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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo descrive come ricostruire le creste mitocondriali per ottenere immagini 3D con elevata precisione, alta risoluzione e throughput elevato.

Abstract

Comprendere le caratteristiche dinamiche dell'ultrastruttura dell'organello cellulare, che non è solo ricca di informazioni sconosciute ma anche sofisticata da una prospettiva tridimensionale (3D), è fondamentale per gli studi meccanicistici. La microscopia elettronica (EM) offre una buona profondità di imaging e consente la ricostruzione di pile di immagini ad alta risoluzione per studiare la morfologia ultrastrutturale degli organelli cellulari anche su scala nanometrica; pertanto, la ricostruzione 3D sta acquisendo importanza grazie ai suoi incomparabili vantaggi. La microscopia elettronica a scansione (SEM) fornisce una tecnologia di acquisizione delle immagini ad alta produttività che consente di ricostruire grandi strutture in 3D dalla stessa regione di interesse in sezioni consecutive. Pertanto, l'applicazione del SEM nella ricostruzione 3D su larga scala per ripristinare la vera ultrastruttura 3D degli organelli sta diventando sempre più comune. In questo protocollo, suggeriamo una combinazione di sezione ultrasottile seriale e tecniche di ricostruzione 3D per studiare le criste mitocondriali nelle cellule tumorali pancreatiche. I dettagli di come vengono eseguite queste tecniche sono descritti in questo protocollo in modo dettagliato, incluso il metodo osmio-tiocarboidrazide-osmio (OTO), l'imaging seriale a sezione ultrasottile e il display di visualizzazione.

Introduzione

I mitocondri sono uno degli organelli più importanti della cellula. Servono come hub centrale della bioenergetica cellulare e del metabolismo 1,2 e svolgono un ruolo critico nel cancro3. Il cancro del pancreas (PC) è uno dei tumori più difficilida trattare 4 a causa della sua rapida diffusione e dell'alto tasso di mortalità. La disfunzione mitocondriale, causata principalmente da cambiamenti nella morfologia mitocondriale 3,5,6,7, è stata collegata ai meccanismi patologici alla base del PC8. I mitocondri sono anche altamente dinamici, il che si riflette nei frequenti e dinamici cambiamenti nella loro connettività di rete e nella struttura della crisi9. Il rimodellamento della struttura delle cristae può avere un impatto diretto sulla funzione mitocondriale e sullo stato cellulare 10,11, che sono significativamente alterati durante la crescita delle cellule tumorali, le metastasi e i cambiamenti del microambiente tumorale 12,13.

Negli ultimi anni, gli scienziati hanno studiato questo organello utilizzando l'osservazione EM14,15,16,17; ad esempio, i ricercatori hanno analizzato le dinamiche mitocondriali utilizzando tecniche di ricostruzione 3D 6,7,18,19. Il concetto generale e il metodo per la ricostruzione 3D delle immagini di microscopia elettronica sono stati formalmente stabiliti già nel 196820 e prevedevano la combinazione di microscopia elettronica, diffrazione elettronica e elaborazione di immagini al computer per ricostruire la coda del fago T4. Fino ad ora, la tecnologia di imaging 3D al microscopio elettronico ha fatto progressi significativi in termini di risoluzione dell'immagine21, grado di automazione 22 e volume di elaborazione 23 ed è stata utilizzata su scala sempre più ampia nella ricerca biologica, dal livello del tessuto al livello dell'ultrastruttura dell'organello alla scala nanometrica24. Negli ultimi anni, l'imaging 3D al microscopio elettronico è diventato anche una tecnologia promettente per una vasta gamma di applicazioni25,26,27.

La crescente attenzione alle creste mitocondriali illustra in particolare i requisiti essenziali per l'imaging del volume ultrastrutturale. La microscopia elettronica a trasmissione (TEM) è stata utilizzata per visualizzare campioni raccolti su una griglia di rame (400 mesh)28, con il fascio di elettroni che passa attraverso la sezione. Tuttavia, a causa della portata limitata della griglia di rame, è impossibile visualizzare completamente le fette continue dello stesso campione29. Ciò complica lo studio delle strutture target durante l'imaging TEM. Inoltre, TEM si basa su attività manuali dispendiose in termini di tempo e soggette a errori, tra cui il taglio e la raccolta di più sezioni e l'imaging sequenziale21, quindi non è adatto per ricostruzioni ultrastrutturali di campioni di grandi volumi23. Attualmente, la ricostruzione ad alta risoluzione dell'imaging di campioni di grandi volumi è ottenuta attraverso l'uso di apparecchiature specializzate, come il TEM camera array (TEMCA)30 o due sistemi TEMCA di seconda generazione (TEMCA2)31, che consentono l'imaging automatizzato ad alta produttività in breve tempo. Tuttavia, questo tipo di imaging non ha il vantaggio di essere facile da ottenere e universale a causa della necessità di apparecchiature personalizzate.

Rispetto al TEM, il metodo per generare automaticamente migliaia di immagini volumetriche seriali per grandi aree basato su SEM 32,33 migliora l'efficienza e l'affidabilità dell'imaging seriale e offre risoluzioni z più elevate34. Ad esempio, la microscopia elettronica a scansione seriale a scansione a faccia bloccata (SBF-SEM) e la microscopia elettronica a scansione a fascio ionico focalizzato (FIB-SEM) hanno entrambi permesso di ottenere la ricostruzione 3D di ultrastrutture con alta velocità, efficienza e risoluzione35,36. Tuttavia, è inevitabile che la superficie del blocco venga rasata meccanicamente dal coltello diamantato dell'SBF-SEM o mediante fresatura con il fascio ionico focalizzato di FIB-SEM33,37. A causa della distruttività dei due metodi per i campioni, non è possibile ricostruire nuovamente la stessa struttura target per ulteriori analisi38,39,40. Inoltre, pochi studi hanno tentato di ricostruire l'ultrastruttura dell'organello 3D delle cellule tumorali utilizzando EM per osservare i cambiamenti patologici12. Per questi motivi, al fine di chiarire ulteriormente i meccanismi patologici delle cellule tumorali, come le cellule tumorali pancreatiche, proponiamo una nuova tecnologia per la ricostruzione 3D di immagini in sezione seriale utilizzando un ultramicrotomo e un microscopio elettronico a scansione ad emissione di campo (FE-SEM) per analizzare l'ultrastruttura mitocondriale a livello di cristae; Con questa tecnologia, i dati ad alta risoluzione possono essere acquisiti utilizzando un metodo efficiente e accessibile. Le sezioni ultrasottili seriali realizzate con un ultramicrotomo possono essere memorizzate in modo semi-permanente in una custodia a griglia e rivisualizzate più volte, anche dopo diversi anni41. FE-SEM è molto apprezzato come strumento in vari campi di ricerca grazie alla sua capacità di fornire immagini ad alta risoluzione, alto ingrandimento e versatilità42. Nel tentativo di visualizzare la struttura fine degli organelli in 3D, la tecnica per la produzione di pile di immagini seriali 2D con risoluzione utile utilizzando elettroni retrodiffusi prodotti da FE-SEM 43,44 può anche essere utilizzata per ottenere immagini ad alta produttività e multiscala di regioni target o delle loro strutture associate senza attrezzature speciali 45. La generazione di artefatti di carica influisce direttamente sulla qualità delle immagini acquisite, quindi è particolarmente importante mantenere breve il tempo di permanenza.

Pertanto, il presente studio elabora le procedure sperimentali impiegate in questa tecnica SEM per ricostruire la struttura 3D delle creste mitocondriali46. In particolare, mostriamo il processo sviluppato per ottenere la segmentazione semi-automatica delle regioni mitocondriali e digitalizzare la ricostruzione 3D utilizzando il software Amira, che prevede anche la realizzazione di campioni di fette utilizzando il metodo convenzionale di preparazione dei campioni OTO44,47, il completamento della raccolta di sezioni utilizzando il taglio ultramicrotomo e l'acquisizione di dati 2D sequenziali tramite FE-SEM.

Protocollo

1. Preparazione del materiale

  1. Coltura 2 x 106 cellule Panc02 in 12 ml di terreno DMEM (10% siero fetale bovino e 100 U/mL di penicillina-streptomicina), e mantenere a 37 °C e 95% di umidità in un'atmosfera di 5% di anidride carbonica e 95% di aria per 48 ore.
  2. Raccogliere le cellule Panc02, centrifugare a 28 x g per 2 minuti, quindi eliminare il surnatante. Assicurarsi che il campione sia di dimensioni adeguate (1 x 107 celle), altrimenti i seguenti passaggi di fissazione e disidratazione non funzioneranno bene.
  3. Aggiungere 1 mL di glutaraldeide al 2,5% come fissativo per fissare le cellule fresche di Panc02 nelle provette di microcentrifuga da 1,5 mL durante la notte a 4 °C.
    NOTA: I campioni devono essere centrifugati a 1.006 x g per 5 minuti in ciascuna delle seguenti fasi (fasi 1.3-1.11).
  4. Aspirare il fissativo e sciacquare i campioni due volte con soluzione salina tamponata fosfato 0,1 M (PBS), quindi risciacquare due volte con acqua bidistillata (ddH2O) a temperatura ambiente per 10 minuti ciascuno.
  5. Aggiungere 50 μL di una soluzione contenente tetrossido di osmio all'1% (OsO 4) e ferrocianuro di potassio all'1,5% in rapporto 1:1 a4 °C per 1 ora. Quindi, risciacquare due volte con 0,1 M PBS per 10 minuti ogni volta e risciacquare con ddH2O per altri 10 minuti.
  6. Aggiungere 1 mL di tiocarboidrazide (TCH) all'1%, incubare a temperatura ambiente per 30 minuti a 1 ora, quindi risciacquare con ddH2O quattro volte per 10 minuti ogni volta.
  7. Aggiungere 50 μL di OsO 4 all'1%, fissare a temperatura ambiente per 1 ora, quindi risciacquare con ddH2O quattro volte per 10 minuti ogni volta.
  8. Aggiungere 1 mL di acetato di uranile al 2% a 4 °C durante la notte, quindi risciacquare con ddH2O quattro volte per 10 minuti ogni volta.
  9. Aggiungere 1 mL di soluzione di Walton (0,066 g di nitrato di piombo sciolto in 10 mL di soluzione madre di acido aspartico 0,03 mol/L) a 60 °C per un'ulteriore 1 ora di incubazione.
  10. Risciacquare con ddH2O quattro volte per 10 minuti ogni volta, quindi disidratare in una serie di alcol graduato per 10 minuti ogni volta: 50% di alcol, 70% di alcol, 80% di alcol e 90% di alcol 1x e 100% di alcol 2x. Quindi, disidratare in acetone al 100% due volte per 10 minuti ogni volta. Utilizzare 1 mL di ciascuna soluzione per la disidratazione.
  11. Mescolare 200 μL di acetone con resina epossidica Pon 812 in rapporto 3:1, 1:1 e 1:3. Immergere il campione in resina a temperatura ambiente per 2 ore, 4 ore e 4 ore, rispettivamente, quindi prendere la resina epossidica 100% Pon 812 per impregnare durante la notte.
    NOTA: quando si eseguono le fasi di colorazione e incorporamento della resina, è importante operare in una cappa aspirante poiché si tratta di sostanze tossiche. Inoltre, durante l'esperimento devono essere indossati camici da laboratorio e guanti resistenti ai solventi.
  12. Mettere i campioni in uno stampo incorporato, quindi metterli in forno a 60 °C per 48 ore per polimerizzare. Utilizzare l'incorporazione piatta29 per ridurre l'aspetto della resina attorno al campione. Ciò semplifica l'installazione del campione e riduce l'impatto degli artefatti di ricarica sulla successiva segmentazione dell'immagine.
    NOTA: Per generare successivamente una superficie di taglio orizzontale, è possibile aggiungere una piccola quantità di resina nel foro dello stampo, facendo attenzione a non riempirlo eccessivamente.
  13. Preparare i wafer di silicio lavandoli prima e poi idrofilizzandoli con una soluzione concentrata di H 2 SO4/H 2O2per 30 minuti. Raccogliere strisce a fette seriali con uno spessore di 70 nm sui wafer di silicio idrofilizzati utilizzando un ultramicrotomo e asciugarle in un forno a 60 °C per 10 minuti.
    NOTA: cattura lentamente la fetta mentre galleggia sulla superficie dei wafer per evitare la perdita o la deformazione della fetta.

2. Acquisizione di immagini e ricostruzione tridimensionale

  1. Prima di montare un wafer di silicio sul palco, lavare le sezioni con acqua distillata tre volte e asciugarle all'aria. Tagliare un nastro di carbonio conduttivo delle dimensioni di 1 cm x 0,5 cm e incollarlo tra il wafer di silicio e lo stadio del campione SEM per completare la configurazione del campione (Figura 2E).
  2. Impostare il parametro di tensione di accelerazione FE-SEM su 2 kV con una distanza di lavoro di 4 mm (Figura 3B e Tabella 1).
    NOTA: per migliorare il rapporto segnale/rumore e ridurre il rumore nell'immagine, osservare a bassi ingrandimenti quando possibile. All'aumentare del multiplo, il raggio di scansione del SEM diminuisce, portando ad un aumento dell'accumulo di carica sulle immagini.
  3. Fai clic sull'icona H / L nella barra dei menu in alto. Innanzitutto, a basso ingrandimento, orientare la prima sezione delle strisce di fette di destinazione, quindi fare nuovamente clic sull'opzione H/L (Figura 3A) per passare alla modalità ad alto ingrandimento; Raccogli un'immagine appropriata per la struttura di interesse regolando la luminosità, il contrasto e l'ingrandimento dell'immagine.
  4. Selezionare Project View > Open Data e importare i file di immagine da analizzare nel software.
  5. Allineare le immagini facendo clic su Allinea sezioni > Modifica (Figura 4B) e regolare il valore Intervallo intensità nella barra dei menu in basso a sinistra modificando la trasparenza dell'immagine. Qui, utilizzare una strategia di allineamento semi-automatico; In particolare, tramite l'allineamento automatico, fare in modo che le immagini si sovrappongano a un'immagine precedente e quindi eseguire la messa a punto manuale.
    NOTA: in questo lavoro, durante il processo di allineamento, l'immagine precedente è stata utilizzata come riferimento e le operazioni di spostamento e rotazione sono state utilizzate per sovrapporsi al massimo alla struttura di destinazione delle due immagini. Facendo clic su Allinea coppia di sezioni correnti è possibile allineare automaticamente le immagini, ma potrebbero verificarsi errori di posizionamento.
  6. Selezionare il modulo Estrai sottovolume e ritagliare i set di dati allineati in base alle dimensioni della parte sovrapposta dell'intero stack.
  7. Nella sottosezione Segmentazione (Figura 4C), selezionare Ricampiona > segmentazione > Salva. Scegliete la soglia della bacchetta magica e la dimensione dello strumento pennello per selezionare l'intervallo corretto. Anche in questo caso, adottare un metodo di segmentazione semi-automatico utilizzando prima la bacchetta magica per selezionare automaticamente un'area di grandi dimensioni adatta, quindi utilizzare il pennello per descrivere accuratamente i dettagli.
    NOTA: La bacchetta magica può essere applicata alle immagini segmentate in base alle ovvie differenze nell'intensità dei pixel esistenti tra la struttura di interesse e le strutture circostanti alterando il valore di mascheramento e utilizzando la linea limite di disegno. Non è in grado di distinguere gli artefatti di ricarica generati durante l'acquisizione delle immagini. Pertanto, potrebbe comportare una segmentazione errata per le regioni target. Lo strumento Pennello può essere utilizzato per segmentare manualmente per ricostruire accuratamente le strutture biologiche.
  8. In Segmentazione > selezione, fare clic sull'icona + per aggiungere l'area selezionata (Figura 4C).
  9. Ripetere il passaggio precedente (2.8) per selezionare la stessa struttura di destinazione in immagini diverse fino al completamento della selezione per la ricostruzione delle microstrutture di interesse.
    NOTA: Durante i processi di rimodellamento mitocondriale, la selezione dell'oggetto target deve essere eseguita dall'immagine al centro di un gruppo di immagini sequenziali. Se l'area richiesta viene selezionata dalla prima o dall'ultima immagine, il risultato della ricostruzione non sarà in grado di presentare una visualizzazione 3D completa.
  10. Dopo aver completato la segmentazione regionale, generare il file di immagine in base ai migliori risultati per le dimensioni dell'oggetto e la risoluzione dell'immagine. Fare clic su Crop Editor (Ritaglia editor), quindi immettere il numero 6 nella casella Virtual Slider (Figura 4C).
  11. Nel menu a discesa a sinistra, fare clic con il pulsante destro del mouse sull'area grigia nella sottosezione Progetto e selezionare Genera superficie > Crea > Applica. Nel file generato, usa il modulo Surface View per creare la struttura della superficie e la rappresentazione 3D.

3. Quantificazione

  1. Fare clic su Rimuovi piccoli punti > applicare (Figura 4D). Nella sottosezione Progetto fare clic con il pulsante destro del mouse sull'area grigia e scegliere Analisi etichette > Applica (Figura 4D).
  2. Personalizzare il nome della colonna e scegliere un gruppo di misure. Selezionare Volume3d e Length3d dalla casella Misure native.
  3. Fare clic sul pulsante Applica nell'angolo inferiore sinistro dello schermo. Copiare i dati e rappresentare graficamente nel software statistico, ad esempio GraphPad.

Risultati

Durante la coltura cellulare (Figura 1A), abbiamo prima diviso le cellule tumorali pancreatiche in un gruppo di controllo coltivato con terreno di coltura completo, un gruppo (1S,3R)-RSL348 (RSL3, un attivatore della ferroptosi, 100 nM) e un gruppo RSL3 (100 nM) più ferrostatina-149 (Fer-1, un inibitore della ferroptosi, 100 nM). Attraverso le fasi sperimentali di cui sopra, il microscopio elettronico a scansione ha acquisito 38 (Figura supple...

Discussione

Il metodo qui presentato è un'utile guida passo-passo per applicare la tecnica di ricostruzione 3D, che prevede l'applicazione della microscopia elettronica e della tecnologia di elaborazione delle immagini all'impilamento e alla segmentazione di immagini tomografiche 2D generate da sezioni seriali ultrasottili. Questo protocollo evidenzia una limitazione delle immagini 2D che può essere affrontata dalla visualizzazione 3D dell'ultrastruttura dell'organello, che presenta i vantaggi di una forte riproducibilità delle s...

Divulgazioni

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Riconoscimenti

Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni della Natural Science Foundation of Zhejiang Province (Z23H290001, LY19H280001); Sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (82274364, 81673607 e 81774011); nonché il Public Welfare Research Project di Huzhou Science and Technology Grant (2021GY49, 2018GZ24). Apprezziamo il grande aiuto, il supporto tecnico e il supporto sperimentale della piattaforma pubblica del Centro di ricerca medica, Accademia delle scienze mediche cinesi, Università medica cinese di Zhejiang.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
(1S,3R)-RSL3MCEHY-100218A
AcetoneSIGMA179124
AmiraVisage Imaging2020.2
Aspartic acidMCEHY-42068
Dulbecco's modified Eagle’s mediumGibco11995115
EthanolMerck100983
Ferrostatin-1MCEHY-100579
Fetal bovine serumGibco10437010
Field emission scanning electron microscopeHITACHISU8010
GlutaraldehydeAlfa AesarA10500.22
Lead nitrateSANTA CRUZsc-211724
Osmium TetroxideSANTA CRUZsc-206008B
Panc02European Collection of Authenticated Cell Cultures 98102213
Penicillin-streptomycinBiosharpBL505A
Phosphate Buffered SalineBiosharpBL302A
Pon 812 Epoxy resinSPI CHEMGS02660
Potassium ferrocyanideMacklinP816416
ThiocarbohydrazideMerck223220
UltramicrotomeLEICAEMUC7
Uranyl AcetateRHAWNR032929

Riferimenti

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