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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt, wie mitochondriale Cristae rekonstruiert werden, um eine 3D-Bildgebung mit hoher Genauigkeit, hoher Auflösung und hohem Durchsatz zu erreichen.

Zusammenfassung

Das Verständnis der dynamischen Eigenschaften der Ultrastruktur der Zellorganellen, die nicht nur reich an unbekannten Informationen ist, sondern auch aus einer dreidimensionalen (3D) Perspektive anspruchsvoll ist, ist für mechanistische Studien von entscheidender Bedeutung. Die Elektronenmikroskopie (EM) bietet eine gute Abbildungstiefe und ermöglicht die Rekonstruktion hochauflösender Bildstapel, um die ultrastrukturelle Morphologie von Zellorganellen auch auf der Nanometerskala zu untersuchen. daher gewinnt die 3D-Rekonstruktion aufgrund ihrer unvergleichlichen Vorteile an Bedeutung. Die Rasterelektronenmikroskopie (REM) bietet eine Hochdurchsatz-Bilderfassungstechnologie, die es ermöglicht, große Strukturen in 3D aus demselben interessierenden Bereich in aufeinanderfolgenden Schichten zu rekonstruieren. Daher wird die Anwendung von REM in der großflächigen 3D-Rekonstruktion zur Wiederherstellung der echten 3D-Ultrastruktur von Organellen immer häufiger. In diesem Protokoll schlagen wir eine Kombination aus seriellen Ultradünnschnitt- und 3D-Rekonstruktionstechniken vor, um mitochondriale Cristae in Bauchspeicheldrüsenkrebszellen zu untersuchen. Die Details, wie diese Techniken durchgeführt werden, werden in diesem Protokoll Schritt für Schritt beschrieben, einschließlich der Osmium-Thiocarbohydrazid-Osmium (OTO)-Methode, der seriellen Ultradünnschnitt-Bildgebung und der Visualisierungsanzeige.

Einleitung

Mitochondrien sind eines der wichtigsten Organellen in der Zelle. Sie dienen als zentraler Knotenpunkt der zellulären Bioenergetik und des Stoffwechsels 1,2 und spielen eine entscheidende Rolle bei Krebs3. Bauchspeicheldrüsenkrebs (PC) ist aufgrund seiner schnellen Ausbreitung und hohen Sterblichkeitsrate eine der am schwierigsten zu behandelnden Krebsarten4. Die mitochondriale Dysfunktion, die hauptsächlich durch Veränderungen in der mitochondrialen Morphologie verursacht wird 3,5,6,7, wurde mit den Krankheitsmechanismen in Verbindung gebracht, die PC8 zugrunde liegen. Mitochondrien sind auch sehr dynamisch, was sich in den häufigen und dynamischen Veränderungen ihrer Netzwerkkonnektivität und Kristallstruktur widerspiegelt9. Die Umformung der Cristae-Struktur kann sich direkt auf die mitochondriale Funktion und den Zellzustand auswirken 10,11, die während des Wachstums von Tumorzellen, der Metastasierung und der Veränderungen der Tumormikroumgebung signifikant verändert werden 12,13.

In den letzten Jahren haben Wissenschaftler dieses Organell mit Hilfe der EM-Beobachtung 14,15,16,17 untersucht; Zum Beispiel haben Forscher die mitochondriale Dynamik mit Hilfe von 3D-Rekonstruktionstechniken analysiert 6,7,18,19. Das allgemeine Konzept und die Methode für die 3D-Rekonstruktion von elektronenmikroskopischen Bildern wurden bereits 196820 formell festgelegt und beinhalteten die Kombination von Elektronenmikroskopie, Elektronenbeugung und Computerbildverarbeitung zur Rekonstruktion des T4-Phagenschwanzes. Bisher hat die elektronenmikroskopische 3D-Bildgebungstechnologie erhebliche Fortschritte in Bezug auf die Bildauflösung21, den Automatisierungsgrad 22 und das Verarbeitungsvolumen 23 gemacht und wird in der biologischen Forschung in immer breiterem Maßstab eingesetzt, von der Gewebeebene bis zur Organellen-Ultrastrukturebene auf der Nanometerskala24. In den letzten Jahren hat sich auch die elektronenmikroskopische 3D-Bildgebung zu einer vielversprechenden Technologie für eine Vielzahl von Anwendungen entwickelt25,26,27.

Die wachsende Aufmerksamkeit für mitochondriale Cristae verdeutlicht insbesondere die wesentlichen Anforderungen an die ultrastrukturelle Volumenbildgebung. Die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) wurde verwendet, um Proben zu visualisieren, die auf einem Kupfergitter (400 Mesh)28 gesammelt wurden, wobei der Elektronenstrahl durch den Abschnitt verläuft. Aufgrund des begrenzten Bereichs des Kupfergitters ist es jedoch unmöglich, kontinuierliche Schichten derselben Probe29 vollständig abzubilden. Dies erschwert die Untersuchung von Zielstrukturen während der TEM-Bildgebung. Darüber hinaus stützt sich die TEM auf zeitaufwändige und fehleranfällige manuelle Aufgaben, einschließlich des Schneidens und Sammelns mehrerer Schichten und deren sequentieller Abbildung21, so dass sie nicht für ultrastrukturelle Rekonstruktionen großvolumiger Proben geeignet ist23. Gegenwärtig wird die hochauflösende Rekonstruktion von großvolumigen Probenbildern durch den Einsatz von Spezialgeräten wie dem TEM-Kameraarray (TEMCA)30 oder zwei TEMCA-Systemen der zweiten Generation (TEMCA2)31 erreicht, die eine automatisierte Hochdurchsatz-Bildgebung in kurzer Zeit ermöglichen. Diese Art der Bildgebung hat jedoch nicht den Vorteil, dass sie leicht zu erhalten und universell ist, da eine maßgeschneiderte Ausrüstung erforderlich ist.

Im Vergleich zur TEM verbessert das Verfahren zur automatischen Erzeugung von Tausenden von seriellen volumetrischen Bildern für große Flächen auf der Grundlage von REM 32,33 die Effizienz und Zuverlässigkeit der seriellen Bildgebung und liefert höhere z-Auflösungen34. So haben beispielsweise die serielle Block-Face-Rasterelektronenmikroskopie (SBF-SEM) und die fokussierte Ionenstrahl-Rasterelektronenmikroskopie (FIB-SEM) die 3D-Rekonstruktion von Ultrastrukturen mit hoher Geschwindigkeit, Effizienz und Auflösung möglichgemacht 35,36. Es ist jedoch unvermeidlich, dass die Blockoberfläche mechanisch durch das Diamantmesser des SBF-REM oder durch Fräsen mit dem fokussierten Ionenstrahl des FIB-SEM33,37 abrasiert wird. Aufgrund der Destruktivität der beiden Methoden für die Proben ist es nicht möglich, dieselbe Zielstruktur für die weitere Analyse erneut zu rekonstruieren 38,39,40. Darüber hinaus haben nur wenige Studien versucht, die 3D-Organellen-Ultrastruktur von Krebszellen mit Hilfe von EM zu rekonstruieren, um pathologische Veränderungen zu beobachten12. Um die pathologischen Mechanismen von Krebszellen, wie z.B. Bauchspeicheldrüsenkrebszellen, weiter aufzuklären, schlagen wir aus diesen Gründen eine neuartige Technologie für die 3D-Rekonstruktion von Serienschnittbildern mit einem Ultramikrotom und einem Feldemissions-Rasterelektronenmikroskop (FE-SEM) vor, um die mitochondriale Ultrastruktur auf Cristae-Ebene zu analysieren; Mit dieser Technologie können hochauflösende Daten mit einer effizienten und zugänglichen Methode erfasst werden. Die mit einem Ultramikrotom hergestellten seriellen ultradünnen Schnitte können semi-permanent in einem Gittergehäuse aufbewahrt und auch nach mehreren Jahren mehrfach reimaginiert werden41. FE-REM wird aufgrund seiner Fähigkeit, hochauflösende Bildgebung, hohe Vergrößerung und Vielseitigkeit zu liefern, als Werkzeug in verschiedenen Forschungsbereichen sehr geschätzt42. Bei dem Versuch, die Feinstruktur von Organellen in 3D darzustellen, kann die Technik zur Erzeugung serieller 2D-Bildstapel mit brauchbarer Auflösung unter Verwendung von rückgestreuten Elektronen, die durch FE-SEM43,44 erzeugt werden, auch verwendet werden, um eine Hochdurchsatz- und Multiskalen-Bildgebung von Zielregionen oder den zugehörigen Strukturen ohne spezielle Ausrüstung 45 zu erreichen. Die Erzeugung von Ladungsartefakten wirkt sich direkt auf die Qualität der aufgenommenen Bilder aus, daher ist es besonders wichtig, die Verweilzeit kurz zu halten.

Die vorliegende Studie befasst sich daher mit den experimentellen Verfahren, die in dieser REM-Technik zur Rekonstruktion der 3D-Struktur der mitochondrialen Cristaeeingesetzt werden 46. Insbesondere zeigen wir den Prozess, der entwickelt wurde, um die halbautomatische Segmentierung von Mitochondrienregionen zu erreichen und die 3D-Rekonstruktion mit der Amira-Software zu digitalisieren, was auch die Herstellung von Schnittproben mit der konventionellen OTO-Probenvorbereitungsmethode44,47, die Vervollständigung der Schnittentnahme mittels Ultramikrotom-Slicing und die Erfassung sequentieller 2D-Daten durch FE-SEM beinhaltet.

Protokoll

1. Vorbereitung des Materials

  1. 2 x 106 Panc02-Zellen in 12 ml DMEM-Medium (10 % fötales Kälberserum und 100 U/ml Penicillin-Streptomycin) kultivieren und 48 Stunden lang bei 37 °C und 95 % Luftfeuchtigkeit in einer Atmosphäre von 5 % Kohlendioxid und 95 % Luft aufbewahren.
  2. Panc02-Zellen werden gesammelt, 2 Minuten lang bei 28 x g zentrifugiert und dann der Überstand verworfen. Stellen Sie sicher, dass die Probe eine angemessene Größe hat (1 x 107 Zellen), da sonst die folgenden Fixierungs- und Dehydratisierungsschritte nicht gut funktionieren.
  3. Fügen Sie 1 ml 2,5%iges Glutaraldehyd als Fixiermittel hinzu, um die frischen Panc02-Zellen in den 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen über Nacht bei 4 °C zu fixieren.
    HINWEIS: Die Proben müssen in jedem der folgenden Schritte (Schritte 1.3-1.11) 5 Minuten lang bei 1.006 x g zentrifugiert werden.
  4. Das Fixiermittel wird abgesaugt und die Proben zweimal mit 0,1 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gespült und dann zweimal mit doppelt destilliertem Wasser (ddH2O) bei Raumtemperatur jeweils 10 min lang gespült.
  5. 50 μl einer Lösung mit 1 % Osmiumtetroxid (OsO 4) und 1,5 % Kaliumferrocyanid im Verhältnis 1:1 bei4 °C für 1 h zugeben. Dann zweimal mit 0,1 M PBS für jeweils 10 Minuten spülen und weitere 10 Minuten mit ddH2O spülen.
  6. 1 ml 1%iges Thiocarbohydrazid (TCH) zugeben, bei Raumtemperatur 30 min bis 1 h inkubieren und dann viermal jeweils 10 min mit ddH2Ospülen.
  7. 50 μl 1%igeOsO4 zugeben, 1 h bei Raumtemperatur fixieren und dann viermal für jeweils 10 min mit ddH2O spülen.
  8. 1 ml 2%iges Uranylacetat bei 4 °C über Nacht zugeben und dann viermal für jeweils 10 min mit ddH2O spülen.
  9. 1 ml Walton-Lösung (0,066 g Bleinitrat, gelöst in 10 ml 0,03 mol/l Asparaginsäure-Stammlösung) bei 60 °C für weitere 1 h Inkubation zugeben.
  10. Spülen Sie mit ddH2O viermal für jeweils 10 Minuten und dehydrieren Sie dann in einer abgestuften Alkoholserie für jeweils 10 Minuten: 50 % Alkohol, 70 % Alkohol, 80 % Alkohol und 90 % Alkohol 1x und 100 % Alkohol 2x. Dann zweimal für jeweils 10 Minuten in 100% Aceton dehydrieren. Verwenden Sie 1 ml jeder Lösung für die Dehydrierung.
  11. Mischen Sie 200 μl Aceton mit Pon 812 Epoxidharz im Verhältnis 3:1, 1:1 und 1:3. Weichen Sie die Probe 2 h, 4 h bzw. 4 h in Harz bei Raumtemperatur ein und imprägnieren Sie dann das 100%ige Pon 812 Epoxidharz über Nacht.
    HINWEIS: Bei der Durchführung der Färbe- und Harzeinbettungsschritte ist es wichtig, in einem Abzug zu arbeiten, da es sich um giftige Substanzen handelt. Zusätzlich müssen während des Experiments Laborkittel und lösungsmittelbeständige Handschuhe getragen werden.
  12. Die Proben werden in eine Einbettform gegeben und dann 48 h lang bei 60 °C in einen Ofen gegeben, um zu polymerisieren. Verwenden Sie die flache Einbettung29 , um das Erscheinungsbild von Harz um die Probe herum zu reduzieren. Dies vereinfacht die Installation der Probe und verringert die Auswirkungen von Ladeartefakten auf die anschließende Bildsegmentierung.
    HINWEIS: Um anschließend eine horizontale Schnittfläche zu erzeugen, kann eine kleine Menge Harz in das Formloch gegeben werden, wobei darauf zu achten ist, dass es nicht überfüllt wird.
  13. Bereiten Sie Siliziumwafer vor, indem Sie sie zuerst waschen und dann 30 Minuten lang mit einer konzentriertenH2SO4/H2O2-Lösunghydrophilieren. Auf den hydrophilisierten Siliziumwafern werden mit einem Ultramikrotom seriell geschnittene Streifen mit einer Dicke von 70 nm gesammelt und 10 Minuten lang in einem 60 °C heißen Ofen getrocknet.
    HINWEIS: Fangen Sie die Schicht langsam auf, während die Schicht auf die Oberfläche der Wafer schwimmt, um Schichtverlust oder Verformung zu vermeiden.

2. Bildaufnahme und dreidimensionale Rekonstruktion

  1. Bevor Sie einen Siliziumwafer auf den Tisch montieren, waschen Sie die Abschnitte dreimal mit destilliertem Wasser und trocknen Sie sie an der Luft. Schneiden Sie ein leitfähiges Kohlenstoffband mit einer Größe von 1 cm x 0,5 cm ab und kleben Sie es zwischen den Siliziumwafer und den REM-Probentisch, um den Probenaufbau zu vervollständigen (Abbildung 2E).
  2. Stellen Sie den Parameter FE-SEM Beschleunigungsspannung auf 2 kV bei einem Arbeitsabstand von 4 mm ein (Bild 3B und Tabelle 1).
    HINWEIS: Um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern und das Rauschen im Bild zu reduzieren, sollten Sie nach Möglichkeit bei niedrigen Vergrößerungen beobachten. Mit zunehmendem Vielfachen nimmt die Reichweite des REM ab, was zu einer Zunahme der Ladungsakkumulation auf den Bildern führt.
  3. Klicken Sie auf das H/L-Symbol in der oberen Menüleiste. Richten Sie zunächst bei niedriger Vergrößerung den ersten Abschnitt der Zielschichtstreifen aus und klicken Sie dann erneut auf die Option H/L (Abbildung 3A), um in den Modus mit hoher Vergrößerung zu wechseln. Erfassen Sie ein geeignetes Bild für die gewünschte Struktur, indem Sie die Bildhelligkeit, den Kontrast und die Vergrößerung anpassen.
  4. Wählen Sie Projektansicht > Open Data und importieren Sie die zu analysierenden Bilddateien in die Software.
  5. Richten Sie die Bilder aus, indem Sie auf " Slices ausrichten" > "Bearbeiten " klicken (Abbildung 4B), und passen Sie den Wert für den Intensitätsbereich in der unteren linken Menüleiste an, indem Sie die Bildtransparenz ändern. Verwenden Sie hier eine halbautomatische Ausrichtungsstrategie. Insbesondere durch die automatische Ausrichtung, lassen Sie die Bilder mit einem vorherigen Bild überlappen, und führen Sie dann eine manuelle Feinabstimmung durch.
    ANMERKUNG: In dieser Arbeit wurde während des Ausrichtungsprozesses das vorherige Bild als Referenz verwendet, und die Verschiebungs- und Drehvorgänge wurden verwendet, um die Zielstruktur der beiden Bilder maximal zu überlappen. Ein Klick auf Aktuelles Slice-Paar ausrichten kann helfen, die Bilder automatisch auszurichten, aber es kann zu einer Fehlplatzierung kommen.
  6. Wählen Sie das Modul Subvolume extrahieren aus, und schneiden Sie die ausgerichteten Datensätze so zu, dass sie in die Größe des überlappenden Teils des gesamten Stapels passen.
  7. Wählen Sie im Unterabschnitt "Segmentierung" (Abbildung 4C) die Option "Resample" > "Segmentierung" > "Speichern" aus. Wählen Sie den Schwellenwert des Zauberstabs und die Größe des Pinselwerkzeugs, um den richtigen Bereich auszuwählen. Wenden Sie auch hier eine halbautomatische Segmentierungsmethode an, indem Sie zuerst den Zauberstab verwenden, um automatisch einen geeigneten großen Bereich auszuwählen, und dann den Pinsel verwenden, um die Details genau zu beschreiben.
    HINWEIS: Der Zauberstab kann angewendet werden, um Bilder basierend auf den offensichtlichen Unterschieden in der Pixelintensität zwischen der interessierenden Struktur und den umgebenden Strukturen zu segmentieren, indem der Maskierungswert geändert und die Zeichnungsbegrenzungslinie verwendet wird. Es ist nicht in der Lage, die bei der Bildaufnahme erzeugten Ladungsartefakte zu unterscheiden. Daher kann es zu einer falschen Segmentierung für die Zielregionen kommen. Mit dem Pinselwerkzeug können Sie manuell segmentieren, um die biologischen Strukturen genau zu rekonstruieren.
  8. Klicken Sie unter Segmentierung > Auswahl auf das + -Symbol, um den ausgewählten Bereich hinzuzufügen (Abbildung 4C).
  9. Wiederholen Sie den obigen Schritt (2.8), um dieselbe Zielstruktur in verschiedenen Bildern auszuwählen, bis die Auswahl für die Rekonstruktion der interessierenden Mikrostrukturen abgeschlossen ist.
    HINWEIS: Während der mitochondrialen Umbauprozesse muss die Auswahl des Zielobjekts aus dem Bild in der Mitte einer Gruppe von aufeinanderfolgenden Bildern durchgeführt werden. Wenn der gewünschte Bereich aus dem ersten oder letzten Bild ausgewählt wird, kann das Rekonstruktionsergebnis keine vollständige 3D-Visualisierung darstellen.
  10. Nachdem Sie die regionale Segmentierung abgeschlossen haben, generieren Sie die Bilddatei nach den besten Ergebnissen für die Größe des Objekts und die Bildauflösung. Klicken Sie auf Zuschneide-Editor, und geben Sie dann die Zahl 6 in das Feld "Virtueller Schieberegler " ein (Abbildung 4C).
  11. Klicken Sie im Dropdown-Menü auf der linken Seite mit der rechten Maustaste auf den grauen Bereich unter dem Unterabschnitt Projekt , und wählen Sie Oberfläche generieren > Erstellen > Anwenden. Verwenden Sie in der generierten Datei das Modul Oberflächenansicht , um die Oberflächenstruktur und die 3D-Darstellung zu erstellen.

3. Quantifizierung

  1. Klicken Sie auf Kleine Flecken entfernen > anwenden (Abbildung 4D). Klicken Sie im Unterabschnitt Projekt mit der rechten Maustaste auf den grauen Bereich, und wählen Sie Beschriftungsanalyse > Anwenden (Abbildung 4D).
  2. Passen Sie den Namen der Spalte an, und wählen Sie eine Measuregruppe aus. Wählen Sie Volume3d und Length3d aus dem Feld Native Maße aus.
  3. Klicken Sie auf die Schaltfläche Übernehmen in der unteren linken Ecke des Bildschirms. Kopieren Sie die Daten und das Diagramm in der Statistiksoftware, z. B. GraphPad.

Ergebnisse

Während der Zellkultur (Abbildung 1A) teilten wir die Pankreaskarzinomzellen zunächst in eine Kontrollgruppe, die mit vollständigem Kulturmedium kultiviert wurde, eine (1S,3R)-RSL348 (RSL3, ein Ferroptoseaktivator, 100 nM) Gruppe und eine RSL3 (100 nM) plus Ferrostatin-149 (Fer-1, ein Ferroptose-Inhibitor, 100 nM) Gruppe. Durch die oben genannten experimentellen Schritte nahm das Rasterelektronenmikroskop 38 (ergänzende Abbildung 1), 43 (er...

Diskussion

Die hier vorgestellte Methode ist eine nützliche Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Anwendung der 3D-Rekonstruktionstechnik, bei der Elektronenmikroskopie und Bildverarbeitungstechnologie auf das Stapeln und Segmentieren von 2D-Tomographiebildern angewendet werden, die aus seriellen ultradünnen Schnitten erzeugt werden. Dieses Protokoll hebt eine Einschränkung von 2D-Bildern hervor, die durch die 3D-Visualisierung der Organellen-Ultrastruktur behoben werden kann, was die Vorteile einer starken Reproduzierbarkeit ...

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Danksagungen

Diese Forschung wurde durch Stipendien der Natural Science Foundation der Provinz Zhejiang unterstützt (Z23H290001, LY19H280001); Stipendien der National Natural Science Foundation of China (82274364, 81673607 und 81774011); sowie das Public Welfare Research Project of Huzhou Science and Technology Grant (2021GY49, 2018GZ24). Wir schätzen die großartige Hilfe, technische Unterstützung und experimentelle Unterstützung von der Public Platform of Medical Research Center, Academy of Chinese Medical Science, Zhejiang Chinese Medical University.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
(1S,3R)-RSL3MCEHY-100218A
AcetoneSIGMA179124
AmiraVisage Imaging2020.2
Aspartic acidMCEHY-42068
Dulbecco's modified Eagle’s mediumGibco11995115
EthanolMerck100983
Ferrostatin-1MCEHY-100579
Fetal bovine serumGibco10437010
Field emission scanning electron microscopeHITACHISU8010
GlutaraldehydeAlfa AesarA10500.22
Lead nitrateSANTA CRUZsc-211724
Osmium TetroxideSANTA CRUZsc-206008B
Panc02European Collection of Authenticated Cell Cultures 98102213
Penicillin-streptomycinBiosharpBL505A
Phosphate Buffered SalineBiosharpBL302A
Pon 812 Epoxy resinSPI CHEMGS02660
Potassium ferrocyanideMacklinP816416
ThiocarbohydrazideMerck223220
UltramicrotomeLEICAEMUC7
Uranyl AcetateRHAWNR032929

Referenzen

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