Induzione e diversi indicatori di valutazione dell'encefalomielite autoimmune sperimentale

Riepilogo

Il presente protocollo descrive l'induzione dell'encefalomielite autoimmune sperimentale in un modello murino utilizzando glicoproteina oligodendrocitaria mielinica e monitorando il processo della malattia utilizzando un sistema di punteggio clinico. I sintomi sperimentali correlati all'encefalomielite autoimmune vengono analizzati utilizzando l'analisi della tomografia microcomputerizzata del femore di topo e il test in campo aperto per valutare il processo della malattia in modo completo.

Abstract

La sclerosi multipla (SM) è una tipica malattia autoimmune del sistema nervoso centrale (SNC) caratterizzata da infiltrazione infiammatoria, demielinizzazione e danno assonale. Attualmente, non ci sono misure per curare completamente la SM, ma sono disponibili più terapie modificanti la malattia (DMT) per controllare e mitigare la progressione della malattia. Esistono somiglianze significative tra le caratteristiche patologiche del SNC dell'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) e dei pazienti con SM. L'EAE è stato ampiamente utilizzato come modello rappresentativo per determinare l'efficacia dei farmaci per la SM ed esplorare lo sviluppo di nuove terapie per la malattia della SM. L'induzione attiva di EAE nei topi ha un effetto stabile e riproducibile ed è particolarmente indicata per studiare gli effetti di farmaci o geni sulla neuroinfiammazione autoimmune. Il metodo di immunizzazione dei topi C57BL/6J con glicoproteina oligodendrocitaria mielinica (MOG_35-55) e la valutazione giornaliera dei sintomi della malattia utilizzando un sistema di punteggio clinico è principalmente condiviso. Data la complessa eziologia della SM con diverse manifestazioni cliniche, il sistema di punteggio clinico esistente non può soddisfare la valutazione del trattamento della malattia. Per evitare le carenze di un singolo intervento, vengono creati nuovi indicatori per valutare l'EAE sulla base delle manifestazioni cliniche di stati d'animo ansiosi e osteoporosi nei pazienti con SM per fornire una valutazione più completa del trattamento della SM.

Introduzione

Le malattie autoimmuni sono uno spettro di disturbi causati dalla risposta immunitaria del sistema immunitario ai propri antigeni con conseguente danno o disfunzione tissutale¹. La sclerosi multipla (SM) è una malattia autoimmune cronica della polineuropatia nel sistema nervoso centrale (SNC), caratterizzata da infiltrazione infiammatoria, demielinizzazione e degenerazione assonale neuronale ^2,3. Attualmente, la SM ha colpito ben 2,5 milioni di persone in tutto il mondo, per lo più giovani e persone di mezza età di età compresa tra 20 e 40 anni, che sono spesso la spina dorsale delle loro famiglie e della società. Ciò ha causato notevoli ripercussioni e danni alle famiglie e alla società ^2,4.

La SM è una malattia multifattoriale con manifestazioni cliniche diverse e complesse. Oltre ai classici disturbi neurologici caratterizzati da infiltrazione infiammatoria e demielinizzazione, la SM mostra spesso deficit visivo, discinesia degli arti e disturbi cognitivi ed emotivi ^5,6,7. Se i pazienti con SM non ricevono il trattamento adeguato e corretto, metà di loro vivrà in sedia a rotelle dopo 20 anni e quasi la metà di loro sperimenterà sintomi depressivi e ansiosi, portando a livelli molto più elevati di ideazione suicidaria rispetto alla popolazione generale ^8,9.

Nonostante un lungo periodo di ricerca, l'eziologia della SM rimane elusiva e la patogenesi della SM non è stata ancora chiarita. I modelli animali di SM hanno permesso di servire come strumenti di test per esplorare lo sviluppo della malattia e nuovi approcci terapeutici, nonostante le differenze significative tra il sistema immunitario dei roditori e quello umano, condividendo allo stesso tempo alcuni principi di base. L'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è attualmente il modello animale ideale per lo studio della SM, che utilizza l'immunità autoantigenica dalle proteine della mielina per indurre l'autoimmunità ai componenti del SNC nei topi sensibili, con l'aggiunta di adiuvante completo di Freund (CFA) e tossina della pertosse (PTX) per migliorare la risposta immunitaria umorale. A seconda del background genetico e degli antigeni immunitari, si ottengono diversi processi patologici, tra cui acuto, recidivante-remittente o cronico, per imitare varie forme cliniche di SM^10,11,12. Gli immunogeni rilevanti comunemente usati nella costruzione di modelli EAE provengono da proteine del SNC, come la proteina basica della mielina (MBP), la proteina proteolipidica (PLP) o la glicoproteina oligodendrocitaria della mielina (MOG). I topi SJL/L immunizzati con MBP o PLP sviluppano un decorso recidivante-remittente e la MOG innesca EAE cronica progressiva nei topi C57BL/6^11,12,13.

Lo scopo principale della terapia modificante la malattia (DMT) è ridurre al minimo i sintomi della malattia e migliorare la funzione⁶. Diversi farmaci sono usati clinicamente per alleviare la SM, ma nessun farmaco è stato ancora usato per curarla completamente, rivelando la necessità di un trattamento sinergico. I topi C57BL / 6 sono attualmente i più comunemente usati per costruire topi transgenici e, in questo lavoro, è stato utilizzato un modello EAE indotto da MOG_35-55 in topi C57BL / 6J con una scala a 5 punti per monitorare la progressione della malattia. I modelli EAE soffrono anche di stati d'animo ansiosi e perdita ossea e lesioni demielinizzanti ampiamente note. Qui viene descritto anche il metodo per valutare i sintomi dell'EAE da più prospettive utilizzando test in campo aperto e analisi di tomografia micro-computerizzata (Micro-CT).

Protocollo

Il Comitato per la cura degli animali dell'Università di Tongji ha approvato il presente lavoro e sono state seguite tutte le linee guida per la cura degli animali. Per gli esperimenti sono stati utilizzati topi maschi o femmine C57BL / 6J tra 8-12 settimane di età. È stato assicurato che l'età e il sesso fossero gli stessi nei gruppi sperimentali; Altrimenti, la suscettibilità alla malattia è stata influenzata. I topi sono stati alloggiati in un ambiente specifico privo di agenti patogeni con cicli alternati di luce e buio di 12 ore in condizioni costanti (temperatura ambiente 23 ± 1 °C, umidità 50% ± 10%), con libero accesso al cibo e all'acqua per topi.

1. Preparazione dell'emulsione MOG_35-55

1. Aggiungere il Mycobacterium tuberculosis liofilizzato inattivato termicamente (MTB, H37Ra) per completare l'adiuvante di Freund (a sua volta contenente 1 mg/ml di MTB inattivata dal calore, H37Ra), ottenendo una concentrazione finale di MTB di 5 mg/ml (vedere Tabella dei materiali).
   NOTA: L'intera operazione deve essere completata nell'armadio di biosicurezza; Non aprire l'aria che soffia.
2. Sciogliere il peptide MOG_35-55 liofilizzato (vedere Tabella dei materiali) con soluzione salina tamponata fosfato sterile pre-raffreddata (PBS) (senza ioni calcio e magnesio, pH 7,4) per preparare la soluzione di antigene alla concentrazione di 2 mg/ml.
3. Prendere un tubo di microcentrifuga pulito da 2 mL e aggiungere una sfera di acciaio sterilizzata da 5 mm (vedi Tabella dei materiali) a ciascun tubo.
4. Aggiungere 500 μL di adiuvante completo di Freund contenente 5 mg/ml di MTB e 500 μL di soluzione di antigene MOG_35-55 alla provetta di microcentrifuga sopra riportata contenente una sfera di acciaio.
5. Oscillare il tubo sopra su un TissueLyser (vedi Tabella dei materiali) per 10 minuti, raffreddare sul ghiaccio per 10 minuti e ripetere quattro volte per mescolare bene e infine formare una soluzione viscosa bianca.
   NOTA: Una buona emulsione è un passo fondamentale nella preparazione dell'emulsione MOG_35-55 , quindi è necessaria una miscelazione accurata. Il TissueLyser è impostato su una velocità di 28 Hz.

2. Preparazione della tossina della pertosse (PTX)

1. Preparare PTX con ddH₂O in una concentrazione di 100 μg/mL e conservare a 4 °C.
2. Diluire la soluzione madre di PTX 50 volte con 1x PBS sterile (senza ioni calcio e magnesio, pH 7,4) per ottenere una soluzione da 200 ng/100 μL per l'uso.

3. Definizione del modello animale EAE

1. Costruisci il modello EAE usando i topi C57BL/6J maschi o femmine di 8-12 settimane. Assicurarsi che i topi siano adeguatamente acclimatati all'ambiente di alimentazione prima dell'immunizzazione.
2. Centrifugare l'emulsione MOG_35-55 preparata (fase 1) a 4 °C per 2-3 s premendo il pulsante Pulse dell'apparecchiatura (vedere Tabella dei materiali) per precipitare tutte le emulsioni sul fondo del tubo.
   NOTA: L'emulsione MOG_35-55 può essere conservata a -20 °C per diversi giorni. Per evitare il fallimento del farmaco, si consiglia di usarlo il prima possibile.
3. Collegare un ago da 22 G a un cilindro di siringa da 1 ml, aspirare l'emulsione MOG 35-55 e trasferire l'emulsione MOG_35-55 in un nuovo cilindro di siringa da 1 ml. Fissare il collegamento tra il cilindro della siringa da 1 mL e un ago da 26 G con pellicola sigillante (vedere Tabella dei materiali).
   NOTA: Evitare bolle d'aria durante il caricamento dell'emulsione MOG_35-55 in barili di siringa da 1 ml.
4. Pulire e disinfettare il sito di iniezione con etanolo al 70%.
5. Iniettare l'emulsione MOG_35-55 per via sottocutanea su ciascun lato della spina dorsale dei topi, 100 μL su ciascun lato. Osservare la formazione automatica di masse bulbose sotto la pelle del dorso dei topi dopo il completamento dell'operazione di iniezione.
   NOTA: Assicurarsi che gli sperimentatori esperti eseguano il processo di immunizzazione e che l'iniezione venga eseguita delicatamente e lentamente per ridurre al minimo la pressione sui topi.
6. Iniettare i topi di cui sopra per via intraperitoneale con 100 μL di PTX (fase 2).
   NOTA: Il giorno dell'immunizzazione è il giorno 0. Inoltre, assicurarsi che i topi possano essere identificati con precisione per la successiva valutazione giornaliera, ad esempio utilizzando un marcatore colorato sulla coda dei topi.
7. Iniettare la stessa dose di PTX il giorno 2 dopo l'immunizzazione.
8. Preparare un gruppo di topi non immunizzati come topi wild-type (WT).

4. Monitoraggio clinico dei topi

1. Registra quotidianamente il peso corporeo dei topi EAE e WT.
   NOTA: La gravità dell'EAE è positivamente correlata alla perdita di peso dei topi, quindi anche il peso corporeo è un indice di monitoraggio molto importante.
2. Monitorare lo stato dei topi da 0 a 21 giorni dopo l'immunizzazione utilizzando il sistema di punteggio 0-5 elencato nella Tabella 1.
   NOTA: i sintomi intermedi vengono conteggiati come più o meno 0,5 punti.

5. Test in campo aperto

NOTA: Gli animali da esperimento selezionati per questa fase sono topi EAE nei periodi di esordio precoce, picco e remissione. Inoltre, i topi WT sono stati utilizzati come controllo. Va notato che tutti i topi sono stati testati per il comportamento simile all'ansia prima della modellazione per escludere i topi con disturbi d'ansia per la modellazione EAE. Inoltre, i topi EAE nei periodi di picco e di remissione con incapacità motoria completa sono stati esclusi dal test.

1. Preparare una camera di reazione in campo aperto da 40 × 40 × 40 cm³ e un sistema di analisi video dell'attività di locomozione (campo aperto) (vedi Tabella dei materiali).
   NOTA: la telecamera è installata in una posizione che copre completamente la scatola, la sala di reazione è illuminata uniformemente e la sala prove deve essere un'area silenziosa.
2. Posizionare i topi di prova nella stanza di prova per l'assuefazione 1 ora prima di iniziare l'esperimento.
3. Spruzzare l'intera area con etanolo al 70% e pulire con un tovagliolo di carta pulito per assicurarsi che la camera di reazione sia pulita prima di iniziare il test.
4. Rimuovi ogni topo individualmente dalla sua gabbia e posizionalo nello stesso angolo dell'arena prima di iniziare a esplorare.
   NOTA: Il fondo della scatola è diviso in 16 griglie, di cui l'area centrale delle quattro griglie è l'area centrale e l'area circostante è l'area periferica.
5. Fare clic sul pulsante Avvia acquisizione nella barra dei menu del sistema di analisi video, registrare il tempo e iniziare le riprese.
6. Stai zitto nella sala prove.
7. Lascia che il mouse si muova liberamente per 5 minuti durante il processo di registrazione.
8. Arrestare il sistema di acquisizione e salvare il video.
9. Porta il mouse fuori dall'arena, rimettilo nella gabbia e procedi al mouse successivo.
   NOTA: Pulire l'area di prova con etanolo al 70% tra una corsa e l'altra per rimuovere odori e altre sostanze.
10. Analizza i risultati utilizzando il sistema di analisi video.

6. Analisi del fenotipo osseo

1. Eutanasia i topi EAE e WT per lussazione cervicale il 21 ° giorno.
   NOTA: Il personale che esegue operazioni di dislocazione cervicale deve essere ben addestrato per ridurre al minimo il dolore sopportato durante la morte dell'animale.
2. Fai sdraiare il mouse in un vassoio da dissezione e fissa le estremità.
3. Tenere la pelle dell'arto posteriore del topo con una pinza e aprire la pelle del topo e il tessuto muscolare con le forbici.
4. Separare accuratamente il femore dalla tibia e dall'osso dell'anca con le forbici.
5. Rimuovere il muscolo aderente al femore con le forbici e posizionare il femore in etanolo al 70% a temperatura ambiente.
6. Scansione del femore distale utilizzando un sistema micro-CT (vedi Tabella dei materiali) con una dimensione isotropa del voxel di 10 μm, con una tensione del tubo a raggi X di picco di 70 kV e un'intensità di raggi X di 0,114 mA.
   NOTA: un filtro gaussiano 3D consente il denoising di immagini di soglia 2D.
7. Analizzare le 100 fette scansionate dall'albero femorale medio per misurare i parametri del femore, tra cui volume osseo, volume tissutale, densità minerale ossea, separazione trabecolare, numero trabecolare, densità di connessione trabecolare e spessore trabecolare e corticale.
   NOTA: A partire dall'estremità prossimale della piastra di crescita distale del femore nei topi, sono state trovate sezioni completamente prive di strutture epifisarie del cappuccio e hanno continuato ad estendere 100 fette verso il femore prossimale, che sono state delineate manualmente i contorni a diversi voxel lontano dalla superficie corticale interna per identificare le trabecole epifisarie.
8. Crea le ricostruzioni 3D impilando immagini 2D di soglia dalle regioni di contorno nel sistema micro-CT.

Risultati

Dopo l'immunizzazione dei topi, il peso corporeo dei topi viene registrato quotidianamente e i loro sintomi clinici vengono valutati secondo il protocollo sopra descritto (fase 4). Nei topi C57BL/6J immunizzati con peptide MOG, poiché la posizione della lesione è principalmente limitata al midollo spinale, la patogenesi dei topi EAE si diffonde dalla coda alla testa. All'inizio della malattia, i topi EAE mostrano debolezza e abbassamento della coda, seguiti da debolezza degli arti posteriori, movimento scoordinato e pa...

Discussione

La SM è una malattia infiammatoria demielinizzante del SNC ed è uno dei disturbi neurologici più comuni che causano disabilità cronica nei giovani, imponendo un enorme onere alle famiglie e alla società ^3,4. La SM è sempre stata classificata come una malattia autoimmune mediata dalle cellule T organo-specifiche, inducendo il sistema autoimmune a erodere lentamente il SNC, che coinvolgerà più sistemi in tutto il corpo²⁷. I sintomi c...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe(with 26 G needle)	Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd	60017031
2 mL microcentrifuge tube	HAIKELASI	KY-LXG2A
22 G needle	Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd	60017208
Complete Freund’s Adjuvant	Sigma	F5881	Stored at 4 °C, 1 mg of heat-inactivated MTB (H37Ra) per mL
Conditioned place preference system	Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd		Animal behavior
Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10009218	Stored at RT
Locomotion activity (open field) video analysis system	Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd	DigBehv-002	Animal behavior
MOG35-55 peptide	Gill Biochemical Co., Ltd	GLS-Y-M-03590	Stored at -20 °C
Mycobacterium tuberculosis H37Ra	BD	231141	Stored at 4 °C
Open field reaction chamber	Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd		Animal behavior
Pertussis toxin	Calbiochem	516560	Stored at 4 °C
Phosphate Buffered Saline			Made in our laboratory
Scissor	Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd	J21010
Sealing film	Heathrow Scientific	HS 234526B
Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge	Thermo Scientific	75002447
Steel ball	QIAGEN	69975
TissueLyser II	QIAGEN	85300
Tweezer	Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd	JD1060
μCT 35 desktop microCT scanner	Scanco Medical AG, Bassersdorf, Switzerland