificada como uma doença autoimune mediada por células T específicas de órgãos, induzindo o sistema autoimune a corroer lentamente o SNC, o que envolverá múltiplos sistemas em todo o corpo²⁷. Os sintomas ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe(with 26 G needle)	Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd	60017031
2 mL microcentrifuge tube	HAIKELASI	KY-LXG2A
22 G needle	Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd	60017208
Complete Freund’s Adjuvant	Sigma	F5881	Stored at 4 °C, 1 mg of heat-inactivated MTB (H37Ra) per mL
Conditioned place preference system	Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd		Animal behavior
Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10009218	Stored at RT
Locomotion activity (open field) video analysis system	Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd	DigBehv-002	Animal behavior
MOG35-55 peptide	Gill Biochemical Co., Ltd	GLS-Y-M-03590	Stored at -20 °C
Mycobacterium tuberculosis H37Ra	BD	231141	Stored at 4 °C
Open field reaction chamber	Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd		Animal behavior
Pertussis toxin	Calbiochem	516560	Stored at 4 °C
Phosphate Buffered Saline			Made in our laboratory
Scissor	Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd	J21010
Sealing film	Heathrow Scientific	HS 234526B
Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge	Thermo Scientific	75002447
Steel ball	QIAGEN	69975
TissueLyser II	QIAGEN	85300
Tweezer	Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd	JD1060
μCT 35 desktop microCT scanner	Scanco Medical AG, Bassersdorf, Switzerland