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요약

이 프로토콜은 미토콘드리아 크리스타를 재구성하여 높은 정확도, 고해상도 및 높은 처리량으로 3D 이미징을 달성하는 방법을 설명합니다.

초록

알려지지 않은 정보가 풍부할 뿐만 아니라 3차원(3D) 관점에서 정교한 세포 소기관 미세 구조의 동적 특징을 이해하는 것은 기계론적 연구에 매우 중요합니다. 전자 현미경(EM)은 우수한 이미징 깊이를 제공하고 고해상도 이미지 스택을 재구성하여 나노미터 규모에서도 세포 소기관의 미세 구조적 형태를 조사할 수 있습니다. 따라서 3D 재구성은 비교할 수 없는 장점으로 인해 중요성이 커지고 있습니다. 주사전자현미경(SEM)은 연속적인 슬라이스에서 동일한 관심 영역에서 큰 구조를 3D로 재구성할 수 있는 고처리량 이미지 획득 기술을 제공합니다. 따라서 세포 소기관의 진정한 3D 미세 구조를 복원하기 위해 대규모 3D 재구성에 SEM을 적용하는 것이 점점 보편화되고 있습니다. 이 프로토콜에서는 췌장암 세포에서 미토콘드리아 크리스타를 연구하기 위해 직렬 초박형 절편과 3D 재구성 기술의 조합을 제안합니다. 이러한 기술이 수행되는 방법에 대한 세부 사항은 오스뮴-티오카르보하이드라지드-오스뮴(OTO) 방법, 직렬 초박형 단면 이미징 및 시각화 디스플레이를 포함하여 단계별로 이 프로토콜에 설명되어 있습니다.

서문

미토콘드리아는 세포에서 가장 중요한 세포 기관 중 하나입니다. 이들은 세포 생물 에너지와 신진대사의 중심 허브 역할을 하며1,2 암에 중요한 역할을 한다3. 췌장암(Pancreatic cancer, PC)은 급격한 확산과 높은 사망률로 인해 치료하기 가장 어려운 암 중 하나이다.4 미토콘드리아 기능 장애는 주로 미토콘드리아 형태 3,5,6,7의 변화에 의해 발생하며, PC 8의 기저에 있는 질병 기전과 관련이 있다. 미토콘드리아는 또한 매우 동적이며, 이는 네트워크 연결성과 크리스타 구조의 빈번하고 역동적인 변화에 의해 반영된다9. 크리스타 구조의 재형성은 미토콘드리아 기능 및 세포 상태에 직접적인 영향을 미칠 수 있다 10,11, 이는 종양 세포 성장, 전이 및 종양 미세환경 변화12,13 동안 현저하게 변화된다.

최근 몇 년 동안 과학자들은 EM 관찰14,15,16,17을 사용하여 이 세포 기관을 연구했습니다. 예를 들어, 연구자들은 3D 재구성 기술 6,7,18,19를 사용하여 미토콘드리아 역학을 분석했습니다. 전자 현미경 이미지의 3D 재구성에 대한 일반적인 개념과 방법은 일찍이 1968년에 공식적으로 확립되었습니다20 전자 현미경, 전자 회절 및 컴퓨터 이미지 처리를 결합하여 T4 파지 테일을 재구성하는 것을 포함했습니다. 지금까지 전자 현미경 3D 이미징 기술은 이미지 해상도 (21), 자동화 정도 (22) 및 처리 볼륨 (23) 측면에서 상당한 발전을 이루었으며 조직 수준에서 나노 미터 규모(24)의 세포 소기관 미세 구조 수준에 이르기까지 생물학 연구에서 점점 더 광범위한 규모로 사용되어 왔습니다. 최근 몇 년 동안, 전자 현미경 3D 이미징은 광범위한 응용 분야에서 유망한 기술이되었습니다25,26,27.

미토콘드리아 크리스타에 대한 관심 증가는 특히 초구조적 체적 이미징에 대한 필수 요구 사항을 보여줍니다. 투과 전자 현미경 (TEM)은 구리 그리드 (400 메쉬) (28)에서 수집 된 샘플을 시각화하는 데 사용되었으며, 전자빔은 섹션을 통과합니다. 그러나, 구리 그리드의 제한된 범위로 인해, 동일한 샘플(29)의 연속적인 슬라이스를 완전히 이미지화하는 것은 불가능하다. 이것은 TEM 이미징 중 표적 구조 연구를 복잡하게 만듭니다. 추가적으로, TEM은 다수의 슬라이스를 절단 및 수집하고 이들을 순차적으로 이미징하는 것을 포함하여, 시간이 많이 걸리고 오류가 발생하기 쉬운 수동 작업에 의존하므로(21), 대량의 샘플(23)의 초구조적 재구성에는 적합하지 않다. 현재 TEM 카메라 어레이(TEMCA)30 또는 2개의 2세대 TEMCA 시스템(TEMCA2)31과 같은 특수 장비를 사용하여 대용량 샘플 이미징의 고해상도 재구성을 달성하여 짧은 시간에 자동화된 고처리량 이미징을 가능하게 합니다. 그러나 이러한 유형의 이미징은 맞춤형 장비에 대한 요구 사항으로 인해 구하기 쉽고 보편적이라는 장점이 없습니다.

TEM과 비교하여, SEM(32,33)에 기초하여 넓은 영역에 대한 수천 개의 직렬 체적 이미지를 자동으로 생성하는 방법은 직렬 이미징의 효율성 및 신뢰성을 향상시키고, 더 높은 z-해상도(34)를 제공한다. 예를 들어, 직렬 블록면 주사 전자 현미경 (SBF-SEM)과 집속 이온 빔 주사 전자 현미경 (FIB-SEM)은 모두 고속, 효율성 및 해상도 35,36으로 미세 구조의3D 재구성을 가능하게했습니다. 그러나 SBF-SEM의 다이아몬드 나이프 또는 FIB-SEM33,37의 집속 이온 빔으로 밀링하여 블록 표면을 기계적으로 깎는 것은 불가피합니다. 샘플에 대한 두 가지 방법의 파괴성으로 인해 추가 분석을 위해 동일한 표적 구조를 다시 재구성 할 수 없습니다38,39,40. 또한, 병리학적 변화를 관찰하기 위해 EM을 사용하여 암세포의 3차원 소기관 미세구조를 재구성하려는 연구는 거의 없었다12. 이러한 이유로 췌장암 세포와 같은 암세포의 병리학적 기전을 더 명확히 하기 위해 울트라마이크로톰과 전계 방출 주사 전자 현미경(FE-SEM)을 사용하여 연속 단면 이미지를 3D로 재구성하는 새로운 기술을 제안합니다. 이 기술을 사용하면 효율적이고 접근 가능한 방법을 사용하여 고해상도 데이터를 획득할 수 있습니다. 울트라마이크로톰(ultramicrotome)을 사용하여 만든 직렬 초박형 절편은 그리드 케이스에 반영구적으로 저장될 수 있으며, 몇 년 후에도 여러 번 재이미징할 수 있다(41). FE-SEM은 고해상도 이미징, 고배율 및 다용성을 제공하는 능력으로 인해 다양한 연구 분야에서 도구로서 높은 평가를 받고 있습니다42. 세포 소기관의 미세 구조를 3D로 표시하기 위한 시도로, FE-SEM(43,44)에 의해 생성된 후방 산란 전자를 사용하여 유용한 해상도를 갖는 직렬 2D 이미지 스택을 생성하는 기술은 또한 특수 장비(45) 없이 표적 영역 또는 관련 구조의 높은 처리량 및 다중 스케일 이미징을 달성하는 데 사용될 수 있다. 전하 아티팩트의 생성은 획득된 이미지의 품질에 직접적인 영향을 미치므로 체류 시간을 짧게 유지하는 것이 특히 중요합니다.

따라서, 본 연구는 미토콘드리아 크리스타46의 3D 구조를 재구성하기 위해 이 SEM 기술에 사용된 실험 절차에 대해 자세히 설명합니다. 특히, 미토콘드리아 영역의 반자동 분할을 달성하고 Amira 소프트웨어를 사용하여 3D 재구성을 디지털화하기 위해 개발된 프로세스를 보여주며, 여기에는 기존의 OTO 표본 준비 방법44,47을 사용하여 슬라이스 샘플을 만들고, 울트라마이크로톰 슬라이싱을 사용하여 섹션 수집을 완료하고, FE-SEM으로 순차적 2D 데이터를 획득하는 것도 포함됩니다.

프로토콜

1. 재료 준비

  1. 12mL의 DMEM 배지(10% 소 태아 혈청 및 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신)에서 2 x 106 Panc02 세포를 배양하고 48시간 동안 5% 이산화탄소 및 95% 공기의 분위기에서 37°C 및 95% 습도를 유지합니다.
  2. Panc02 세포를 수집하고 28 x g 에서 2분 동안 원심분리한 다음 상층액을 버립니다. 샘플의 크기가 적절한지 확인하십시오(1 x 107 셀), 그렇지 않으면 다음 고정 및 탈수 단계가 제대로 작동하지 않습니다.
  3. 2.5% 글루타르알데히드 1mL를 고정액으로 첨가하여 신선한 Panc02 세포를 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 4°C에서 밤새 고정합니다.
    알림: 샘플은 다음 단계(1,006-5단계)에서 1.3분 동안 1.11 x g 로 원심분리해야 합니다.
  4. 고정액을 흡인하고, 시료를 0.1 M 인산염 완충 식염수(PBS)로 2회 헹구고, 실온에서 각각 10분 동안 이중 증류수(ddH2O)로 2회 헹구었다.
  5. 1% 사산화오스뮴(OsO4)과 1.5% 페로시안화 칼륨을 포함하는 용액 50μL를 4°C에서 1:1의 비율로 1시간 동안 추가합니다. 이어서, 매번 10분 동안 0.1 M PBS로 2회 헹구고,ddH2O로 10분 더 헹구었다.
  6. 1 % thiocarbohydrazide (TCH) 1 mL를 첨가하고, 실온에서 30 분 내지 1 시간 동안 배양 한 후, ddH2O로 4 회 10 분 동안 헹구었다.
  7. 50 μL의 1 % OsO 4를 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 고정 한 다음, ddH2O로 매번 10 분 동안4 회 헹구었다.
  8. 4°C에서 하룻밤 동안 2% 우라닐 아세테이트 1mL를 첨가한 다음,ddH2O로 4회 10분 동안 헹구었다.
  9. 1°C에서 1mL의 Walton 용액(0.066g의 질산납을 0.03mol/L 아스파라긴산 원액 10mL에 용해)을 추가하여 1시간 동안 추가로 배양합니다.
  10. ddH2O로 매번 10분 동안 4회 헹구고, 그 후 매번 10분 동안 등급이 매겨진 알코올 시리즈로 탈수한다: 50% 알코올, 70% 알코올, 80% 알코올, 90% 알코올 1x 및 100% 알코올 2x. 그런 다음 매번 100% 아세톤에서 10분 동안 두 번 탈수합니다. 탈수를 위해 각 용액 1mL를 사용하십시오.
  11. 200μL의 아세톤을 Pon 812 에폭시 수지와 3:1, 1:1 및 1:3의 비율로 혼합합니다. 샘플을 실온에서 각각 2시간, 4시간 및 4시간 동안 수지에 담근 다음 100% Pon 812 에폭시 수지를 취하여 밤새 함침시킵니다.
    알림: 염색 및 수지 포매 단계를 수행할 때 흄 후드는 독성 물질이므로 작동하는 것이 중요합니다. 또한 실험 중에는 실험복과 내용제성 장갑을 착용해야 합니다.
  12. 시편을 매립 몰드에 넣은 다음 60°C의 오븐에 48시간 동안 넣어 중합합니다. 플랫 임베딩29 를 사용하여 샘플 주변의 수지 모양을 줄입니다. 이는 시편 설치를 단순화하고 후속 이미지 분할에 대한 대전 아티팩트의 영향을 줄입니다.
    참고: 연속적으로 수평 절단면을 생성하기 위해 금형 구멍에 소량의 수지를 추가할 수 있으며 과도하게 채우지 않도록 주의해야 합니다.
  13. 먼저 실리콘 웨이퍼를 세척한 다음 농축된 H2SO4/H 2 O2용액으로 30분 동안 친수성화하여 실리콘 웨이퍼를 준비합니다. 친수화된 실리콘 웨이퍼 상에 70 nm 두께의 스트립을 울트라마이크로톰을 이용하여 연속적으로 슬라이스하고, 이를 60°C 오븐에서 10분 동안 건조시켰다.
    알림: 슬라이스 손실이나 변형을 방지하기 위해 슬라이스가 웨이퍼 표면에 떠 있을 때 슬라이스를 천천히 캡처합니다.

2. 이미지 획득 및 3차원 재구성

  1. 스테이지에 실리콘 웨이퍼를 장착하기 전에 섹션을 증류수로 세 번 세척하고 자연 건조합니다. 전도성 탄소 테이프를 1cm x 0.5cm 크기로 자르고 실리콘 웨이퍼와 SEM 시편 스테이지 사이에 붙여서 샘플 설정을 완료합니다(그림 2E).
  2. FE-SEM 가속 전압 파라미터를 2mm의 작동 거리에서 4kV로 설정합니다(그림 3B 및 표 1).
    알림: 신호 대 잡음비를 개선하고 이미지의 노이즈를 줄이려면 가능하면 낮은 배율로 관찰하십시오. 배수가 증가함에 따라 SEM의 스캐닝 범위가 감소하여 이미지에 대한 전하 축적이 증가합니다.
  3. 상단 메뉴 표시줄에서 H/L 아이콘을 클릭합니다. 먼저 저배율에서 대상 슬라이스 스트립의 첫 번째 섹션의 방향을 지정한 다음 H/L 옵션(그림 3A)을 다시 클릭하여 고배율 모드로 전환합니다. 이미지 밝기, 대비 및 배율을 조정하여 관심 있는 구조에 적합한 이미지를 수집합니다.
  4. 프로젝트 보기(Project View) > 오픈 데이터(Open Data)를 선택하고 분석할 이미지 파일을 소프트웨어로 가져옵니다.
  5. 슬라이스 정렬(Align Slices) > 편집(Edit)(그림 4B)을 클릭하여 사진을 정렬하고 이미지 투명도를 수정하여 왼쪽 하단 메뉴 모음에서 강도 범위(Intensity Range) 값을 조정합니다. 여기서는 반자동 정렬 전략을 사용합니다. 특히 자동 정렬을 통해 사진이 이전 그림과 겹치도록 한 다음 수동 미세 조정을 수행합니다.
    참고: 이 작업에서는 정렬 과정에서 이전 이미지를 참조로 사용하고 이동 및 회전 작업을 활용하여 두 이미지의 대상 구조를 최대한 겹쳤습니다. 현재 슬라이스 쌍 정렬을 클릭하면 이미지를 자동으로 정렬하는 데 도움이 될 수 있지만 잘못된 배치가 발생할 수 있습니다.
  6. 하위 볼륨 추출 모듈을 선택하고 정렬된 데이터 세트를 전체 스택의 겹치는 부분의 크기에 맞게 자릅니다.
  7. Segmentation 하위 섹션(그림 4C)에서 Resample > Segmentation(세그멘테이션) > Save(저장)를 선택합니다. 마술 지팡이의 임계 값과 브러시 도구의 크기를 선택하여 올바른 범위를 선택하십시오. 여기서도 먼저 마술 지팡이를 사용하여 적절한 넓은 영역을 자동으로 선택한 다음 브러시를 사용하여 세부 사항을 정확하게 설명하는 반자동 분할 방법을 채택합니다.
    참고 : Magic Wand 는 마스킹 값을 변경하고 Draw Limit Line을 사용하여 관심 구조와 주변 구조 사이에 존재하는 픽셀 강도의 명백한 차이를 기반으로 세그먼트 이미지에 적용 할 수 있습니다. 이미지 획득 중에 생성된 충전 아티팩트를 구별할 수 없습니다. 따라서 대상 지역에 대한 잘못된 조각화가 발생할 수 있습니다. 브러시 도구를 사용하여 생물학적 구조를 정확하게 재구성하기 위해 수동으로 분할할 수 있습니다.
  8. Segmentation > Selection(선택)에서 + 아이콘을 클릭하여 선택한 영역을 추가합니다(그림 4C).
  9. 위의 단계(2.8)를 반복하여 관심 있는 미세 구조를 재구성하기 위한 선택이 완료될 때까지 다른 이미지에서 동일한 대상 구조를 선택합니다.
    참고: 미토콘드리아 리모델링 과정 동안 대상 물체의 선택은 순차적 이미지 그룹의 중간에 있는 그림에서 수행되어야 합니다. 첫 번째 또는 마지막 그림에서 필요한 영역을 선택하면 재구성 결과가 완전한 3D 시각화를 제공 할 수 없습니다.
  10. 지역 분할을 완료한 후 개체 크기 및 사진 해상도에 대한 최상의 결과에 따라 이미지 파일을 생성합니다. 자르기 편집기(Crop Editor)를 클릭한 다음 가상 슬라이더(Virtual Slider ) 상자에 숫자 6을 입력합니다(그림 4C).
  11. 왼쪽의 드롭다운 메뉴에서 프로젝트(Project ) 하위 섹션 아래의 회색 영역을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 서피스 생성(Generate Surface) > 생성(Create) > 적용(Apply)을 선택합니다. 생성된 파일에서 지표면 뷰 모듈을 사용하여 지표면 구조와 3D 표현을 작성합니다.

3. 정량화

  1. Remove Small Spots(작은 반점 제거)> Apply(적용)를 클릭합니다(그림 4D). 프로젝트 하위 섹션에서 회색 영역을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 레이블 분석 > 적용을 선택합니다(그림 4D).
  2. 열의 이름을 사용자 지정하고 측정값 그룹을 선택합니다. 기본 측정(Native Measurements) 상자에서 볼륨3d(Volume3d) 및 길이3d(Length3d)를 선택합니다.
  3. 화면 왼쪽 하단 모서리에 있는 적용 버튼을 클릭합니다. 데이터를 복사하고 GraphPad와 같은 통계 소프트웨어에서 그래프를 작성합니다.

결과

세포 배양 중(그림 1A), 먼저 췌장암 세포를 완전 배양 배지로 배양한 대조군, (1S,3R)-RSL348(RSL3, 페롭토시스 활성제, 100nM) 그룹 및 RSL3(100nM)와 페로스타틴-149(Fer-1, 페롭토시스 억제제, 100nM) 그룹으로 나누었습니다. 상기의 실험 단계를 통해, 주사전자현미경은 대조군, RSL3군, 억제제군(RSL3+Fer-1기)에 대한 38(보충도 1), 43(보충?...

토론

여기에 제시된 방법은 직렬 초박형 섹션에서 생성된 2D 단층 촬영 이미지의 적층 및 분할에 전자 현미경 및 이미지 처리 기술을 적용하는 것과 관련된 3D 재구성 기술을 적용하기 위한 유용한 단계별 가이드입니다. 이 프로토콜은 세포 소기관 미세 구조의 3D 시각화로 해결할 수 있는 2D 이미지의 한계를 강조하며, 이는 고해상도 수준에서 구조의 강력한 재현성과 더 높은 정확도의 장점이 있습니다....

공개

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

감사의 말

이 연구는 절강성 자연과학재단(Natural Science Foundation of Zhejiang Province) 보조금(Z23H290001, LY19H280001)의 지원을 받았습니다. 중국 국립 자연 과학 재단 보조금 (82274364, 81673607 및 81774011); Huzhou 과학 기술 보조금의 공공 복지 연구 프로젝트(2021GY49, 2018GZ24). 절강 중국 의과 대학 중국 의학 아카데미 의학 연구 센터 공공 플랫폼의 큰 도움, 기술 지원 및 실험 지원에 감사드립니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
(1S,3R)-RSL3MCEHY-100218A
AcetoneSIGMA179124
AmiraVisage Imaging2020.2
Aspartic acidMCEHY-42068
Dulbecco's modified Eagle’s mediumGibco11995115
EthanolMerck100983
Ferrostatin-1MCEHY-100579
Fetal bovine serumGibco10437010
Field emission scanning electron microscopeHITACHISU8010
GlutaraldehydeAlfa AesarA10500.22
Lead nitrateSANTA CRUZsc-211724
Osmium TetroxideSANTA CRUZsc-206008B
Panc02European Collection of Authenticated Cell Cultures 98102213
Penicillin-streptomycinBiosharpBL505A
Phosphate Buffered SalineBiosharpBL302A
Pon 812 Epoxy resinSPI CHEMGS02660
Potassium ferrocyanideMacklinP816416
ThiocarbohydrazideMerck223220
UltramicrotomeLEICAEMUC7
Uranyl AcetateRHAWNR032929

참고문헌

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