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  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Induktion einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis in einem Mausmodell unter Verwendung von Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein und die Überwachung des Krankheitsprozesses mit einem klinischen Scoring-System. Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis-bezogene Symptome werden mittels Mausfemur-Mikro-Computertomographie und Freilandtest analysiert, um den Krankheitsprozess umfassend zu beurteilen.

Zusammenfassung

Multiple Sklerose (MS) ist eine typische Autoimmunerkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS), die durch entzündliche Infiltration, Demyelinisierung und axonale Schäden gekennzeichnet ist. Derzeit gibt es keine Maßnahmen, um MS vollständig zu heilen, aber mehrere krankheitsmodifizierende Therapien (DMT) sind verfügbar, um das Fortschreiten der Krankheit zu kontrollieren und zu mildern. Es gibt signifikante Ähnlichkeiten zwischen den pathologischen Merkmalen des ZNS der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) und MS-Patienten. EAE wurde häufig als repräsentatives Modell verwendet, um die Wirksamkeit von MS-Medikamenten zu bestimmen und die Entwicklung neuer Therapien für MS-Erkrankungen zu untersuchen. Die aktive Induktion von EAE bei Mäusen hat eine stabile und reproduzierbare Wirkung und eignet sich besonders für die Untersuchung der Auswirkungen von Medikamenten oder Genen auf autoimmune Neuroinflammation. Die Methode der Immunisierung von C57BL/6J-Mäusen mit Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG35-55) und die tägliche Beurteilung der Krankheitssymptome mittels eines klinischen Scoring-Systems wird hauptsächlich geteilt. Angesichts der komplexen Ätiologie der MS mit verschiedenen klinischen Manifestationen kann das bestehende klinische Bewertungssystem die Bewertung der Krankheitsbehandlung nicht erfüllen. Um die Mängel einer einzelnen Intervention zu vermeiden, werden neue Indikatoren zur Beurteilung der EAE basierend auf klinischen Manifestationen von angstähnlichen Stimmungen und Osteoporose bei MS-Patienten erstellt, um eine umfassendere Bewertung der MS-Behandlung zu ermöglichen.

Einleitung

Autoimmunerkrankungen sind ein Spektrum von Erkrankungen, die durch die Immunantwort des Immunsystems auf seine eigenen Antigene verursacht werden, was zu Gewebeschäden oder Funktionsstörungen führt1. Multiple Sklerose (MS) ist eine chronische Autoimmunerkrankung der Polyneuropathie im zentralen Nervensystem (ZNS), gekennzeichnet durch entzündliche Infiltration, Demyelinisierung und neuronale axonale Degeneration 2,3. Derzeit sind weltweit bis zu 2,5 Millionen Menschen von MS betroffen, vor allem junge und Menschen mittleren Alters im Alter von 20 bis 40 Jahren, die oft das Rückgrat ihrer Familien und der Gesellschaft bilden. Dies hat erhebliche Auswirkungen und Schäden für Familien und die Gesellschaft verursacht 2,4.

MS ist eine multifaktorielle Erkrankung mit vielfältigen und komplexen klinischen Manifestationen. Neben klassischen neurologischen Erkrankungen, die durch entzündliche Infiltration und Demyelinisierung gekennzeichnet sind, zeigt MS häufig Sehstörungen, Gliedmaßendyskinesie sowie kognitive und emotionale Störungen 5,6,7. Wenn MS-Patienten nicht die richtige und korrekte Behandlung erhalten, wird die Hälfte von ihnen nach 20 Jahren im Rollstuhl leben, und fast die Hälfte von ihnen wird depressive und Angstsymptome haben, was zu einem viel höheren Maß an Suizidgedanken führt als die Allgemeinbevölkerung 8,9.

Trotz einer langen Forschungszeit bleibt die Ätiologie der MS schwer fassbar, und die Pathogenese der MS ist noch nicht aufgeklärt. Tiermodelle von MS haben es ermöglicht, als Testwerkzeuge zu dienen, um die Krankheitsentwicklung und neue therapeutische Ansätze zu erforschen, trotz der signifikanten Unterschiede zwischen dem Nagetier- und dem menschlichen Immunsystem, während gleichzeitig einige Grundprinzipien geteilt werden. Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist derzeit das ideale Tiermodell für die Untersuchung von MS, das Autoantigen-Immunität von Myelinproteinen verwendet, um Autoimmunität gegen ZNS-Komponenten in anfälligen Mäusen zu induzieren, mit dem Zusatz von vollständigem Freund-Adjuvans (CFA) und Keuchhustentoxin (PTX), um die humorale Immunantwort zu verstärken. Abhängig vom genetischen Hintergrund und den Immunantigenen werden verschiedene Krankheitsprozesse, einschließlich akuter, schubförmig-remittierender oder chronischer, erhalten, um verschiedene klinische Formen von MS10,11,12 nachzuahmen. Die relevanten Immunogene, die üblicherweise bei der Konstruktion von EAE-Modellen verwendet werden, stammen aus Selbst-ZNS-Proteinen wie Myelin-Basisprotein (MBP), Proteolipidprotein (PLP) oder Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG). MBP- oder PLP-immunisierte SJL/L-Mäuse entwickeln einen schubförmig-remittierenden Verlauf, und MOG löst chronisch progrediente EAE bei C57BL/6-Mäusenaus 11,12,13.

Der Hauptzweck der krankheitsmodifizierenden Therapie (DMT) besteht darin, Krankheitssymptome zu minimieren und die Funktion zu verbessern6. Mehrere Medikamente werden klinisch zur Linderung von MS eingesetzt, aber noch wurde kein Medikament verwendet, um es vollständig zu heilen, was die Notwendigkeit einer synergistischen Behandlung aufzeigt. C57BL / 6-Mäuse werden derzeit am häufigsten verwendet, um transgene Mäuse zu konstruieren, und in dieser Arbeit wurde ein EAE-Modell, das durch MOG35-55 in C57BL / 6J-Mäusen mit einer 5-Punkte-Skala induziert wurde, verwendet, um das Fortschreiten der Krankheit zu überwachen. EAE-Modelle leiden auch unter angstähnlichen Stimmungen und Knochenschwund sowie den weithin bekannten demyelinisierenden Läsionen. Hier wird auch die Methode beschrieben, die Symptome der EAE aus mehreren Perspektiven mittels Freifeldtest und Mikro-Computertomographie (Mikro-CT) zu beurteilen.

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Protokoll

Das Tierpflegekomitee der Tongji-Universität genehmigte die vorliegende Arbeit und alle Richtlinien für die Tierpflege wurden befolgt. Für die Experimente wurden männliche oder weibliche C57BL/6J-Mäuse im Alter zwischen 8 und 12 Wochen verwendet. Es wurde sichergestellt, dass Alter und Geschlecht in den Versuchsgruppen gleich waren; Andernfalls war die Anfälligkeit für die Krankheit beeinträchtigt. Die Mäuse wurden in einer spezifischen pathogenfreien Umgebung mit abwechselnden 12 h Hell- und Dunkelzyklen unter konstanten Bedingungen (Raumtemperatur 23 ± 1 °C, Luftfeuchtigkeit 50% ± 10%) mit freiem Zugang zu Mausfutter und Wasser untergebracht.

1. Herstellung der MOG35-55 Emulsion

  1. Fügen Sie das hitzeinaktivierte lyophilisierte Mycobacterium tuberculosis (MTB, H37Ra) hinzu, um das Freund-Adjuvans (das selbst 1 mg/ml wärmeinaktiviertes MTB H37Ra enthält) zu vervollständigen, was zu einer endgültigen MTB-Konzentration von 5 mg/ml führt (siehe Materialtabelle).
    HINWEIS: Der gesamte Vorgang muss in der Biosicherheitswerkbank abgeschlossen werden. Öffnen Sie die Blasluft nicht.
  2. Das lyophilisierte MOG35-55-Peptid (siehe Materialtabelle) wird mit steriler vorgekühlter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (ohne Calcium- und Magnesiumionen, pH 7,4) gelöst, um die Antigenlösung in einer Konzentration von 2 mg/ml herzustellen.
  3. Nehmen Sie ein sauberes 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie jedem Röhrchen eine sterilisierte 5-mm-Stahlkugel (siehe Materialtabelle) hinzu.
  4. Das obige Mikrozentrifugenröhrchen, das eine Stahlkugel enthält, werden 500 μL komplettes Freund-Adjuvans mit 5 mg/ml MTB und 500 μL MOG35-55-Antigenlösung in das obige Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Stahlkugel gegeben.
  5. Das obige Röhrchen auf einem TissueLyser (siehe Materialtabelle) für 10 min oszillieren, 10 min auf Eis abkühlen lassen und viermal wiederholen, um es gut zu mischen und schließlich eine weiße viskose Lösung zu bilden.
    HINWEIS: Eine gute Emulgierung ist ein wichtiger Schritt bei der Herstellung der MOG35-55-Emulsion , daher ist ein gründliches Mischen erforderlich. Der TissueLyser ist auf eine Geschwindigkeit von 28 Hz eingestellt.

2. Herstellung von Keuchhustentoxin (PTX)

  1. PTX mitddH2Oin eine Konzentration von 100 μg/ml aufbereiten und bei 4 °C lagern.
  2. Die PTX-Stammlösung wird 50-mal mit sterilem 1x PBS (ohne Calcium- und Magnesiumionen, pH 7,4) verdünnt, um eine 200 ng/100 μL Lösung herzustellen.

3. Etablierung des EAE-Tiermodells

  1. Konstruieren Sie das EAE-Modell mit den 8-12 Wochen alten männlichen oder weiblichen C57BL/6J-Mäusen. Stellen Sie sicher, dass die Mäuse vor der Immunisierung ausreichend an die Futterumgebung gewöhnt sind.
  2. Zentrifugieren Sie die vorbereitete MOG35-55-Emulsion (Schritt 1) bei 4 °C für 2-3 s, indem Sie die Impulstaste des Geräts (siehe Materialtabelle) drücken, um alle Emulsionen am Boden des Röhrchens auszufällen.
    HINWEIS: MOG35-55 Emulsion kann mehrere Tage bei -20 °C gelagert werden. Um ein Versagen des Arzneimittels zu vermeiden, wird empfohlen, es so schnell wie möglich zu verwenden.
  3. Befestigen Sie eine 22-G-Nadel an einem 1-ml-Spritzenzylinder, saugen Sie die MOG 35-55-Emulsion ab und geben Sie die MOG35-55-Emulsion in einen neuen 1-ml-Spritzenzylinder. Sichern Sie die Verbindung zwischen dem 1-ml-Spritzenzylinder und einer 26-G-Nadel mit Siegelfolie (siehe Materialtabelle).
    HINWEIS: Vermeiden Sie Luftblasen, wenn Sie die MOG35-55-Emulsion in 1-ml-Spritzenzylinder laden.
  4. Wischen und desinfizieren Sie die Injektionsstelle mit 70% Ethanol.
  5. Injizieren Sie die MOG35-55-Emulsion subkutan auf jede Seite der Rückenwirbelsäule der Mäuse, 100 μL auf jeder Seite. Beobachten Sie die automatische Bildung von bauchigen Massen unter der Haut des Rückens der Mäuse nach Abschluss des Injektionsvorgangs.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass erfahrene Experimentatoren den Immunisierungsprozess durchführen und dass die Injektion sanft und langsam durchgeführt wird, um den Druck auf Mäuse zu minimieren.
  6. Injizieren Sie die oben genannten Mäuse intraperitoneal mit 100 μL PTX (Schritt 2).
    HINWEIS: Der Tag der Immunisierung ist Tag 0. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Mäuse für die anschließende tägliche Auswertung genau identifiziert werden können, z. B. mit einem Farbmarker am Schwanz der Mäuse.
  7. Injizieren Sie die gleiche Dosis PTX am Tag 2 nach der Immunisierung.
  8. Bereiten Sie eine Gruppe nicht immunisierter Mäuse als Wildtyp-Mäuse (WT) vor.

4. Klinische Überwachung von Mäusen

  1. Zeichnen Sie täglich das Körpergewicht von EAE- und WT-Mäusen auf.
    HINWEIS: Der Schweregrad der EAE korreliert positiv mit dem Gewichtsverlust von Mäusen, so dass das Körpergewicht auch ein sehr wichtiger Überwachungsindex ist.
  2. Überwachen Sie den Status von Mäusen 0-21 Tage nach der Immunisierung mit dem in Tabelle 1 aufgeführten 0-5-Bewertungssystem.
    HINWEIS: Symptome dazwischen werden mit plus oder minus 0,5 Punkten gezählt.

5. Freilandtest

HINWEIS: Die für diesen Schritt ausgewählten Versuchstiere sind EAE-Mäuse in den frühen Beginn-, Spitzen- und Remissionsphasen. Zusätzlich wurden WT-Mäuse als Kontrolle verwendet. Es ist zu beachten, dass alle Mäuse vor der Modellierung auf angstähnliches Verhalten getestet wurden, um Mäuse mit Angststörungen für die EAE-Modellierung auszuschließen. Darüber hinaus wurden EAE-Mäuse in Spitzen- und Remissionszeiten mit vollständiger motorischer Unfähigkeit vom Test ausgeschlossen.

  1. Bereiten Sie eine 40 × 40 × 40 cm3 offene Reaktionskammer und ein Fortbewegungsaktivitäts-Videoanalysesystem (offenes Feld) vor (siehe Materialtabelle).
    HINWEIS: Die Kamera wird in einer Position installiert, die die Box vollständig abdeckt, der Reaktionsraum ist gleichmäßig beleuchtet und der Testraum muss ein ruhiger Bereich sein.
  2. Stellen Sie die Testmäuse 1 h vor Beginn des Experiments zur Gewöhnung in den Testraum.
  3. Besprühen Sie den gesamten Bereich mit 70% Ethanol und wischen Sie ihn mit einem sauberen Papiertuch ab, um sicherzustellen, dass die Reaktionskammer sauber ist, bevor Sie mit dem Test beginnen.
  4. Entferne jede Maus einzeln aus ihrem Käfig und platziere sie in derselben Ecke der Arena, bevor du mit der Erkundung beginnst.
    HINWEIS: Der Boden der Box ist in 16 Raster unterteilt, von denen der mittlere vier Rasterbereich der zentrale Bereich und die Umgebung der Randbereich ist.
  5. Klicken Sie in der Menüleiste des Videoanalysesystems auf die Schaltfläche Aufnahme starten , nehmen Sie die Zeit auf und beginnen Sie mit der Aufnahme.
  6. Schweigen Sie im Testraum.
  7. Lassen Sie die Maus während des Aufnahmevorgangs 5 Minuten lang frei bewegen.
  8. Stoppen Sie das Erfassungssystem und speichern Sie das Video.
  9. Nimm die Maus aus der Arena, lege sie zurück in den Käfig und fahre mit der nächsten Maus fort.
    HINWEIS: Reinigen Sie den Testbereich zwischen den Läufen mit 70% Ethanol, um Gerüche und andere Substanzen zu entfernen.
  10. Analysieren Sie die Ergebnisse mit dem Videoanalysesystem.

6. Analyse des Knochenphänotyps

  1. Euthanasieren Sie die EAE- und WT-Mäuse am 21. Tag durch zervikale Dislokation.
    HINWEIS: Personal, das zervikale Dislokationsoperationen durchführt, muss gut ausgebildet sein, um die Schmerzen während des Todes des Tieres zu minimieren.
  2. Lassen Sie die Maus flach in einer Sezierschale liegen und fixieren Sie die Extremitäten.
  3. Halten Sie die Hintergliedhaut der Maus mit einer Pinzette und öffnen Sie die Maushaut und das Muskelgewebe mit einer Schere.
  4. Trennen Sie den Femur vorsichtig mit einer Schere von Tibia und Hüftknochen.
  5. Entfernen Sie den am Oberschenkelknochen haftenden Muskel mit einer Schere und legen Sie den Femur in 70% Ethanol bei Raumtemperatur.
  6. Scannen Sie den distalen Femur mit einem Mikro-CT-System (siehe Materialtabelle) mit einer isotropen Voxelgröße von 10 μm, einer Röntgenspitzenröhrenspannung von 70 kV und einer Röntgenintensität von 0,114 mA.
    HINWEIS: Ein 3D-Gaußfilter ermöglicht das Entrauschen von 2D-Schwellenwertbildern.
  7. Analysieren Sie die 100 Schnitte, die vom mittleren Femurschaft gescannt wurden, um Femurparameter zu messen, einschließlich Knochenvolumen, Gewebevolumen, Knochenmineraldichte, trabekuläre Trennung, trabekuläre Anzahl, trabekuläre Verbindungsdichte und trabekuläre und kortikale Dicke.
    HINWEIS: Ausgehend vom proximalen Ende der distalen Femurwachstumsplatte bei Mäusen wurden Abschnitte gefunden, die völlig frei von epiphysären Kappenstrukturen waren und sich weiterhin 100 Scheiben in Richtung des proximalen Femurs erstreckten, die manuell umrissene Konturen an mehreren Voxeln von der inneren kortikalen Oberfläche entfernt waren, um epiphysäre Trabekeln zu identifizieren.
  8. Erstellen Sie die 3D-Rekonstruktionen, indem Sie Schwellen-2D-Bilder aus Konturbereichen im Mikro-CT-System stapeln.

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Ergebnisse

Nach der Immunisierung der Mäuse wird das Körpergewicht der Mäuse täglich aufgezeichnet und ihre klinischen Symptome werden gemäß dem oben beschriebenen Protokoll (Schritt 4) bewertet. Bei C57BL / 6J-Mäusen, die mit MOG-Peptid immunisiert wurden, breitet sich die Pathogenese der EAE-Mäuse vom Schwanzende bis zum Kopf aus, da die Läsion hauptsächlich auf das Rückenmark beschränkt ist. Zu Beginn der Krankheit zeigen EAE-Mäuse Schwäche und Herabhängen des Schwanzes, gefolgt von Schwäche der Hintergliedmaßen...

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Diskussion

MS ist eine demyelinisierende entzündliche Erkrankung des ZNS und eine der häufigsten neurologischen Erkrankungen, die bei jungen Menschen chronische Behinderungen verursachen und Familien und Gesellschaft enorm belasten 3,4. MS wurde schon immer als organspezifische T-Zell-vermittelte Autoimmunerkrankung klassifiziert, die das Autoimmunsystem dazu veranlasst, das ZNS langsam zu erodieren, was mehrere Systeme im ganzen Körper betrifft27...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Die Autoren würdigen die Unterstützung durch die National Natural Science Foundation of China (32070768, 31871404, 31900658, 32270754) und das State Key Laboratory of Drug Research.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL syringe(with 26 G needle)Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd60017031
2 mL microcentrifuge tubeHAIKELASIKY-LXG2A
22 G needleShanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd60017208
Complete Freund’s AdjuvantSigmaF5881Stored at 4 °C, 1 mg of heat-inactivated MTB (H37Ra) per mL
Conditioned place preference systemShanghai Jiliang Software Technology Co., LtdAnimal behavior
EthanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10009218Stored at RT
Locomotion activity (open field) video analysis systemShanghai Jiliang Software Technology Co., LtdDigBehv-002Animal behavior
MOG35-55 peptideGill Biochemical Co., LtdGLS-Y-M-03590Stored at -20 °C
Mycobacterium tuberculosis H37RaBD231141Stored at 4 °C
Open field reaction chamberShanghai Jiliang Software Technology Co., LtdAnimal behavior
Pertussis toxinCalbiochem516560Stored at 4 °C
Phosphate Buffered SalineMade in our laboratory
ScissorShanghai Medical Instrument (group) Co., LtdJ21010
Sealing filmHeathrow ScientificHS 234526B
Sorvall Legend Micro 21R MicrocentrifugeThermo Scientific75002447
Steel ballQIAGEN69975
TissueLyser IIQIAGEN85300
TweezerShanghai Medical Instrument (group) Co., LtdJD1060
μCT 35 desktop microCT scannerScanco Medical AG, Bassersdorf, Switzerland

Referenzen

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