췌장암 세포의 미토콘드리아 미세구조적 변화를 시각화하기 위한 3차원 기법

요약

이 프로토콜은 미토콘드리아 크리스타를 재구성하여 높은 정확도, 고해상도 및 높은 처리량으로 3D 이미징을 달성하는 방법을 설명합니다.

초록

알려지지 않은 정보가 풍부할 뿐만 아니라 3차원(3D) 관점에서 정교한 세포 소기관 미세 구조의 동적 특징을 이해하는 것은 기계론적 연구에 매우 중요합니다. 전자 현미경(EM)은 우수한 이미징 깊이를 제공하고 고해상도 이미지 스택을 재구성하여 나노미터 규모에서도 세포 소기관의 미세 구조적 형태를 조사할 수 있습니다. 따라서 3D 재구성은 비교할 수 없는 장점으로 인해 중요성이 커지고 있습니다. 주사전자현미경(SEM)은 연속적인 슬라이스에서 동일한 관심 영역에서 큰 구조를 3D로 재구성할 수 있는 고처리량 이미지 획득 기술을 제공합니다. 따라서 세포 소기관의 진정한 3D 미세 구조를 복원하기 위해 대규모 3D 재구성에 SEM을 적용하는 것이 점점 보편화되고 있습니다. 이 프로토콜에서는 췌장암 세포에서 미토콘드리아 크리스타를 연구하기 위해 직렬 초박형 절편과 3D 재구성 기술의 조합을 제안합니다. 이러한 기술이 수행되는 방법에 대한 세부 사항은 오스뮴-티오카르보하이드라지드-오스뮴(OTO) 방법, 직렬 초박형 단면 이미징 및 시각화 디스플레이를 포함하여 단계별로 이 프로토콜에 설명되어 있습니다.

서문

미토콘드리아는 세포에서 가장 중요한 세포 기관 중 하나입니다. 이들은 세포 생물 에너지와 신진대사의 중심 허브 역할을 하며^1,2 암에 중요한 역할을 한다³. 췌장암(Pancreatic cancer, PC)은 급격한 확산과 높은 사망률로 인해 치료하기 가장 어려운 암 중 하나이다.⁴ 미토콘드리아 기능 장애는 주로 미토콘드리아 형태 3,5,6,7의 변화에 의해 발생하며^, PC 8의 기저에 있는 질병 기전과 관련이 있다. 미토콘드리아는 또한 매우 동적이며, 이는 네트워크 연결성과 크리스타 구조의 빈번하고 역동적인 변화에 의해 반영된다⁹. 크리스타 구조의 재형성은 미토콘드리아 기능 및 세포 상태에 직접적인 영향을 미칠 수 있다 10,11, 이는 종양 세포 성장, 전이 및 종양 미세환경 변화

프로토콜

1. 재료 준비

1. 12mL의 DMEM 배지(10% 소 태아 혈청 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신)에서 2 x 10⁶ Panc02 세포를 배양하고 48시간 동안 5% 이산화탄소 및 95% 공기의 분위기에서 37°C 및 95% 습도를 유지합니다.
2. Panc02 세포를 수집하고 28 x g 에서 2분 동안 원심분리한 다음 상층액을 버립니다. 샘플의 크기가 적절한지 확인하십시오(1 x 10⁷ 셀), 그렇지 않으면 다음 고정 및 탈수 단계가 제대로 작동하지 않습니다.
3. 2.5% 글루타르알데히드 1mL를 고정액으로 첨가하여 신선한 Panc02 세포를 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 4°C에서 밤새 고정합니다.
   알림: 샘플은 다음 단계(1,006-5단계)에서 1.3분 동안 1.11 x g 로 원심분리해야 합니다.
4. 고정액을 흡인하고, 시료를 0.1 M 인산염 완충 식염수(PBS)로 2회 헹구고, 실온에서 각각 10분 동안 이중 증류수(_ddH2O)로 2회 헹구었다.
5. 1% 사산화오스뮴(OsO₄)과 1.5% 페로시안화 칼륨을 포함하는 용액 50μL를 4°C에서 1:1의 비....

토론

여기에 제시된 방법은 직렬 초박형 섹션에서 생성된 2D 단층 촬영 이미지의 적층 및 분할에 전자 현미경 및 이미지 처리 기술을 적용하는 것과 관련된 3D 재구성 기술을 적용하기 위한 유용한 단계별 가이드입니다. 이 프로토콜은 세포 소기관 미세 구조의 3D 시각화로 해결할 수 있는 2D 이미지의 한계를 강조하며, 이는 고해상도 수준에서 구조의 강력한 재현성과 더 높은 정확도의 장점이 있습니다........

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
(1S,3R)-RSL3	MCE	HY-100218A
Acetone	SIGMA	179124
Amira	Visage Imaging
Aspartic acid	MCE	HY-42068
Dulbecco's modified Eagle’s medium	Gibco	11995115
Ethanol	Merck	100983
Ferrostatin-1	MCE	HY-100579
Fetal bovine serum	Gibco	10437010
Field emission scanning electron microscope	HITACHI	SU8010
Glutaraldehyde	Alfa Aesar	A10500.22
Lead nitrate	SANTA CRUZ	sc-211724
Osmium Tetroxide	SANTA CRUZ	sc-206008B
Panc02	European Collection of Authenticated Cell Cultures	98102213
Penicillin-streptomycin	Biosharp	BL505A
Phosphate Buffered Saline	Biosharp	BL302A
Pon 812 Epoxy resin	SPI CHEM	GS02660
Potassium ferrocyanide	Macklin	P816416
Thiocarbohydrazide	Merck	223220
Ultramicrotome	LEICA	EMUC7
Uranyl Acetate	RHAWN	R032929	2020.2