A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר כיצד לשחזר כריסטה מיטוכונדריאלית כדי להשיג הדמיה תלת-ממדית בדיוק גבוה, ברזולוציה גבוהה ובתפוקה גבוהה.

Abstract

הבנת התכונות הדינמיות של מבנה העל של אברוני התא, שהוא לא רק עשיר במידע לא ידוע אלא גם מתוחכם מנקודת מבט תלת-ממדית (תלת-ממדית), היא קריטית למחקרים מכניסטיים. מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) מציע עומק הדמיה טוב ומאפשר שחזור של ערימות תמונה ברזולוציה גבוהה כדי לחקור את המורפולוגיה האולטרה-סטרוקטורלית של אברוני התא אפילו בקנה מידה ננומטרי; לכן, שחזור תלת מימד צובר חשיבות בשל היתרונות שאין דומה לו. מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) מספק טכנולוגיית רכישת תמונה בתפוקה גבוהה המאפשרת שחזור מבנים גדולים בתלת-ממד מאותו אזור עניין בפרוסות עוקבות. לכן, היישום של SEM בשחזור תלת ממדי בקנה מידה גדול כדי לשחזר את ultrastructure 3D האמיתי של אברונים הופך נפוץ יותר ויותר. בפרוטוקול זה, אנו מציעים שילוב של חתך אולטרה דק סדרתי וטכניקות שחזור תלת-ממדיות כדי לחקור קריסטות מיטוכונדריאליות בתאי סרטן הלבלב. הפרטים על האופן שבו טכניקות אלה מבוצעות מתוארים בפרוטוקול זה באופן שלב אחר שלב, כולל שיטת osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO), הדמיית חתך אולטרה-דק טורי ותצוגת הדמיה.

Introduction

מיטוכונדריה הם אחד האברונים החשובים ביותר בתא. הם משמשים כמרכז המרכזי של ביו-אנרגטיקה תאית ומטבוליזם 1,2 וממלאים תפקיד קריטי בסרטן3. סרטן הלבלב (PC) הוא אחד מסוגי הסרטן הקשיםביותר לטיפול בשל התפשטותו המהירה ושיעור התמותה הגבוה. תפקוד לקוי של המיטוכונדריה, הנגרם בעיקר על ידי שינויים במורפולוגיה המיטוכונדריאלית 3,5,6,7, נקשר למנגנוני המחלה העומדים בבסיס PC8. מיטוכונדריה הם גם דינמיים מאוד, אשר בא לידי ביטוי על ידי....

Protocol

1. הכנת החומר

  1. תרבית 2 x 106 תאי Panc02 ב 12 מ"ל של DMEM בינוני (10% סרום בקר עוברי ו 100 U / מ"ל של פניצילין-סטרפטומיצין), ולשמור על 37 ° C ו 95% לחות באטמוספירה של 5% פחמן דו חמצני ו 95% אוויר במשך 48 שעות.
  2. לאסוף תאי Panc02, צנטריפוגה ב 28 x גרם במשך 2 דקות, ולאחר מכן להשליך את supernatant. ודא כי הדגימה היא בגודל מתאים (1 x 107 תאים), אחרת, שלבי הקיבוע וההתייבשות הבאים לא יפעלו היטב.
  3. הוסף 1 מ"ל של 2.5% גלוטראלדהיד כחומר קיבוע כדי לתקן את תאי Panc02 הטריים בצינורות מיקרו-צנטריפוגות 1.5 מ"ל למשך הלילה ב -4 ° C.
    הערה: הדגימות צריכות להיות צנטריפוגות במהירות של 1,006 x גרם למשך 5 ד....

תוצאות

במהלך תרבית תאים (איור 1A), חילקנו תחילה את תאי סרטן הלבלב לקבוצת ביקורת בתרבית עם מדיום תרבית שלם, קבוצה (1S,3R)-RSL348 (RSL3, מפעיל פרופטוזיס, 100 ננומטר), וקבוצת RSL3 (100 ננומטר) בתוספת פרוסטטין-149 (Fer-1, מעכב פרופטוזיס, 100 ננומטר). באמצעות שלבי הניסוי לעיל, מיקרוסק?.......

Discussion

השיטה המוצגת כאן היא מדריך שימושי שלב אחר שלב ליישום טכניקת השחזור התלת-ממדי, הכוללת יישום מיקרוסקופ אלקטרונים וטכנולוגיית עיבוד תמונה לערימה וסגמנטציה של תמונות טומוגרפיות דו-ממדיות הנוצרות מקטעים אולטרה-דקים סדרתיים. פרוטוקול זה מדגיש מגבלה של תמונות דו-ממדיות שניתן לטפל בהן על ידי הד.......

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי מענקים של הקרן למדעי הטבע של מחוז ג'ג'יאנג (Z23H290001, LY19H280001); מענקי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82274364, 81673607 ו-81774011); וכן פרויקט מחקר רווחת הציבור של מענק המדע והטכנולוגיה של הוז'ו (2021GY49, 2018GZ24). אנו מעריכים את העזרה הרבה, התמיכה הטכנית והתמיכה הניסיונית מהפלטפורמה הציבורית של מרכז המחקר הרפואי, האקדמיה למדעי הרפואה הסינית, האוניברסיטה לרפואה סינית ג'ג'יאנג.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
(1S,3R)-RSL3MCEHY-100218A
AcetoneSIGMA179124
AmiraVisage Imaging
Aspartic acidMCEHY-42068
Dulbecco's modified Eagle’s mediumGibco11995115
EthanolMerck100983
Ferrostatin-1MCEHY-100579
Fetal bovine serumGibco10437010
Field emission scanning electron microscopeHITACHISU8010
GlutaraldehydeAlfa AesarA10500.22
Lead nitrateSANTA CRUZsc-211724
Osmium TetroxideSANTA CRUZsc-206008B
Panc02European Collection of Authenticated Cell Cultures 98102213
Penicillin-streptomycinBiosharpBL505A
Phosphate Buffered SalineBiosharpBL302A
Pon 812 Epoxy resinSPI CHEMGS02660
Potassium ferrocyanideMacklinP816416
ThiocarbohydrazideMerck223220
UltramicrotomeLEICAEMUC7
Uranyl AcetateRHAWNR0329292020.2

References

  1. Gonidi, M., et al. Mitochondrial UCP4 and bcl-2 expression in imprints of breast carcinomas: Relationship with DNA ploidy and classical prognostic factors. Pathology, Research and Practice. 207 (6), 377-382 (2011).
  2. Youle, R. J., vander Bliek, A. M.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

196SEMOTO

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved