מיקרוסקופ הרחבה אולטרה-סטרוקטורלי בשלושה שלבי מחזור חיים חוץ גופי של טריפנוזומה קרוזי

Summary

מחקר זה מראה פרוטוקול מפורט לביצוע מיקרוסקופ הרחבת אולטרה-מבנה בשלושה שלבי מחזור חיים במבחנה של טריפנוזומה קרוזי, הפתוגן האחראי למחלת צ'אגאס. אנו כוללים את הטכניקה האופטימלית עבור חלבונים ציטו-שלד ותיוג פאן-פרוטאום.

Abstract

אנו מתארים כאן את היישום של מיקרוסקופ הרחבת אולטרה-מבנה (U-ExM) ב Trypanosoma cruzi, טכניקה המאפשרת להגדיל את הרזולוציה המרחבית של תא או רקמה עבור הדמיה מיקרוסקופית. זה מתבצע על ידי הרחבה פיזית של דגימה עם כימיקלים מהמדף וציוד מעבדה נפוץ.

מחלת צ'אגאס היא דאגה נרחבת ודחופה לבריאות הציבור הנגרמת על ידי T. cruzi. המחלה נפוצה באמריקה הלטינית והפכה לבעיה משמעותית באזורים שאינם אנדמיים עקב הגירה מוגברת. העברת T. cruzi מתרחשת דרך וקטורי חרקים hematophagous השייכים למשפחות Reduviidae ו Hemiptera. לאחר ההדבקה, T. cruzi amastigotes מתרבים בתוך הפונדקאי של היונקים ומתמיינים לטריפומסטיגוטים, צורת זרם הדם שאינה משוכפלת. בווקטור החרקים, טריפומסטיגוטים הופכים לאפימסטיגוטים ומתרבים באמצעות ביקוע בינארי. ההתמיינות בין שלבי מחזור החיים דורשת סידור מחדש נרחב של שלד התא וניתן לשחזר אותה במעבדה לחלוטין תוך שימוש בטכניקות שונות של תרביות תאים.

אנו מתארים כאן פרוטוקול מפורט ליישום U-ExM בשלושה שלבי מחזור חיים חוץ גופיים של Trypanosoma cruzi, תוך התמקדות באופטימיזציה של אימונולוקליזציה של חלבונים ציטו-שלד. כמו כן, ביצענו אופטימיזציה של השימוש ב-N-Hydroxysuccinimide ester (NHS), תווית פאן-פרוטאום שאפשרה לנו לסמן מבנים שונים של טפילים.

Introduction

מיקרוסקופ הרחבה (ExM) תואר לראשונה בשנת 2015 על ידי Boyden et ^al.1. זהו פרוטוקול הדמיה שבעזרתו מיקרוסקופ קונבנציונלי יכול להשיג רזולוציה מרחבית מתחת לגבול העקיפה. רזולוציה גבוהה יותר זו מתקבלת בגלל הגדלה פיזית של המדגם. כדי להשיג זאת, מולקולות המסומנות באופן פלואורסצנטי מוצלבות להידרוג'ל, אשר לאחר מכן מורחב איזוטרופית עם מים. כתוצאה מהתפשטות זו, האותות מופרדים כמעט איזוטרופית בכל שלושת המימדים. שיטה זו עושה שימוש בכימיקלים זולים ומאפשרת רזולוציה מרחבית של כ-65 ננומטר באמצעות מיקרוסקופים קונפוקליים (קונפוקליים), שהיא בערך פי ארבעה יותר טובה מהרזולוציה הסטנדרטית של מיקרוסקופ קונפוקלי (כ-250 ננומטר)¹.

אבן הדרך הבאה, שאפשרה שימוש במיקרוסקופ התפשטות בתחומים ביולוגיים רבים, הייתה התאמת הסימון האימונופלואורסצנטי לנוגדנים קונבנציונליים². עיבוד נוסף מפרוטוקול ExM שפורסם לראשונה הוא ניתוח מוגדל של הפרוטאום (MAP)³. שיטה זו הציגה שימוש בריכוזים גבוהים של אקרילאמיד ופרפורמלדהיד לפני טבילת דגימה הידרוג'ל כדי למנוע קרוסלינקינג תוך ובין-חלבוני, מה שהוביל לשימור טוב יותר של תכולת החלבונים והארכיטקטורה התת-תאית של הדגימות. פרוטוקול חלופי זה הותאם להשגת שימור משופר של מבנה העל הכולל של אברונים מבודדים על ידי ניצול ריכוזים נמוכים יותר של חומרי הקיבוע (פורמלדהיד/פרפורמלדהיד ואקרילאמיד); גישה זו כונתה Ultrastructure expansion microscopy (U-ExM)⁴.

כדי להשיג רזולוציה רבה עוד יותר, דווח גם על שילוב של ExM עם טכניקות מיקרוסקופיה ברזולוציית על, כולל מיקרוסקופ דלדול פליטה מגורה או מיקרוסקופ לוקליזציה של מולקולה בודדת, על מנת להגיע לרזולוציות נמוכות מ-20 ננומטר⁵.

השימוש ב- ExM דווח בהרחבה בתחומי מדעי המוח ומחקר שלד ציטו-שלד⁶, אך רק מחקרים מעטים נערכו על פרוטיסטים טפיליים. המעבדה שלנו הייתה הראשונה לדווח על יישום U-ExM ב- T. cruzi⁷. פרוטוקול הבסיס מבוסס בעיקר על דוחות U-ExM קודמים ב- Toxoplasma gondii, Plasmodium ssp. ו- Trypanosoma brucei 8,9,10,11.

אחד היתרונות הגדולים ביותר של ExM הוא אופיו המודולרי, המאפשר גמישות רבה להסתגל לדגימות ביולוגיות שונות. ניתן לחלק את הפרוטוקול לשלבים (כגון קיבוע, מניעת crosslinking או gelation) שהמשתמש יכול להתאים בקלות כדי לעמוד בדרישות הניסוי שלהם. בנוסף, ניתן לשנות צינור זה כדי לשפר את התאימות עם אורגניזם המודל או כדי להשיג רזולוציה ספציפית. כתוצאה מכך, ExM מציעה פוטנציאל עצום עבור מערכות אופטיות מתקדמות ולא מתקדמות, מה שמבטיח יישומים רחבים יותר בעתיד.

מחלת צ'אגאס, הנקראת גם טריפנוסומיאזיס אמריקאית, היא מחלה אנדמית באמריקה הלטינית הנגרמת על ידי טריפנוזומה קרוזי, טפיל פרוטוזואי. מחזור החיים של הטפיל מורכב וכולל שני שלבי התפתחות ביונקים ושניים בפונדקאי החרק (בני משפחת הטריאטומיניים), שהוא הווקטור הביולוגי של מחלה זו. מחלת צ'אגאס שייכת לקבוצת המחלות הטרופיות המוזנחות המפורטות על ידי ארגון הבריאות העולמי ומייצגת בעיה כלכלית וחברתית משמעותית באמריקה הלטינית. מחקרים אפידמיולוגיים מעריכים כי 8 מיליון אנשים ברחבי העולם חיים עם מחלת צ'אגאס ויותר מ-10,000 מקרי מוות בשנה. מספרים אלה מדגימים את חשיבותה של מחלת צ'אגאס כבעיה של בריאות הציבור ברחבי העולם. התפוצה הגיאוגרפית של מחלת צ'אגאס השתנתה בעשורים האחרונים, כאשר אנשים נגועים רבים מתגוררים כיום באזורים עירוניים גדולים ברחבי העולם עקב הגירה מוגברת, בניגוד לאזורים הכפריים בעיקר של אמריקה הלטינית שם היא נמצאה במקור¹².

שלבי ההתפתחות של T. cruzi שונים לאורך מחזור החיים שלו, אשר ניתן לשכפל לחלוטין במבחנה. אפימסטיגוטים הם צורות שכפולות בווקטור החרק, ויש להם גרעין כדורי באזור המרכזי של גוף התא וקינטופלסט בצורת בר (מבנה מיטוכונדריאלי המכיל DNA ייחודי לקינטופלסטידים) באזור הקדמי ביחס לגרעין, עם שוטון חופשי. טריפומסטיגוטים הם הצורה הזיהומית, הלא משוכפלת, ויש להם גרעין מוארך, קינטופלסט אחורי מעוגל, ושוטון המחובר לקרום הפלזמה לכל אורכו של הטפיל. אמסטיגוטים הם צורת השכפול התוך-תאית; יש להם גרעין באזור המרכז, קינטופלסט בצורת מוט בחלק הקדמי של גוף התא, ושוטון מופחת. יכולת ההסתגלות של הטפיל לסביבות שונות היא השתקפות של שינויים מורפולוגיים אלה. ראוי גם להזכיר כי מחזור חיים זה כרוך בחלוקה סימטרית ובשלבי התפתחות מעבר שונים¹³. במהלך ההתמיינות, השלד הציטוזומטי של הטריפנוזומטים ממלא תפקיד קריטי. מבנה זה נוצר על ידי מחוך של מיקרוטובולים תת-פליקולריים המסודרים במערך מסודר של מיקרוטובולים יציבים מתחת לקרום הפלזמה. כמו כן, מוט paraflagellar קיים באורגניזמים אלה, שהוא מבנה דמוי סריג העובר במקביל ומחובר לאקסונם flagellar¹⁴. הארגון הציטו-שלד המדויק והשינויים המבניים הגרעיניים לאורך שלבי מחזור התא כוללים מנגנוני ויסות גנים ייחודיים הספציפיים לטריפנוזומטים, מה שהופך אותם למודלים מעניינים למחקרים בביולוגיה של התא.

בהתחשב בגודל הקטן של T. cruzi וטפילים פרוטוזואן אחרים, U-ExM מציג כלי מצוין לניתוח התכונות המבניות של פתוגנים חשובים אלה. כאמור, תחולתה של טכניקה זו על T. cruzi אומתה לראשונה על ידי ד"ר אלונסו⁷. דו"ח זה מפרט פרוטוקול U-ExM מלא, עם דגש על אימונולוקליזציה של חלבוני שלד ציטו-שלד במהלך שלבי מחזור החיים השונים של T. cruzi. כמו כן, ביצענו אופטימיזציה של השימוש ב-N-Hydroxysuccinimide ester (NHS), תווית פאן-פרוטאום המאפשרת לנו לסמן מבנים שונים של טפילים. בנוסף, מתוארת מתודולוגיה במבחנה להשגת שלושת שלבי הטפיל.

Protocol

הערה: איור 1 ממחיש את התכנון הניסויי המלא.

איור 1: זרימת עבודה של U-ExM עבור שלושה שלבי מחזור חיים חוץ גופיים של T. cruzi. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

1. הכנת כיסויים מצופים פולי-D-ליזין

1. מניחים ריבוע של 10X10 ס"מ של סרט איטום בצלחת פטרי. שטפו את הכיסויים על ידי רחיצתם באתנול מוחלט בצלחת פטרי זכוכית 35 מ"מ.
2. הסר את הכיסויים בפינצטה מאמבט האתנול ונקז את עודפי הנוזל עם נייר טישו. מניחים את הכיסויים מעל סרט האיטום.
3. לספוג את שאר האתנול עם נייר ברמה מיקרוסקופית. הוסף תמיסת v/v 0.1% של פולי-D-ליזין במרכז הכיסוי ומרח אותה עם הקצה כדי לכסות כ-80% מפני השטח שלה. סגור את צלחת פטרי לדגור במשך 1 שעה ב 37 ° C.
   הערה: עבור 22 מ"מ² כיסויים, השתמש 200 μL של תמיסת פולי-D-ליזין; עבור כיסויים עגולים בקוטר 12 מ"מ, יש להשתמש ב-100 מיקרוליטר של תמיסת פולי-D-ליזין.
4. שטפו את הכיסויים במים טהורים במיוחד שלוש פעמים. השתמשו בשאיפה עם ואקום כדי להסיר את המים בין כל כביסה. יש לשמור על טמפרטורה של 4°C למשך עד שבוע.

2. הכנת פתרון

1. הכינו תמיסות מלאי של 38% (w/w) נתרן אקרילט (SA).
   1. הוסיפו באיטיות 19 גרם חומצה סליצילית ל-31 מ"ל מים נטולי נוקלאז תוך כדי ערבוב.
      הערה: פתרון זה צמיג מאוד; שימו לב כשאתם עושים פיפטינג.
   2. לאחר המסת חומצה סליצילית לחלוטין, אחסנו אותה במיכל סטרילי. שמור אותו ב 4 ° C ולשנות אותו כל 6 חודשים.
      הערה: SA מראה לפעמים סימנים של זיהום עם פוליאקרילט נתרן בהתאם למותג, אשר מורגש בעת הכנת פתרון המניות כפי שהוא הופך צהבהב ועכור. השתמש בו בזהירות אם זה המקרה.
2. הכינו תמיסת מלאי של 40% (w/v) אקרילאמיד (AA) ותמיסת מלאי של 2% (w/v) N, N'-methylene bisacrylamide (BIS). ממיסים כל תרכובת במים טהורים במיוחד ומסננים עם מסנן מזרק סטרילי 0.22 מיקרומטר. יש לאחסן במיכל סטרילי בטמפרטורה של 4°C.
   זהירות: AA ו-BIS הם חומרים רעילים ביותר. יש לעבוד מתחת למכסה מנוע מנדף ולהשתמש בגופי הגנה מתאימים (כפפות, ביגוד מגן, מסכה ומשקפי בטיחות).
3. הכן את תמיסת מניעת הצלבת חלבונים (CP) על ידי ערבוב 38 μL של תמיסת 37% פורמלדהיד (FA) עם 50 μL של תמיסת מלאי אקרילאמיד 40% (שלב 2.2) ב 912 μL של מלח חוצץ פוספט (PBS; טבלה 1) כדי לקבל ריכוז סופי של 1.4% פורמלדהיד ו 2% אקרילאמיד.
   הערה: הכינו תמיד את תמיסת ה-CP טרייה והיו מדויקים ביותר בעת הפיפטה. לדוגמה, השתמש פיפטה P1000 לקחת 900 μL של PBS ופיפטה P20 לקחת את 12 μL הנותרים של PBS.
4. הכינו את הפתרון המונומרי
   הערה: אין להשתמש בפתרון מיד לאחר ההכנה; יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C לפחות 24 שעות לפני השימוש.
   1. ערבבו 500 μL של תמיסת 38% SA (שלב 2.1), 250 μL של תמיסת 40% AA, ו-50 μL של תמיסת BIS (שלב 2.2), כמו גם 100 μL של 10x PBS (טבלה 1).
   2. Aliquot נפח סופי זה של 900 μL ב 10x 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge עם 90 μL של פתרון מונומרי כל אחד. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C למשך עד שבועיים.
      הערה: תמיסת SA עשויה להישאר על הקצה בעת pipetting כי זה צמיג מאוד; היזהר וחלק על הכל.
5. הכן את הפתרון denaturing
   1. ערבבו 114.3 מ"ל של תמיסת סודיום דודציל סולפט (SDS) בנפח 350 מ"מ שהוכנה במים טהורים במיוחד עם 10 מ"ל של תמיסת נתרן כלורי באורך 4 מ"מ שהוכנה במים טהורים במיוחד. מוסיפים 12 גרם של Tris תוך כדי ערבוב 250 מ"ל מכולת.
      זהירות: SDS רעיל מאוד; השתמשו בו מתחת למכסה מנוע עם כפפות, ביגוד מגן, מסכה ומשקפי בטיחות.
   2. התאם את ה- pH ל -9 עם תמיסה מרוכזת של חומצה הידרוכלורית. להכין עד 200 מ"ל עם מים טהורים במיוחד ולאחסן בקבוק סטרילי ב 4 °C (75 °F).
6. הכינו תמיסת 10% אמוניום פרסולפט (APS) ותמיסת TEMED 10%.
   1. יש להמיס 0.1 גרם של APS ב-1 מ"ל של מים טהורים במיוחד.
   2. הכן 1 מ"ל של תמיסת TEMED 10% במים טהורים במיוחד.
   3. הכינו 100 μL aliquots של שתי התמיסות בצינורות סטריליים מיקרוצנטריפוגות 1.5 מ"ל ואחסנו אותם ב -20 °C למשך עד חודש אחד.
7. הכן את הפתרון paraformaldehyde.
   1. יש להמיס 2 גרם של paraformaldehyde ב 40 מ"ל של PBS תוך ערבוב ב 60 ° C. מוסיפים 1 M NaOH בטיפה עד שהתמיסה הופכת מלבנה לחסרת צבע.
      זהירות: פורמלדהיד רעיל מאוד; השתמשו בו מתחת למכסה מנוע עם כפפות, ביגוד מגן, מסכה ומשקפי בטיחות.
   2. קררו את התמיסה בטמפרטורת החדר וכווננו את ה-pH עם NaOH ל-7.2 בנפח סופי של 50 מ"ל. מסננים עם מסנן מזרק סטרילי 0.22 מיקרומטר ומאחסנים במיכל סטרילי.
   3. להכין aliquots של 1 מ"ל ב 1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה סטריליים ולאחסן ב -20 ° C.
8. הכינו את תמיסת הפרפורמאלדהיד/גלוטראלדהיד.
   1. הוסף 0.2 גרם של paraformaldehyde ב 3.5 מ"ל של מים טהורים במיוחד ו 50 μL של 16 M תמיסת NaOH. מחממים את התמיסה ל-60°C כדי להמיס את הפרפורמלדהיד.
   2. מצננים ומוסיפים 300 μL של 70% גלוטראלדהיד. העלה את הנפח ל -5 מ"ל עם מים טהורים במיוחד ולבסוף ל -10 מ"ל עם PBS.
      זהירות: Paraformaldehyde ו glutaraldehyde הם רעילים מאוד; השתמשו בהם מתחת למכסה מנוע עם כפפות, ביגוד מגן, מסכה ומשקפי מגן.
   3. להכין aliquots של 1 מ"ל ב 1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה סטריליים ולאחסן ב -20 ° C.

3. הכנת תרביות הטפילים

1. לגדל T. cruzi epimastigotes.
   1. השתמש בתרבית אקסנית בבקבוק T-25 (25 ס"מ² שטח גדילה) ושמור על התרביות בשלב הלוגריתמי על ידי תת-תרבית כל 48-72 שעות בתווך טריפטוז עירוי כבד (LIT) עם 10% נסיוב עגל עוברי (FCS; טבלה 1).
   2. ודא שהפקק סגור היטב ושמור את בקבוק התרבית במאונך על 28 מעלות צלזיוס לדגירה. עקוב אחר צמיחת הטפיל על ידי ספירת תאים בתא נויבאואר במהלך כל תת-תרבית.
      הערה: עבור זן Dm28c ששימש במחקר זה, ריכוז epimastigotes בתרביות לוג פאזות הוא בין 1-5 x 10⁷ טפילים / מ"ל.
   3. הכינו השעיה של 2 x 10⁶ epimastigotes/mL מתרבית שלב יומן במדיום LIT בתוספת 10% FCS. צנטריפוגה את המתלים במהירות של 5,000 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT). יש לשטוף עם PBS פעם או פעמיים ולהשהות מחדש ב-200 מיקרוליטר של PBS.
   4. יש להיצמד לכיסוי העגול בקוטר 12 מ"מ שקודם לכן היה מצופה בפולי-D-ליזין (סעיף 1). יש לדגור ב-RT למשך 15-20 דקות. המשך לשלב מניעת crosslinking (סעיף 4).
      הערה: לחלופין, תקן את האפימסטיגוטים עם מתנול קר למשך 7 דקות או תמיסת פרפורמלדהיד/גלוטראלדהיד (שלב 2.8) למשך 10 דקות ב- RT לפני היצמדות הטפילים לכיסוי. ניתן לאחסן את הטפילים הקבועים ב 4 °C (75 °F) עד שבוע אחד.
2. להשיג amastigotes מתאי Vero נגועים.
   1. הניחו כיסוי עגול סטרילי בקוטר 12 מ"מ על תחתית צלחת תרבית רקמה בעלת 24 בארות. הכינו תרחיף של 2 x 10⁵ תאי ורו / מ"ל במדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) בתוספת 2% נסיוב עגל עובר (FCS). זרע 500 μL של ההשעיה לכל באר.
      הערה: מחקר זה משתמש DMEM עם 2% FCS כדי לאפשר לתאים לגדול לאט יותר.
   2. יש לדגור למשך הלילה (ON; 12-16 שעות) בטמפרטורה של 37°C ו-5%_CO2 כדי להבטיח חיבור לתאים.
   3. לאחר הדגירה, יש לשטוף את התאים פעמיים באמצעות 500 μL של PBS סטרילי. הוסף T . cruzi trypomastigotes לתוך התאים בריבוי של זיהום (MOI) של 10 ב 100 μL של DMEM עם 2% FCS לכל באר, המקביל מיליון trypomastigotes לכל באר. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C ו-5%_CO2 למשך 6 שעות.
   4. לאחר הדגירה, שטפו את הצלחות פעמיים עם PBS. הוסף 500 μL של DMEM בתוספת 2% FCS. בשלב זה, המשך לשלב מניעת ההצלבה (סעיף 4).
      הערה: אמסטיגוטות תוך-ציטופלזמיות ייראו דרך מיקרוסקופ אופטי הפוך יומיים לאחר ההדבקה (איור משלים 1). לחלופין, לתקן את trypomastigotes עם מתנול קר במשך 7 דקות ב -20 ° C, או paraformaldehyde / glutaraldehyde במשך 10 דקות ב RT, לפני היצמדות של הטפילים לכיסוי.
3. להשיג trypomastigotes מתאי Vero נגועים.
   1. אספו את הסופרנאטנט של חד-שכבה של תאי ורו (מפגש של 30%-40%) הנגועים בטריפומסטיגוטים (MOI 1:10; בדגירה) 4 ימים לאחר ההדבקה.
      הערה: עבור בקבוק T-25, הריכוז ההתחלתי של תאי Vero בשימוש הוא 800,000 תאים, ועבור בקבוק T-75 הוא שני מיליון תאים.
   2. לקבוע את ריכוז טריפומסטיגוט באמצעות תא נויבאואר לספירת תאים. צנטריפוגה 4 x 10⁶ טריפומסטיגוטים ב 7,000 x גרם ב RT במשך 10 דקות.
   3. יש לשטוף עם PBS פעמיים ולהשהות מחדש ב-200 מיקרוליטר של PBS. יש למרוח על מכסה עגול בקוטר 12 מ"מ המצופה בפולי-די-ליזין (סעיף 1). יש לדגור במשך 10-15 דקות ב-RT. המשך בשלב מניעת ההצלבה (סעיף 4).
      הערה: לחלופין, תקן את הטריפומסטיגוטים עם מתנול קר למשך 7 דקות ב -20 ° C או paraformaldehyde / glutaraldehyde במשך 10 דקות ב RT לפני היצמדות הטפילים לכיסוי.

4. ביצוע מניעת crosslinking (יום 1)

1. השקיעו את הכיסוי בקוטר 12 מ"מ עם הטפילים המודבקים או התאים הנגועים (הפונים כלפי מעלה) בצלחת בת 24 בארות עם 0.5 מ"ל של תמיסת CP (שלב 2.3) בכל באר.
2. מלאו את הבארות הריקות במים כדי להפחית את האידוי. אוטמים את הצלחת בסרט איטום. לדגור במשך 5 שעות ב 37 ° C. שלב זה יכול להיות מורחב עד דגירה ON ב 4 ° C.
   הערה: תמיד לטבול את תלוש הכיסוי בתמיסה; אין לקלף את התמיסה המקבעת מעל הכיסויים.

5. ביצוע ג'לציה של המדגם

1. הרכיבו תא לח בצלוחית פטרי עם סרט איטום על גבי נייר טישו (איור 2A). הוסיפו מים לנייר הטישו ודגרו בטמפרטורה של -20°C למשך 20 דקות כדי להתקרר. הפשירו TEMED ו-APS על קרח במשך 20 דקות (שלב 2.6).
   הערה: אין להקפיא-להפשיר את ה-APS יותר משלוש פעמים.
2. הניחו את התא הקריר והלח על קרח (איור 2A). הוציאו את צלחת 24 הקידוחים שהוכנה בקטע 4 מתוך האינקובטור. שאפו את תמיסת CP עם פיפטה של 3 מ"ל פסטר, תוך השארת תמיסה כלשהי, אחרת יהיה קשה להסיר את הכיסויים.
3. הסירו את כיסויי ה-12 מ"מ מהתמיסה המקובעת בפינצטה והניחו אותם על נייר טישו כשהטפילים פונים כלפי מעלה.
   הערה: כדאי להשתמש במחט סטרילית כדי להרים את הכיסוי ולאחר מכן להחזיק אותו עם הפינצטה.
4. כדי aliquot של 90 μL של תמיסה מונומרית (שלב 2.4), להוסיף 5 μL של TEMED ו 5 μL של APS מופשר בעבר. מערבבים עם מערבל מערבולת לא יותר מ 2-3 שניות; אין צורך לסגור את הצינור עם המכסה.
   הערה: הוסף תמיד TEMED ראשון ו-APS אחרון. התוספת של APS ראשון ו-TEMED אחרון לתמיסה המונומרית הופכת את תהליך הג'לציה למהיר יותר, ולא נותנת זמן לתפעל אותו.
5. יש לטפטף במהירות טיפה אחת של 35 μL מעל סרט האיטום של התא הלח עבור כל כיסוי. הרימו מיד את הכיסוי עם פינצטה ושכבו מעל הטיפה (איור 2B) כשהטפילים פונים כלפי מטה.
   הערה: יש לבצע עד שני כיסויים בכל פעם; חשוב מאוד לא לעכב את השלב הזה כי התמיסה מתפלמרת מהר מאוד.
6. לדגור על החדר הלח במשך 5 דקות על קרח ולאחר מכן במשך 1 שעה ב 37 °C (77 °F). הפעל בלוק חימום ב 95 ° C כדי להבטיח את הטמפרטורה הנכונה לשלב הבא.

איור 2: פרטי שלב הגלציה. (A) הרכבה של החדר הלח. (B) הטלת החלקות הכיסוי על תמיסת המונומר עם TEMED ו-APS לג'לציה. (C) ייצוג סכמטי של הג'ל שהורכב להדמיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

6. דנטורציה של דגימות הג'ל וביצוע ההתפשטות האיזוטרופית

1. הסר את תמיסת הדנטורציה (שלב 2.5) מ- 4 מעלות צלזיוס. אם הוא זירז, לשים אותו באמבט מים חמים עד שהוא מתמוסס לחלוטין.
2. הוסף 2 מ"ל של פתרון denaturing לכל באר של צלחת 6 באר. העבירו את החלקות הכיסויים משלב 5.3 לצלחת עם תמיסת הדנטורציה. יש לדגור במשך 15 דקות ב-RT עם ניעור עדין כדי שהג'ל יתנתק מהכיסוי.
3. בזהירות להעביר את הג'ל (להסיר אותו מן כיסוי 12 מ"מ) עם מרית מתכת לתוך צינור microcentrifuge סטרילי 1.5 מ"ל עם 1 מ"ל של פתרון denaturing. השתמש במנעולי מכסה כדי לאבטח את הצינורות. יש לדגור במשך שעה ו-30 דקות בטמפרטורה של 95°C בבלוק חימום.
   הערה: ג'לים מתחילים להתרחב במהלך שלב זה; להיות עדין בעת העברת הג'ל לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל.
   אזהרה: לאחר הדגירה, הצינור המכיל את הג'ל נמצא בטמפרטורה של 95°C, מה שעלול להיות מסוכן. השתמש בכפפות מגן ותן לצינורות להתקרר לפני הטיפול בהם כדי למנוע כוויות והקרנות.
4. בצע את סבב ההרחבה הראשון
   1. לשאוף את הפתרון denaturing מן צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל עם ג'ל עם פיפטה P1000. מעבירים את הג'ל מצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל לצלחת פטרי עם 10 מ"ל מים אולטרה-טהורים למשך 30 דקות באמצעות מרית קטנה.
   2. החליפו את המים האולטרה-טהורים באמצעות פיפטה חד פעמית של 3 מ"ל פסטר. לדגור ON ב RT.
      הערה: היו עדינים עם הג'לים מכיוון שלאחר 30 הדקות הראשונות של הדגירה, הם הפכו שבירים.
   3. החליפו את המים האולטרה-טהורים באמצעות פיפטה חד פעמית של 3 מ"ל פסטר פעם נוספת.
      הערה: שלוש דגירות מים של 30 דקות כל אחת מספיקות, אך לפרקטיות, עדיף להשאיר את הדגירה השנייה דולקת.

7. ביצוע תיוג פלואורסצנטי של חלבוני המטרה (יום 2)

1. מוציאים את המים מצלחת הפטרי עם הג'ל עם פיפטה חד פעמית של 3 מ"ל. למדוד את הקוטר של ג'ל עם קליפר כדי לחשב את ההתפשטות (בין ארבע לחמש פעמים).
2. יש לשטוף פעמיים עם 10 מ"ל PBS למשך 15 דקות. חותכים את הג'ל עם סכין גילוח לריבועים של כ 10 מ"מ x 10 מ"מ במרכז הג'ל העגול. השתמש בריבוע אחד לכל תנאי כדי להיבדק.
   הערה: הג'ל מתכווץ לאחר דגירות PBS. ניתן לאחסן ג'לים ב-PBS בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבוע.
3. מעבירים כל ריבוע לצלחת של 12 בארות ודגרים עם 500 μL של נוגדן ראשוני מדולל באלבומין סרום בקר 2% PBS (BSA) למשך שעתיים ו-30 דקות ב-37°C עם רעידות.
   הערה: ניתן לבצע דגירה חלופית של נוגדנים ב-4°C. נפח הנוגדנים המינימלי שניתן להשתמש בו הוא 300 μL בצלחת 24 באר. ככלל, יש להשתמש בריכוז כפול של נוגדנים המשמשים לתיוג חיסוני קונבנציונלי.
4. יש לשטוף שלוש פעמים עם 2 מ"ל PBS עם 0.1% פוליסורבט 20 למשך 10 דקות תוך כדי ניעור צלחת של 6 בארות.
5. מעבירים את הג'ל לצלחת של 12 בארות ודגרים עם 500 מיקרוליטר של נוגדן משני ב-PBS עם DAPI ו-10 מיקרוגרם/מ"ל NHS-ester מצומד לפלואורופור הרצוי למשך שעתיים ו-30 דקות ב-37°C עם טלטול עדין.
   הערה: ככלל, יש להשתמש בריכוז כפול של נוגדנים המשמשים לתיוג חיסוני קונבנציונלי. לחלופין, דגירה זו יכולה להתבצע ON ב 4 ° C.
6. יש לשטוף שלוש פעמים עם 2 מ"ל PBS עם 0.1% פוליסורבט 20 למשך 10 דקות תוך כדי ניעור צלחת של 6 בארות.
7. מעבירים את הג'ל לצלחת פטרי עם מים טהורים במיוחד. דוגרים במשך 30 דקות. החליפו את המים פעמיים עם פיפטה חד פעמית של 3 מ"ל פסטר, כפי שנעשה בשלב 6.4.

8. הדמיה ועיבוד תמונה (יום 3)

1. מוציאים את המים מכלי הפטרי עם פיפטה חד פעמית של 3 מ"ל פסטר ומודדים את קוטר הג'ל עם קליפר כדי לחשב את גורם ההתפשטות.
2. חותכים חתיכה קטנה של ~ 10 מ"מ x 10 מ"מ עם סכין גילוח ומניחים אותה על צלחת תחתית זכוכית 35 מ"מ.
   הערה: כחלופה, הניחו את הג'ל בין מגלשה לכיסוי (ללא פולי-D-ליזין). המגלשה צריכה לכלול שתי חתיכות שקופיות קטנות יותר חתוכות עם סכין יהלום המחוברת בצדדים כדי ליצור תא בערך בעובי הג'ל.
3. בדוק את הכיוון בהגדלה של 10x או 20x. על מנת להתמקד כראוי, ודא כי הטפילים פונים אל הכיסוי; אחרת, צריך לסובב את הג'ל ולבדוק שוב (איור 2C).
4. לאחר מציאת הכיוון הנכון, יבש את יתרת הג'ל בנייר מיקרוסקופי. מכסים את הג'ל בכיסוי מצופה פולי-D-ליזין.
5. הוסף טיפה קטנה של מים טהורים במיוחד לג'ל כדי לדמיין עם מיקרוסקופ קונפוקלי.
   הערה: כדי להבטיח הדמיה נכונה, חשוב לשמור על כיוון הג'ל לאורך כל התהליך, כך שהצד של הג'ל המכיל תאים קרוב לפני השטח שלו פונה לצלחת תחתית הזכוכית בקצה. בעת שימוש בצלחות 35 מ"מ, הוספת פולי-D-ליזין לכיסוי המונח בתחתית מפחיתה את תזוזת הג'ל במהלך רכישת התמונה.
6. פרמטרים של רכישת תמונה
   1. דמיינו את הדגימות במיקרוסקופ קונפוקלי (טבלת חומרים) באמצעות טבילת שמן 63x 1.4 צמצם נומרי (NA).
   2. קבל ערימות Z, הרוחב של כל צעד z וזמן חשיפה לפיקסל, שייקבעו אמפירית בהתאם לדגימה, עוצמת האות ומיטוב זמני הרכישה. השתמש בזום הסריקה להגדלה יעילה, אם תרצה בכך.
   3. פתח את ערימת Z באמצעות תוכנת עיבוד תמונה (רשימת חומרים). לכל ערוץ, קבץ את התמונות המוערמות באמצעות האפשרות Group Z-project . בחר את הקרנת העוצמה המרבית.
   4. למיזוג תמונות, השתמשו בכלי מיזוג ערוצים ובחרו בצבע של כל ערוץ. הוסף סרגל קנה מידה באמצעות הכלי סרגל קנה מידה בתוכנת העיבוד.
      הערה: לחלופין, ניתן לצבוע כל ערוץ לפי הצורך (ראו דוגמאות בתוצאות המייצגות).

תוצאות

אם הפרוטוקול בוצע כראוי (איור 1), הדגימות ייראו כג'ל מישורי ושקוף שניתן להרחיב עד פי 4-4.5 במים (איור 3A). הרחבה זו סיפקה רזולוציה יעילה של כ -70 ננומטר, אשר עשויה להשתנות בהתאם לגורם ההתפשטות הסופי ומערכת ההדמיה בה נעשה שימוש. לאחר תהליך ההתפשטות...

Discussion

מיקרוסקופ הרחבה אולטרה-סטרוקטורלי הוא טכניקה המאפשרת קבלת תמונות ברזולוציה גבוהה של דגימות ביולוגיות על ידי הרחבתן פיזית עד פי כמה מגודלן המקורי. פרוטוקול U-ExM כולל מספר שלבים קריטיים שיש לבצע בזהירות כדי להשיג תוצאות אופטימליות⁴. ראשית, יש לתקן את המדגם עם ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 micrometers sterile syringe filters PES	Membrane solutions	SFPES030022S
1 L beaker	Schott Duran	10005227
1.5-mL SPINWIN Micro Centrifuge Tube	Tarson	T38-500010
10 mL disposable sterile serynge	NP	66-32
10 mL serological pipette sterile	Jet Biofil	GSP211010
12-mm coverslips	Merienfeld GmbH	01 115 20	Round coverslips
12-well plates	Jet Biofil	TCP011012
22-mm coverslips	Corning	2845-22	Square coverslips
24-well plates	Jet Biofil	TCP-011-024
250 mL beaker	Schott Duran	C108.1
3 mL Pasteur pipette	Deltalab	200037
35-mm glass bottom dishes	Matsunami glass ind	D11130H
4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride	Sigma Aldrich	D9542	DAPI
5 ml serological pipette sterile	Jet Biofil	GSP010005
6-well plates	Sarstedt	83.3920
Acrilamide	BioRad	1610101
Ammonium persulfate	Sigma Aldrich	A3678-25G	APS
ATTO 647 NHS ester	BOC Sciences	F10-0107	For pan-proteome labelling
Biosafty Cabinet	Telstar	Bio II A/P
Bovine Sodium Albumine	Sigma Aldrich	A7906	BSA
CO2 Incubator	Sanyo	MCO-15A
Confocal Microscope	Zeiss	LSM 880
Disposable Petridish	Tarsons	460095	90 mm diameter
DMEM, High Glucose	Thermo Fisher Cientific	12100046	Powder
Electronic digital caliper	Radar	RADAR-SLIDE-CALIPER
Ethanol Absolute	Supelco	1,00,98,31,000
Fetal Calf Serum	Internegocios SA	FCS FRA 500	Sterile and heat-inactivated
Fiji image processing package	ImageJ		doi:10.1038/nmeth.2019
Formaldehyde 37%	Sigma Aldrich	F8775	FA
Glass Petridish	Marienfeld Superior	PM-3400300	60 mm diameter
Glucosa D(+)	Cicarelli	716214
Glutaraldehyde 70%	Sigma Aldrich	G7776
Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 555	Invitrogen	A-21422
Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody FICT	Jackson Immunoresearch	115-095-003
Graduated cylinder	Nalgene	3663-1000
Graduated glass flask	Glassco	GL-274.202.01	100 mL
Heating Block	IBR		Made in house
Hemin	Frontier Scientific	H651-9
Hydrochloric acid 36.8-38.0%	Ciccarelli	918110
Ice bucket	Corning	1167U68
Incubator	Tecno Dalvo	TOC130
Liver Infusion	Difco	226920
Magnetic stirrer and heater	Lab companion	HP-3000
Metal spatula	SALTTECH	200MM
Metal tweezers	Marienfeld Superior	PM-6633002
Methanol absolut	Cicarelli	897110
Microcentrifuge tube 1.5 mL	Tarson	500010-N
Microscopy grade paper KimWipes	Kimtech Science	B0013HT2QW
Milli-Q water sistem	Merk Millipore	IQ-7003
mouse anti- alpha tubulin clone DM1A	Sigma Aldrich	T9026
mouse anti-PFR	Purified antibodies		Donated by Dr. Ariel Silber (USP)
N,N´-methylenbisacrilamide	ICN	193997	BIS
Na2HPO4	Cicarelli	834214
Neubauer chamber	Boeco	BOE 01
p1000 pipette	Gilson	PIPETMAN P1000
p1000 pipette tips	Tarson	TAR-521020B
p20 pipette	Gilson	PIPETMAN P20
p20 pipette tips	Tarson	TAR-527108
p200 pipette	Gilson	PIPETMAN P200
p200 pipette tips	Tarson	TAR-521010Y
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148	PFA
pH / ORP / °C meter	HANNA Instruments	HI 2211
Poly-D-Lysine 0.1%	Sigma Aldrich	P8920
Potassium Chloride	Cicarelli	867212	KCl
Razor blade	Printex	BS 2982:1992
Sealing FIlm "Parafilm M"	Bemis	PM996
Sodium Acrilate	Sigma Aldrich	408220-25G	SA
Sodium Bicarbonate	Cicarelli	929211	NaHCO3
Sodium Chloride	Cicarelli	750214	NaCl
Sodium Dodecyl Sulfate	BioRad	1610302	SDS
Sodium Hidroxide	Merk	1-06498	NaOH
Sorvall ST 16 Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	75004380
T-25 flasks	Corning	430639
TEMED	Invitrogen	15524-010
Tissue paper	Elite
Triptose	Merck	1106760500
Tris	BioRad	1610719
Tween-20	Biopack	2003-07	Polysorbate 20
Vaccum pump	Silfab	N33-A
Vero cells	ATCC	CRL-1587
Vortex MIxer	Dragon Lab	MX-S