Una tecnica tridimensionale per la visualizzazione dei cambiamenti ultrastrutturali mitocondriali nelle cellule tumorali pancreatiche

Riepilogo

Questo protocollo descrive come ricostruire le creste mitocondriali per ottenere immagini 3D con elevata precisione, alta risoluzione e throughput elevato.

Abstract

Comprendere le caratteristiche dinamiche dell'ultrastruttura dell'organello cellulare, che non è solo ricca di informazioni sconosciute ma anche sofisticata da una prospettiva tridimensionale (3D), è fondamentale per gli studi meccanicistici. La microscopia elettronica (EM) offre una buona profondità di imaging e consente la ricostruzione di pile di immagini ad alta risoluzione per studiare la morfologia ultrastrutturale degli organelli cellulari anche su scala nanometrica; pertanto, la ricostruzione 3D sta acquisendo importanza grazie ai suoi incomparabili vantaggi. La microscopia elettronica a scansione (SEM) fornisce una tecnologia di acquisizione delle immagini ad alta produttività che consente di ricostruire grandi strutture in 3D dalla stessa regione di interesse in sezioni consecutive. Pertanto, l'applicazione del SEM nella ricostruzione 3D su larga scala per ripristinare la vera ultrastruttura 3D degli organelli sta diventando sempre più comune. In questo protocollo, suggeriamo una combinazione di sezione ultrasottile seriale e tecniche di ricostruzione 3D per studiare le criste mitocondriali nelle cellule tumorali pancreatiche. I dettagli di come vengono eseguite queste tecniche sono descritti in questo protocollo in modo dettagliato, incluso il metodo osmio-tiocarboidrazide-osmio (OTO), l'imaging seriale a sezione ultrasottile e il display di visualizzazione.

Introduzione

I mitocondri sono uno degli organelli più importanti della cellula. Servono come hub centrale della bioenergetica cellulare e del metabolismo ^1,2 e svolgono un ruolo critico nel cancro³. Il cancro del pancreas (PC) è uno dei tumori più difficili^{da trattare 4} a causa della sua rapida diffusione e dell'alto tasso di mortalità. La disfunzione mitocondriale, causata principalmente da cambiamenti nella morfologia mitocondriale 3,5,6,7^, è stata collegata ai meccani....

Protocollo

1. Preparazione del materiale

1. Coltura 2 x 10⁶ cellule Panc02 in 12 ml di terreno DMEM (10% siero fetale bovino e 100 U/mL di penicillina-streptomicina), e mantenere a 37 °C e 95% di umidità in un'atmosfera di 5% di anidride carbonica e 95% di aria per 48 ore.
2. Raccogliere le cellule Panc02, centrifugare a 28 x g per 2 minuti, quindi eliminare il surnatante. Assicurarsi che il campione sia di dimensioni adeguate (1 x 10⁷ celle), altrimenti i seguenti passaggi di fissazione e disidratazione non funzioneranno bene.
3. Aggiungere 1 mL di glutaraldeide al 2,5% come fissativo per fissare le cellule fr....

Discussione

Il metodo qui presentato è un'utile guida passo-passo per applicare la tecnica di ricostruzione 3D, che prevede l'applicazione della microscopia elettronica e della tecnologia di elaborazione delle immagini all'impilamento e alla segmentazione di immagini tomografiche 2D generate da sezioni seriali ultrasottili. Questo protocollo evidenzia una limitazione delle immagini 2D che può essere affrontata dalla visualizzazione 3D dell'ultrastruttura dell'organello, che presenta i vantaggi di una forte riproducibilità delle s.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
(1S,3R)-RSL3	MCE	HY-100218A
Acetone	SIGMA	179124
Amira	Visage Imaging
Aspartic acid	MCE	HY-42068
Dulbecco's modified Eagle’s medium	Gibco	11995115
Ethanol	Merck	100983
Ferrostatin-1	MCE	HY-100579
Fetal bovine serum	Gibco	10437010
Field emission scanning electron microscope	HITACHI	SU8010
Glutaraldehyde	Alfa Aesar	A10500.22
Lead nitrate	SANTA CRUZ	sc-211724
Osmium Tetroxide	SANTA CRUZ	sc-206008B
Panc02	European Collection of Authenticated Cell Cultures	98102213
Penicillin-streptomycin	Biosharp	BL505A
Phosphate Buffered Saline	Biosharp	BL302A
Pon 812 Epoxy resin	SPI CHEM	GS02660
Potassium ferrocyanide	Macklin	P816416
Thiocarbohydrazide	Merck	223220
Ultramicrotome	LEICA	EMUC7
Uranyl Acetate	RHAWN	R032929	2020.2