* These authors contributed equally
כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת אורגנואידים במעיים של חולדות ומשתמשים בהם במספר יישומים במורד הזרם. חולדות הן לעתים קרובות מודל פרה-קליני מועדף, ומערכת אורגנואיד המעי החזקה ממלאת את הצורך במערכת חוץ גופית שתלווה מחקרי vivo .
כאשר משתמשים באורגנואידים כדי להעריך פיזיולוגיה והחלטות לגבי גורל התא, חשוב להשתמש במודל שחוזר מקרוב בהקשרים של in vivo . בהתאם לכך, אורגנואידים שמקורם בחולה משמשים למידול מחלות, גילוי תרופות וסינון טיפול מותאם אישית. אורגנואידים של עכברי מעיים משמשים בדרך כלל להבנת היבטים של תפקוד המעי / פיזיולוגיה ודינמיקה של תאי גזע / החלטות גורל. עם זאת, בהקשרים רבים של מחלות, חולדות מועדפות לעתים קרובות על עכברים כמודל בשל הדמיון הפיזיולוגי הגדול יותר שלהן לבני אדם במונחים של פתופיזיולוגיה של מחלות. מודל החולדות הוגבל בשל מחסור בכלים גנטיים זמינים in vivo, ואורגנואידים של חולדות במעיים הוכחו כשבריריים וקשים לתרבית לטווח ארוך. כאן, אנו מתבססים על פרוטוקולים שפורסמו בעבר כדי ליצור אורגנואידים של חולדות מהתריסריון והג'ג'ונום. אנו מספקים סקירה כללית של מספר יישומים במורד הזרם המשתמשים באורגנואידים של מעי חולדות, כולל בדיקות נפיחות פונקציונליות, צביעת הר שלם, יצירת חד-שכבות אנטרואידים דו-ממדיות והתמרה לנטיוויראלית. מודל אורגנואיד החולדות מספק פתרון מעשי לצורך של השדה במודל in vitro השומר על רלוונטיות פיזיולוגית לבני אדם, ניתן למניפולציה גנטית מהירה, וניתן להשיגו בקלות ללא המחסומים הכרוכים ברכישת אורגנואידים במעי אנושי.
ארכיטקטורת אפיתל המעי הדק האנושית והרכב התאים מורכבים, ומשקפים את תפקודיהם הפיזיולוגיים. תפקידו העיקרי של המעי הדק הוא לספוג חומרים מזינים מהמזון העובר דרך לומן1. כדי למקסם את הפונקציה הזו, פני השטח של המעי מאורגנים בבלטות דמויות אצבע שנקראות וילי (villi), המגדילות את שטח הפנים הספיגה, ובליטות דמויות הנקראות קריפטות (crypts), המאחסנות ומבודדות את תאי הגזע. בתוך האפיתל נוצרים סוגים שונים של תאי ספיחה והפרשה מיוחדים לביצוע פונקציות נפרדות1. בגלל מורכבות זו, היה קשה למדל רקמות כמו המעי בקווי תאים אימורטליים בעלי מעבר גבוה. עם זאת, המחקר של תאי גזע, במיוחד תאי גזע בוגרים ומנגנוני ההתמיינות שלהם, איפשר התפתחות של תרביות אורגנואידים במעי 3D. השימוש במודלים אורגנואידים שינה את התחום, בין השאר בשל הסיכום שלהם של כמה מרכיבים אדריכליים והטרוגניות סוג התא שנמצאו במעי השלם. אורגנואידים במעיים יכולים להיות בתרבית לטווח ארוך במבחנה עקב שמירה על אוכלוסיית תאי גזע פעילה2.
אורגנואידים במעיים הפכו במהירות למודל הסתגלות לחקר ביולוגיה של תאי גזע, פיזיולוגיה של התא, מחלות גנטיות ותזונה3,4, כמו גם כלי לפיתוח שיטות חדשות למתן תרופות5. בנוסף, אורגנואידים שמקורם בחולים משמשים למידול מחלות, גילוי תרופות וסינון טיפול מותאם אישית, בין היתר 6,7,8,9. עם זאת, אורגנואידים במעיים אנושיים עדיין מציבים אתגרים. זמינות רקמות, דרישות לאישור ועדת ביקורת מוסדית וסוגיות אתיות מגבילות את השימוש הנרחב בדגימות אנושיות. בנוסף, אורגנואידי מעיים אנושיים הנוצרים מקריפטות מעיים דורשים שני תנאי תרבית נפרדים לשמירה על תאי גזע לא ממוינים או כדי לגרום להתמיינות של סוגי תאים בוגרים10. זאת בניגוד ל-in vivo, שבו תאי גזע וסוגי תאים ממוינים בוגרים נוכחים בו זמנית ונוצרים/מתוחזקים ברציפות1. מצד שני, אורגנואידי מעיים של עכברים, הגדלים בקוקטייל פחות מורכב של גורמי גדילה, אינם דורשים את המתג הזה בהרכב המדיה ויכולים לשמור על תאי גזע ותאים ממוינים באותו הקשר מדיה 2,11. עם זאת, הבדלים עיקריים במעי עכבר בהשוואה לבני אדם יכולים להפוך אורגנואידים של עכברים למודל לא אופטימלי במקרים רבים. באופן כללי, אורגנואידי מעיים רבים מיונקים גדולים יותר, כולל סוסים, חזירים, כבשים, פרות, כלבים וחתולים, נוצרו בהצלחה בתנאי תרבית המיושרים יותר עם אורגנואידים של מעי עכברים מאשר תנאי התרבית של אורגנואידי מעיים אנושיים12. ההבדלים בתנאי גורם הגדילה בין אורגנואידים עכבריים לבני אדם משקפים ככל הנראה הבדלים בהרכב נישות תאי גזע ודרישות שונות להישרדות, שגשוג ותחזוקת תאי גזע. לכן, יש צורך במערכת אורגנואידים מודל נגישה ש-1) דומה מאוד להרכב תאי המעי האנושי, 2) מכילה תאי גזע עם דרישות לגורמי גדילה כמו אלה של אורגנואידים אנושיים במעי, ו-3) מסוגלת לשמור ברציפות על תאים לא ממוינים ומובחנים. באופן אידיאלי, המערכת תהיה ממודל נפוץ של בעלי חיים פרה-קליניים, כך שניתן יהיה לתאם ניסויים in vivo ו-in vitro ולהשתמש בהם במקביל.
חולדות הן מודל פרה-קליני נפוץ למחקרים בפיזיולוגיה של המעי ובפרמקולוגיה בשל פיזיולוגיה וביוכימיה של המעי הדומות מאוד שלהן לבני אדם13, במיוחד בכל הנוגע לחדירות מעיים14. גודלם הגדול יחסית בהשוואה לעכברים הופך אותם לנוחים יותר להליכים כירורגיים. בעוד שלעתים משתמשים במודלים של בעלי חיים גדולים, כולל חזירים, חולדות הן מודל זול יותר, דורשות פחות מקום לגידול, ויש להן זנים סטנדרטיים זמינים מסחרית15. החיסרון בשימוש במודלים של חולדות הוא שערכת הכלים הגנטית למחקרי in vivo אינה מפותחת היטב בהשוואה לעכברים, ויצירת קווי חולדות חדשניים, כולל נוקאאוטים, נוק-אין ומהונדסים, היא לעתים קרובות יקרה. פיתוח ואופטימיזציה של מודל אורגנואיד מעיים חזק של חולדות יאפשר מניפולציה גנטית, טיפולים תרופתיים ומחקרי תפוקה גבוהה יותר במודל נגיש השומר על רלוונטיות פיזיולוגית מרכזית לבני אדם. עם זאת, היתרונות של מודל אורגנואיד מכרסם אחד לעומת אחר תלויים מאוד בתהליך או בגן מסוים הנחקר; גנים מסוימים הנמצאים בבני אדם עשויים להיות פסאודוגנים בעכברים, אך לא בחולדות16,17. בנוסף, תת-סוגים ספציפיים של תאים נחשפים יותר ויותר על ידי RNAseq18,19,20 של תא יחיד. לבסוף, מודלים של מחלות מעיים של חולדות ועכבר מציגים לעתים קרובות שינויים ניכרים בפנוטיפים21,22 כך שיש לבחור את המודל המשחזר באופן הדוק יותר את הסימפטומים ואת תהליך המחלה הנראים בבני אדם לעבודה במורד הזרם. יצירת מודל אורגנואיד מעיים של חולדה מספקת גמישות נוספת ובחירה לחוקרים בבחירת מערכת המודל המתאימה ביותר לנסיבות חייהם. כאן, פרוטוקולים קיימים23,24 מורחבים לייצור אורגנואידים במעי חולדות ומתואר פרוטוקול ליצירה ותחזוקה של אורגנואידים במעי חולדות מהתריסריון או הג'ג'ונום. בנוסף, מתוארים מספר יישומים במורד הזרם, כולל זיהום לנטיויראלי, צביעת הר שלם ומבחני נפיחות פורסקולין.
הערה: יש לטפל בכל תרביות התאים בטכניקה אספטית נכונה בתרבית רקמה. כל עבודות בעלי החיים במחקר זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של ייל (IACUC).
1. הכנת ריאגנטים של תרבית תאים
2. הקמת אורגנואידים של חולדה במעי הדק
הערה: פרוטוקול זה שונה משני פרוטוקולים שפורסמו בעבר עבור אורגנואידים של מעי חולדות23,24.
3. אורגנואידים במעיים של חולדות עוברות
4. שימור והפשרה בהקפאה של אורגנואידי מעיים של חולדות
5. יצירת חד-שכבות דו-ממדיות של מעי חולדות מאורגנואידים תלת-ממדיים
הערה: הפרוטוקול הבא מתאר את הנפחים הדרושים ליצירת 24 בארות של צלחת 48 בארות מצופות ב-EME, החל משש כיפות של 50 μL (צלחת של 35 מ"מ) המכילות ~300 אורגנואידים/כיפה במעיים (קנה מידה: כיפה אחת מייצרת ארבע בארות), אך ניתן להגדיל או להקטין אותן לפי הצורך. כפי שנכתב, פרוטוקול זה משיג ~ 80% מפגש תוך 4-5 ימים. במפגש גבוה יותר, התאים מתחילים לרכוש מבנים אורגנואידים תלת-ממדיים שוב. במפגש נמוך (≤40%) , התאים נשארים כחד-שכבות והם בני קיימא במשך ~14 יום. אם מטרת המחקר היא להשתמש בחד-שכבות דו-ממדיות, יש להקטין כך שכיפה אחת תייצר שמונה בארות של צלחת בת 24 בארות. ניתן גם לצפות את הבארות בקולגן I ליצירת חד-שכבות.
6. מניפולציה גנטית
7. אימונופלואורסנציה צביעת הר שלם של אורגנואידים
8. נפיחות הנגרמת על ידי פורסקולין של אורגנואידים במעיים של חולדות
תריסריון חולדות ואורגנואידים ג'ג'ונליים נוצרו באמצעות הפרוטוקול המתואר בסעיף 2. חשוב מאוד במהלך שלבי בידוד הקריפטה כי villi מתרוקנים ביעילות מן PBS. אם יותר מדי וילי מצופים ב- EME עם קריפטות, זה יכול לגרום למוות של התרבות כולה וכישלון להקים קו אורגנואידים. בגלל זה, כדאי לבודד קריפטות תחת טווח ניתוח, המאפשר אישור חזותי של דלדול villar. איור 1 מתאר שברי וילרים וקריפטות מייצגים (איור 1A). שימו לב לגודל הקטן משמעותית של קריפטות בהשוואה לווילי (איור 1B). לאחר הציפוי, הקריפטות יתרחבו לכדוריות במהלך הימים הקרובים, ויתחילו לנבוט ולהתמיין ביום 4-7 (איור 2). ברגע שהאורגנואידים מגיעים לשלב ניצנים נרחב, יש לעבור אותם. במהלך המעבר, חשוב לשבש את האורגנואידים מספיק כדי לפצל את ניצני הקריפטה זה מזה, כך שניתן יהיה להרחיב את מספרי האורגנואידים (איור 3B).
ההתאוששות המוצלחת של אורגנואידים לאחר הקפאה תלויה מאוד במצב שבו הם קפואים. אורגנואידים במצב שגשוג מאוד בלתי מובחן מתאוששים ביעילות הגבוהה ביותר. לכן, אנו ממליצים לגרום להם להיות כדוריים וציסטיים במקום ניצנים ומובחנים. כדי להשיג זאת, Wnt יכול להיות hyperactivated על ידי הגדלת כמות ליגנד Wnt R-spondin בתקשורת ועל ידי הכללת ניקוטינאמיד במדיה, אשר הוכח לתמוך היווצרות אורגנואידים והישרדות תאים במספר מערכות תרבית30,31. איור 3A מדגים תרבית אורגנואידים בריאה רק יומיים לאחר ההפשרה. הכללת BSA בתקשורת במהלך ההפשרה סייעה גם בהישרדותן של תרביות אורגנואידים במעי חולדות, שהוכחו כעדינות יותר מאורגנואידים של עכברים.
בעוד שתרבות אורגנואידים תלת-ממדית מועדפת לעתים קרובות מכיוון שהיא משחזרת חלק מארכיטקטורת המעי הרגילה, היא הופכת גישות אחרות, כולל הדמיה חיה, טרנספקציות והתמרה לנטי-ויראלית, למאתגרות יותר מבחינה טכנית. השימוש בחד-שכבות דו-ממדיות שנוצרו מאורגנואידיםתלת-ממדיים 32 (איור 4) מאפשר החדרת פלסמידים ביעילות גבוהה יותר. בעוד אורגנואידים תלת-ממדיים במעיים עמידים באופן מסורתי בפני טרנספקציות חולפות, ניתן להציג בהצלחה פלסמידים המקודדים ל-EGFP באמצעות שיטות טרנספקציה מבוססות שומנים. הגישה החסכונית ביותר באמצעות PEI מתוארת בשלב 6.1 (איור 5), אך אלקטרופורציה וריאגנטים טרנספקציה הזמינים מסחרית הניבו גם הם תוצאות דומות (הנתונים לא מוצגים). מחקרים עתידיים יתמקדו בשאלה האם ניתן להשתמש בגישות אלה להחדרת מבני CRISPR למונו-שכבות.
היה חשוב להיות מסוגלים לשנות אורגנואידים תלת-ממדיים מחד-שכבות דו-ממדיות לאחר טרנספקציה, כך שניתן יהיה לשמור עליהם כקו מעבר עם רכיבים אדריכליים תלת-ממדיים של קריפטות. באופן מעניין, חד-שכבות דו-ממדיות שצופו ב-EME השתנו בקלות לכדוריות קטנות כאשר EME נוסף בחזרה לחלק העליון של התאים, בעוד שמצע קולגן I לא הספיק לבנייה מחדש של מבנים תלת-ממדיים (איור 6).
בעוד transfections חולפות שימושיים עבור מחקרים רבים, היווצרות של קווים יציבים הם לעתים קרובות שימושי יותר, הדורשים הכנסת lentivirus לתוך התאים. אורגנואידי מעיים של חולדות נדבקו בלנטיוירוס על-ידי שינוי פרוטוקולים שפורסמו בעבר (איור 7). שלב מפתח בפרוטוקול הוא הפרעה של אורגנואידים לצברים קטנים או לצברי תאים. אם התרביות אינן משובשות ביעילות והאורגנואידים נשארים שלמים, החלקיקים הלנטי-ויראליים לא ייכנסו לתאים. לאחר ההדבקה, אורגנואידים חייבים להתאושש ולגדול מחדש. הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר ספיגה של חלקיקים נגיפיים על ידי 10%-48% (ממוצע: 19.4% ± 6.5%) של תאים לפני הבחירה.
צביעה שלמה של אורגנואידים יכולה להיות קשה עקב הסרה חלקית של שאריות EME או חדירה לא שלמה של נוגדנים. הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר צביעה חזקה של אורגנואידים. הדמיה של אורגנואידים במיקרוסקופ קונפוקלי יכולה גם להיות קשה אם הם רחוקים מדי מהכיסוי. על ידי שימוש ב- VALAP, נוצרת באר עם גובה מסוים כך שאורגנואידים אינם נמעכים על ידי הכיסוי, אך עדיין מורשים להתיישב קרוב למכסה כדי להקל על ההדמיה. צביעה מייצגת כנגד מווסת ההולכה הטרנסממברנלית של תעלת האניון האפיקלית (CFTR) ופאלואידין כדי לסמן F-actin מוצגת באיור 8.
לבסוף, אורגנואידים יש תועלת בבדיקות פונקציונליות. אורגנואידים שמקורם בחולה מחולי סיסטיק פיברוזיס שימשו לסינון תפקוד CFTR, שכן הטיפול באגוניסט cAMP פורסקולין גורם להפרשת נוזלים חזקה בתיווך CFTR, וגורם לנפיחות אורגנואידים 29,33-37. אחת המטרות של עבודה זו הייתה לזהות ולפתח מודל אורגנואידים שניתן להשתמש בו במקביל למחקרים פרה-קליניים in vivo. לכן, רצינו לקבוע אם אורגנואידים במעיים של חולדות עוברים נפיחות הנגרמת על ידי פורסקולין. ואכן, בתוך 30 דקות מהטיפול בפורסקולין, אורגנואידים של חולדות התנפחו, עם השפעה מקסימלית שנצפתה ב-120 דקות (איור 9).
איור 1: שברי וילאר וקריפטות במהלך בידוד אפיתל. (A) תמונה מייצגת של שברי וילאר בתמיסת EDTA במהלך פרוטוקול בידוד הקריפטה. ראשי חץ צהובים מסמנים שברי וילאר. חיצים אדומים מתארים קריפטות המחוברות לשבר וילאר. שימו לב להבדל בגדלים היחסיים. (B) תמונת הגדלה גבוהה יותר של קריפטה בודדת (חץ אדום) כך שניתן יהיה להמחיש מורפולוגיה. פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: התקדמות אורגנואיד במעי חולדה. קריפטים של חולדות ג'ג'ונום צופו ב-EME מיד לאחר הבידוד (A,B). תוך יומיים, הקריפטות הפכו לספרואידים (C,D). ביום 5, הם החלו ליזום ניצני קריפטה (E,F), אשר התרחבו וגדלו עד יום 7 (G). פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: אורגנואידים לאחר הפשרה ומעבר. (A) אורגנואידים ג'ג'ונליים של חולדות הופשרו בהתאם לפרוטוקולים המתוארים לאחר שימור בהקפאה. שימו לב לנוכחות של ספרואידים ואורגנואידים ניצנים רק יומיים לאחר ההפשרה. (B) אותו קו אורגנואידים המתואר ב-A מיד לאחר המעבר בהתאם לפרוטוקול המתואר. שים לב להפרש הגודל היחסי בין מבנים ב- A ו- B ולנוכחות של תחומים דמויי קריפטה בודדים ב- B. פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: היווצרות חד-שכבתית דו-ממדית מאורגנואידים תלת-ממדיים. (A-C) התקדמות חד-שכבתית דו-ממדית ב-EME. (D-F) התקדמות חד-שכבתית דו-ממדית בקולגן I. ביום החמישי, כל מצב הניב ~80% מפגש. פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: טרנספקציה חולפת של חד-שכבה דו-ממדית. תמונה מייצגת של חד-שכבה דו-ממדית הגדלה על EME באופן זמני עם פלסמיד pLJM1-EGFP באמצעות PEI. (A) שדה בהיר, (B) פלואורסצנטיות (GFP), (C) כיסוי. הקו האדום המקווקו מסמן את הגבול החד-שכבתי. פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: רפורמציה של אורגנואידים תלת-ממדיים מחד-שכבות דו-ממדיות ב-EME. (A) היווצרות אורגנואידים תלת-ממדיים מחד-שכבות דו-ממדיות שגדלו ב-EME. אורגנואידים שנוצרו ביעילות על ידי 5 ימים לאחר הוספת EME למשטח האפי של monolayer. שימו לב לשפע התאים המתים המקיפים את הספרואידים התלת-ממדיים הקטנים. (B) התמדה של חד-שכבות דו-ממדיות 5 ימים לאחר הוספת קולגן I למשטח האפי של חד-שכבות דו-ממדיות שגדלו על קולגן I. מוטות קנה מידה: 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: זיהום לנטיויראלי של אורגנואידים תלת-ממדיים. אורגנואידים מסוג Rat jejunum היו נגועים בחלקיקים גרעיניים GFP lentiviral באמצעות הפרוטוקול המתואר. לאחר התאוששות וצמיחה במשך 5 ימים, אורגנואידים תוקנו ומוכתמים ב- DAPI. (א) DAPI: אפור; גרעיניGFP: ירוק. (B) גרעיניGFP:ירוק. הקו האדום המקווקו מסמן את גבול האורגנואידים. פסי קנה מידה: 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: אימונופלואורסנציה שלמה של אורגנואידים במעי חולדה . (A) CFTR, (B) phalloidin ו-(C) התמזגו של הר שלם של אורגנואידים ג'ג'ונליים של חולדות. שימו לב להעשרה אפית של צביעת CFTR באורגנואידים (אפור ב-A, מגנטה ב-C). פלואדין מסמן F- אקטין ומסמן באופן בולט את גבול המברשת האפיקלית (אפור ב-B, ציאן ב-C). פסי קנה מידה: 25 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 9: אורגנואידים של חולדות במעיים מתנפחים בעקבות גירוי פורסקולין. מהלך זמן מייצג של נפיחות אורגנואיד מעיים של חולדה לאחר הוספת אגוניסט cAMP forskolin. הזמן של 0 דקות מייצג את נקודת הזמן שלפני התוספת של 10 מיקרומטר פורסקולין. התמונות מראות את אותו אורגנואיד במרווחי זמן של 30 דקות. נפיחות מקסימלית נצפתה ב 120 דקות לאחר תוספת forskolin. הקו האדום המקווקו מתאר את גבול האורגנואידים. החומר הכהה במרכז לומן האורגנואיד מורכב מתאים מתים. פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה 1: מתכון AdDMEM+. מרכיבים להכנת מדיית AdDMEM+ סטנדרטית, שהיא המדיה הבסיסית בכל השיטות המוצגות כאן. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 2: מתכון של חולדה לאורגנואיד מעיים (rIOM). מתכון מפורט של מצע אורגנואיד המעי הסטנדרטי של חולדות, כולל ממס ותנאי אחסון לחלבונים רקומביננטיים. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 3: פתרונות. מתכונים והוראות להכנת פתרונות אחרים המשמשים לאורך כל הפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 4. מדיום אורגנואיד מעיים של חולדה לתרבית חד-שכבתית דו-ממדית (rIOM2D). מתכון שונה של מדיה תרבותית אורגנואידית המותאמת לצמיחה דו-ממדית של חד-שכבות. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
פיתוח מודל אורגנואיד מעיים של חולדה משמר מאפיינים תפקודיים חשובים הנמצאים באיבר in vivo והוא כלי מבטיח לבדיקות פרה-קליניות, סינון תרופות ובדיקות תפקודיות. מודל זה במבחנה יכול לשמש במקביל למחקרי גסטרואנטרולוגיה פרה-קליניים in vivo , שעבורם חולדות הן לעתים קרובות מודל מועדף בשל גודל המעי הגדול שלהן, היבטים פיזיולוגיים משותפים עם בני אדם, ובמקרים מסוימים היותן מודלים טובים יותר למחלות38. כאן, מתואר פרוטוקול חזק שלב אחר שלב לבידוד של קריפטות מעיים של חולדות, יצירה ותרבית ארוכת טווח של אורגנואידים במעי חולדות, כמו גם יישומים במורד הזרם, כולל בדיקות פונקציונליות של נפיחות פורסקולין, אימונופלואורסנציה של הר שלם, תרבית חד-שכבתית דו-ממדית ומניפולציה גנטית לנטי-ויראלית. אורגנואידים של עכברי עכברוש עשויים להיות רלוונטיים בהקשרים רבים של מחלות שבהם הפתופיזיולוגיה של מודלים של עכברים אינה הולמת, ועשויים לספק מודל טוב יותר לפיזיולוגיה של המעי האנושי בהשוואה לאורגנואידים של מעי עכברים.
כדי לבסס תרביות אורגנואידים ארוכות טווח שניתן לעבור ולהרחיב, חיוני לזהות את גורמי הגדילה העיקריים הדרושים לשמירה על שגשוג אפיתל המעי. אורגנואידים עכבריים גדלים לרוב בקוקטייל פשוט של EGF, R-ספונדין ונוגין, אם כי דווח כי נוגין אינו הכרחי לתרבית אורגנואידים במעיים39. מדיה מותנית יכולה להחליף גורמי גדילה רקומביננטיים וקווי התאים הנפוצים ביותר הם L-WRN, המפריש תאים Wnt3a, Rspondin-3 ו- Noggin39, L-Wnt3a ו- HA-Rspondin1-Fc 293T40. מדיה מותנית L-WRN מספיקה כדי לתמוך לא רק בצמיחת אורגנואידים במעי עכבר 39, אלא גם בצמיחה של אורגנואידיםבמעיים ממספר חיות משק וחיות מחמד, כולל כלבים, חתולים, תרנגולות, סוסים, פרות, כבשים וחזירים12. עם זאת, אורגנואידים במעיים אנושיים שונים מאוד בדרישות גורמי הגדילה שלהם, מכיוון שהם דורשים פורמולציות מדיה נפרדות לשלב צמיחת ההתפשטות שלהם (כלומר, ההתקדמות מספרואידים קטנים לגדולים) לעומת שלב ההתמיינות שלהם (כלומר, יצירה והבשלה של סוגי תאים ממוינים)10. דרישות המדיה של אורגנואידים במעי חולדות דומות מאוד לאלה של מצע הגידול המתפשט עבור אורגנואידים במעיים אנושיים, עם זאת, יש לציין, אורגנואידים של חולדות מסוגלים הן לגדילה והן להתמיינות בסביבת מדיה זו, מה שמפשט במידה ניכרת את דרישות התרבות שלהם. בעוד שהניסיונות הראשונים שלנו התמקדו בביסוס וגידול אורגנואידים במעיים של חולדות במדיה מותנית L-WRN, התרבית ארוכת הטווח הייתה רופפת, וקווי אורגנואידים במעיים של חולדות סבלו מחוסר חוסן (הנתונים לא הוצגו). ייתכן שהסיבה לכך היא שקווי תאי L-WRN מהונדסים להפריש R-spondin 3, בעוד שקו התאים 293T-Rspo1 המומלץ כאן מתוכנן להפריש R-spondin 1. ייתכן שאורגנואידים של חולדות ובני אדם מעדיפים R-spondin 1, מה שעשוי להסביר את הכשל של קווי אורגנואידים של חולדות במדיה מותנית L-WRN.
כדי לשחזר בצורה הקרובה ביותר את הגדרת in vivo , חשוב לפתח תנאי תרבית אורגנואידים המאפשרים הישרדות, תחזוקה ושגשוג של תאי גזע, ושיכולים לשמור על תחלופת תאים ואירועי התמיינות בו זמנית לסוגי תאים בדידים. לכן, הריכוזים של חלבונים רקומביננטיים ו / או חלבונים במדיה מותנית צריכים להיות טיטרציה הדוקה ומבוקרת כדי להגיע לאיזון מושלם זה. בפרט, רמות Wnt אופטימליות חיוניות כדי למנוע אובדן של תרביות אורגנואידים במעי. מעט מדי Wnt במדיה המותנית לא יהיה מסוגל לתמוך בצמיחה, מה שיוביל לאובדן תאי גזע ומוות אורגנואידים לאחר מכן; הפעלת יתר של Wnt תגרום לאורגנואידים להיות ציסטיים ובלתי מובחנים10. אמנם לא מפורט כאן, מומלץ מאוד לבדוק כל אצווה של מדיה מותנית L-Wnt3a ו- 293T-Rspo1 באמצעות בדיקת לוציפראז של כתב Wnt, כגון קו תא Topflash41. מחקרים קודמים תיארו כי אצווה אופטימלית של מדיה L-Wnt3a צריכה לגרום לעלייה של פי 15 באות ב-12.5% ועלייה של פי 300 באות ב-50%, בהשוואה ל-1% L-Wnt3a10. מכיוון שאורגנואידים של חולדות רגישים יותר מאורגנואידים של עכברים לדרישות התרבית, במיוחד לרמות ההפעלה של Wnt, צעדי בקרת איכות נוספים אלה מסייעים מאוד להקל על החוסן והאמינות של תרביות אורגנואידים של חולדות. מכיוון שקו כתבים דומה אינו זמין לבדיקת פעילות Bmp וריכוזי Noggin יחסיים במדיה מותנית Noggin, מומלץ להשתמש ב- Noggin רקומביננטי במידת האפשר כדי לשלוט במדויק ברמות Noggin. בעוד שניתן לגדל ולתחזק אורגנואידים במעיים של עכברים בהיעדר Noggin39, זה לא נוסה עבור תרביות אורגנואידים של חולדות.
מעבר לדרישות תרבית תאים, ההקמה הראשונית המוצלחת של קו אורגנואידים של חולדה תלויה באופן קריטי בדלדול יעיל של וילי ממוין במהלך בידוד קריפטה. רמות גבוהות של זיהום וילאר גורמות למוות של קריפטות, ככל הנראה בשל אותות מהתאים הגוססים, או בשל השתלטות על גורמים חיוניים. כדי לרוקן את הווילי המובחן הזה מתכשירי אפיתל בצורה מדויקת ועקבית, מומלץ לבצע בידודי אפיתל בעזרת סטריאוסקופ. בחינה חזותית של האפיתל המשתחרר מספקת רמז ברור מתי להשליך את PBS ולהחליף אותו (איור 1). אין לאסוף קריפטות עד שיש דלדול מספיק של וילי. תאי וילאר הם בעלי התמיינות סופנית ואינם יכולים לייצר אורגנואידים בתרבית. בנוסף, העברה לאחר מכן של אורגנואידים במעיים של חולדות והשימוש בהם לכל יישום במורד הזרם דורשים טיפול עדין. דגירה בריאגנטים דיסוציאציה לפרקי זמן ארוכים יותר (10 דקות) גורמת למוות תאי משמעותי ולאובדן קו האורגנואידים.
כאן מתואר פרוטוקול פשוט ומהיר ליצירת חד-שכבות מעיים מאורגנואידים של חולדות. למצעי EME וקולגן I יש השפעות שונות על האפיתל, שניתן למנף בהתאם למטרת המחקר. EME מאפשר הידבקות מהירה ויעילה של תאים בודדים ויצירת הקרנות תאים. לעומת זאת, ציפוי פני השטח בקולגן I מעכב תהליכים אלה. ברגע שחד-שכבות מגיעות למפגש של כ-80%, תאים הגדלים ב-EME מתחילים לייצר שוב מבנים אורגנואידים תלת-ממדיים. עם זאת, הם חסרים תמיכה פיזית וכימית מספקת להמשך הצמיחה. ניתן למנוע חזרה זו למצב אורגנואידי על ידי שמירה על חד-שכבות ב-EME במפגש של 50%-80%. תוספת של EME מדולל על פני השטח האפי של monolayers מקדם התאוששות מהירה היווצרות של אורגנואידים דה נובו, יצירת אזורים של התכנסות מהר יותר ובקלות. על משטח קולגן I, תאים יכולים ליצור חד-שכבה אחידה וליצור אשכולות קטנים. עם זאת, תוספת של קולגן I על גבי monolayers אינו מספיק כדי לגרום להיווצרות אורגנואידים. EME חייב להיות מדולל בעת הוספת משטח monolayer, כמו תהיה התנגדות מכנית חזקה יותר עבור אורגנואיד המתהווה להתגבר. עם זאת, EME מדולל זה אינו מאפשר היווצרות חזקה של אורגנואידים גדולים. כל אורגנואיד חולדה שנוצר דה נובו ומתנתק באופן טבעי מפני השטח חייב להיות מוסר מיד ומועבר EME לא מדולל כך שניתן יהיה לשחזר תמיכה מבנית וגדילה. בשל גודלם הקטן של האורגנואידים בשלב זה, המעבר של אורגנואידים אינו מומלץ עד לצמיחה חזקה הוקמה. המשמעות הביולוגית הבסיסית של מדוע EME יכול לתמוך ברפורמציה של אורגנואידים, אך האם קולגן I יכול או לא יכול לעשות זאת, אינה ברורה. עם זאת, היו דיווחים כי תאים שגדלו בקולגן תלת-ממדי אינם יכולים ליצור אורגנואידים ניצנים42,43 או לתמוך בתחזוקה לטווח ארוך. מוצרי EME הזמינים מסחרית הם תערובות הטרוגניות של חלבונים חוץ-תאיים, בעיקר למינין וקולגן IV44. לכן, ההרכב הייחודי של חלבונים והיכולת של תא אפיתל לתקשר עם המטריצה החוץ תאית באמצעות קומפלקסים תאיים שונים יכולים לאפשר עיצוב מחדש ב- EME אך לא בקולגן I. לא נבדקה השאלה אם ניתן להכניס חד-שכבות שמקורן בקולגן I ל-EME כדי לתמוך בהיווצרות וגדילה של אורגנואידים.
מניפולציה גנטית של מודל אורגנואיד המעי של חולדה מתוארת כאן, ומתוארים פרוטוקולים להתמרה לנטיויראלית של אורגנואידים תלת-ממדיים וטרנספקציה חולפת של חד-שכבות דו-ממדיות. כדי להתגבר על היעילות הנמוכה של התמרה אורגנואידית לנטיוויראלית, פותח פרוטוקול לטרנספקציה חולפת של חד-שכבות דו-ממדיות. המורפולוגיה השטוחה והתחומים האפיקליים החשופים של חד-שכבות מספקים גישה קלה יותר לנגיפים ולקומפלקסים המכילים DNA. הביטוי של כתב EGFP באמצעות וקטור pLJM1-EGFP שימש לאימות של טכניקה זו. ביטוי כתב GFP נצפה לאחר 24 שעות, ונשמר במשך 5-6 ימים בחד-שכבות. מחקרים עתידיים שיתמקדו בהתמרה לנטיויראלית של חד-שכבות צפויים להיות בעלי יעילות גבוהה יותר מאשר התמרה אורגנואידית תלת-ממדית. באמצעות הפרוטוקולים לעיל, אורגנואידים תלת ממדיים יכולים להיות מחדש מ monolayers 2D נגוע כדי להקל על יצירת קווים יציבים. בזהירות, ניתן לשמור בהצלחה על קווי אורגנואידים של מעי חולדות במשך למעלה משנה, להישאר יציבים לאורך מעברים רבים, להישמר בהקפאה, להפשיר בהצלחה ולהונדסים גנטית באמצעות התמרה לנטיויראלית, ובכך לענות על הצורך במודל אורגנואיד מעי במבחנה נגיש וניתן להעברה השומר על הרלוונטיות הפיזיולוגית לבני אדם.
ללא.
אנו מודים לחברי מעבדות Sumigray ו- Ameen על הדיונים המעמיקים שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי מענק בריאות הילד של קרן צ'ארלס הוד ומענק של קרן סיסטיק פיברוזיס (004741P222) ל- KS ועל ידי המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות של המכונים הלאומיים לבריאות ל- NA תחת פרס מספר 2R01DK077065-12.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
3-D Culture Matrix Rat Collagen I | Cultrex/R&D Systems | 3447-020-01 | |
70 µm cell strainer | Corning/Falcon | 352350 | |
Advanced DMEM/F12 | Gibco/Thermo Fisher | 12634010 | |
Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942-20ML | |
B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher | 17504044 | |
CHIR99021 | Cayman Chemical | 13122 | |
CryoStor | Stem Cell Technologies | 100-1061 | |
Cultrex HA-Rspondin1-Fc 293T cells | R & D Systems | 3710-001-01 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Molecular Probes/Thermo Fisher | D1306 | |
FBS | Gibco/Thermo Fisher | 16-000-044 | |
Gastrin I (human) | Sigma Aldrich | G9145 | |
Gentle Cell Dissociation Reagent | Stem Cell Technologies | 100-0485 | |
Glutamax | Thermo Fisher | 35-050-061 | |
Growth factor-reduced Matrigel, phenol red-free | Corning | 356231 | |
HEPES | AmericanBio | AB06021 | |
Lanolin | Beantown Chemical | 144255-250G | |
L-glutamine | Gibco/Thermo Fisher | A2916801 | |
L-Wnt3a cells | ATCC | CRL-2647 | |
N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher | 17502-048 | |
N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165-5G | |
Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco/Thermo Fisher | 31985070 | |
Paraffin | Fisher Scientific | P31-500 | |
Parafilm | Sigma Aldrich | P7793 | transparent film |
PBS | Thermo Fisher | 10010023 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco/Thermo Fisher | 15140122 | |
pLJM1-EGFP | Addgene | 19319 | |
Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
Polyethylenimine hydrochloride (PEI) | Sigma Aldrich | 764965 | |
p-phenylenediamine | Acros Organics/Thermo Fisher | 417481000 | |
Puromycin | VWR | J593-25mg | |
Recombinant human FGF2 protein | Peprotech | 100-18B-250ug | |
Recombinant human IGF-1 protein | Biolegend | B356441 | |
Recombinant human Noggin protein | R & D Systems | 6057-NG-100 | |
Recombinant mouse EGF protein | Thermo Fisher | PMG8041 | |
Sprague Dawley rat | Charles River Laboratories | Strain 001 | |
Triton X-100 | American Bioanalytical | AB02025-00500 | |
TrypLE Express Enzyme | Gibco/Thermo Fisher | 12604013 | |
Y27632 dihydrochloride | Sigma Aldrich | Y0503 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved