Ультраструктурная экспансионная микроскопия на трех стадиях жизненного цикла in vitro Trypanosoma cruzi

Резюме

В этом исследовании представлен подробный протокол проведения ультраструктурно-экспансионной микроскопии на трех стадиях жизненного цикла in vitro Trypanosoma cruzi, патогена, ответственного за болезнь Шагаса. Мы включили оптимизированную технику для цитоскелетных белков и пан-протеомного мечения.

Аннотация

Мы описываем применение ультраструктурно-экспансионной микроскопии (U-ExM) у Trypanosoma cruzi, метода, который позволяет увеличить пространственное разрешение клетки или ткани для микроскопической визуализации. Это выполняется путем физического расширения образца с помощью готовых химикатов и обычного лабораторного оборудования.

Болезнь Шагаса является широко распространенной и насущной проблемой общественного здравоохранения, вызываемой T. cruzi. Болезнь распространена в Латинской Америке и стала серьезной проблемой в неэндемичных регионах из-за увеличения миграции. Передача T. cruzi происходит через гематофагов-переносчиков, принадлежащих к семействам Reduviidae и Hemiptera. После заражения T. cruzi amastigotes размножаются в организме млекопитающих-хозяев и дифференцируются в трипомастиготы, нерепликативную форму кровотока. В насекомых-переносчиках трипомастиготы превращаются в эпимастиготы и размножаются путем бинарного деления. Дифференциация между стадиями жизненного цикла требует обширной перестройки цитоскелета и может быть полностью воссоздана в лаборатории с использованием различных методов культивирования клеток.

Мы описываем подробный протокол применения U-ExM на трех стадиях жизненного цикла in vitro Trypanosoma cruzi, уделяя особое внимание оптимизации иммунолокализации белков цитоскелета. Мы также оптимизировали использование N-гидроксисукцинимидного эфира (NHS), пан-протеомной метки, которая позволила нам маркировать различные структуры паразитов.

Введение

Экспансионная микроскопия (ExM) была впервые описана в 2015 году Boyden et ^al.1. Это протокол визуализации, с помощью которого обычный микроскоп может достичь пространственного разрешения ниже дифракционного предела. Такое более высокое разрешение достигается за счет физического увеличения образца. Для этого флуоресцентно меченые молекулы сшиваются с гидрогелем, который впоследствии изотропно расширяется водой. В результате этого расширения сигналы разделяются почти изотропно во всех трех измерениях. В этом методе используются недорогие химические вещества, и он обеспечивает пространственное разрешение около 65 нм при использовании обычных (конфокальных) микроскопов, что примерно в четыре раза лучше, чем стандартное разрешение конфокального микроскопа (примерно 250 нм)¹.

Следующей вехой, позволившей использовать экспансионную микроскопию во многих биологических областях, стала адаптация иммунофлуоресцентного мечения обычными антителами². Еще одной адаптацией первоначально опубликованного протокола ExM является увеличенный анализ протеома (MAP)³. Этот метод позволил использовать высокие концентрации акриламида и параформальдегида перед погружением образца в гидрогель для предотвращения внутри- и межбелкового сшивания клеток, что привело к лучшему сохранению содержания белка и субклеточной архитектуры образцов. Этот альтернативный протокол был оптимизирован для получения улучшенного сохранения общей ультраструктуры выделенных органелл за счет использования более низких концентраций фиксаторов (формальдегида/параформальдегида и акриламида); этот подход получил название ультраструктурно-экспансионной микроскопии (U-ExM)⁴.

Для достижения еще большего разрешения также сообщалось о сочетании ExM с методами микроскопии сверхвысокого разрешения, включая микроскопию со стимулированным истощением эмиссии или микроскопию локализации одиночных молекул, для достижения разрешения ниже 20 нм⁵.

Использование ExM широко освещалось в области нейробиологии^{и исследований} цитоскелета6, но было проведено лишь несколько исследований паразитических протистов. Наша лаборатория первой сообщила о применении U-ExM у T. cruzi⁷. Протокол основания в основном основан на предыдущих отчетах U-ExM по Toxoplasma gondii, Plasmodium ssp. и Trypanosoma brucei 8,9,10,11.

Одним из самых больших преимуществ ExM является его модульная структура, которая обеспечивает большую гибкость для адаптации к различным биологическим образцам. Протокол может быть разделен на этапы (такие как фиксация, предотвращение сшивания или гелеобразование), которые могут быть легко скорректированы пользователем в соответствии с его экспериментальными требованиями. Кроме того, этот конвейер может быть изменен для повышения совместимости с модельным организмом или для достижения определенного разрешения. В результате, ExM предлагает огромный потенциал как для передовых, так и для непередовых оптических систем, обеспечивая более широкое применение в будущем.

Болезнь Шагаса, также называемая американским трипаносомозом, является эндемическим заболеванием в Латинской Америке, вызываемым простейшим паразитом Trypanosoma cruzi. Жизненный цикл паразита сложен и включает в себя две стадии развития у млекопитающих и две у насекомых-хозяев (членов семейства Triatominidae), которые являются биологическими переносчиками этого заболевания. Болезнь Шагаса относится к группе забытых тропических болезней, внесенных в список Всемирной организации здравоохранения, и представляет собой значительную экономическую и социальную проблему в Латинской Америке. По оценкам эпидемиологических исследований, 8 миллионов человек во всем мире живут с болезнью Шагаса и более 10 000 смертей в год. Эти цифры иллюстрируют важность болезни Шагаса как проблемы общественного здравоохранения во всем мире. Географическое распространение болезни Шагаса изменилось в последние десятилетия, и многие инфицированные люди в настоящее время проживают в крупных городских районах по всему миру из-за увеличения миграции, в отличие от преимущественно сельских районов Латинской Америки, где она^{была первоначально} обнаружена.

Стадии развития T. cruzi различаются на протяжении всего его жизненного цикла, который может быть полностью воспроизведен in vitro. Эпимастиготы являются репликативными формами в векторе насекомых и имеют сферическое ядро в центральной области тела клетки и кинетопласт в форме стержня (структура, содержащая митохондриальную ДНК, уникальная для кинетопластид) в передней области относительно ядра, со свободным жгутиком. Трипомастиготы являются инфекционной, нерепликативной формой и имеют удлиненное ядро, закругленный задний кинетопласт и жгутик, прикрепленный к плазматической мембране по всей длине паразита. Амастиготы являются внутриклеточной репликативной формой; Они имеют ядро в центральной области, палочковидный кинетопласт в передней части тела клетки и редуцированный жгутик. Приспособляемость паразита к различным условиям окружающей среды является отражением этих морфологических вариаций. Стоит также упомянуть, что этот жизненный цикл включает в себя симметричное деление и различные переходные стадии^{развития13}. Во время дифференцировки цитоскелет трипаносоматид играет решающую роль. Эта структура образована корсетом субпелликулярных микротрубочек, расположенных в упорядоченном массиве стабильных микротрубочек ниже плазматической мембраны. Кроме того, у этих организмов присутствует парафлагеллярный стержень, который представляет собой решетчатую структуру, идущую параллельно и прикрепленную к жгутиковой аксонеме¹⁴. Точная организация цитоскелета и ядерные структурные изменения на этапах клеточного цикла включают уникальные механизмы регуляции генов, специфичные для трипаносоматид, что делает их интересными моделями для исследований клеточной биологии.

Учитывая небольшие размеры T. cruzi и других простейших паразитов, U-ExM представляет собой отличный инструмент для анализа структурных особенностей этих важных патогенов. Как упоминалось ранее, применимость этой методики к T. cruzi была впервые подтверждена доктором Алонсо⁷. В этом отчете подробно описан полный протокол U-ExM с акцентом на иммунолокализацию белков цитоскелета на различных стадиях жизненного цикла T. cruzi. Кроме того, мы оптимизировали использование N-гидроксисукцинимидного эфира (NHS), пан-протеомной метки, которая позволяет нам маркировать различные структуры паразитов. Кроме того, описана методика in vitro для получения трех стадий паразита.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 показан полный план эксперимента.

Рисунок 1: Рабочий процесс U-ExM для трех стадий жизненного цикла T. cruzi in vitro. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

1. Подготовка покровного стекла с поли-D-лизиновым покрытием

1. Поместите квадрат пленки размером 10 см х 10 см в чашку Петри. Промойте покровные стекла, погрузив их в абсолютный этанол в стеклянную чашку Петри диаметром 35 мм.
2. Снимите покровные стекла пинцетом с ванны с этанолом и слейте лишнюю жидкость с помощью папиросной бумаги. Поместите покровные стекла поверх герметизирующей пленки.
3. Впитайте оставшуюся часть этанола с помощью бумаги для микроскопии. Добавьте 0,1% v/v раствор поли-D-лизина в центр покровного стекла и распределите его кончиком, чтобы покрыть примерно 80% его поверхности. Закройте чашку Петри и выдерживайте в течение 1 часа при температуре 37 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для^{2 покровных} стекол диаметром 22 мм используйте 200 μл раствора поли-D-лизина; для круглых покровных крышек 12 мм используйте 100 мкл раствора поли-D-лизина.
4. Промойте покровные стекла ультрачистой водой три раза. Используйте аспирацию с пылесосом для удаления воды между каждой стиркой. Хранить при температуре 4 °C до 1 недели.

2. Приготовление раствора

1. Приготовьте стоковые растворы из 38% (масс./мас.) акрилата натрия (СК).
   1. Медленно добавьте 19 г SA в 31 мл воды, не содержащей нуклеаз, помешивая.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раствор очень вязкий; Будьте внимательны при пипетировании.
   2. Как только СК полностью растворится, храните его в стерильном контейнере. Держите его при температуре 4 °C и меняйте каждые 6 месяцев.
      ПРИМЕЧАНИЕ: SA иногда проявляет признаки загрязнения полиакрилатом натрия в зависимости от марки, что заметно при приготовлении исходного раствора, так как он становится желтоватым и мутным. В этом случае используйте его с осторожностью.
2. Приготовьте исходный раствор из 40% (w/v) акриламида (AA) и исходный раствор из 2% (w/v) N'-метиленбисакриламида (BIS). Растворите каждое соединение в ультрачистой воде и отфильтруйте стерильным шприцевым фильтром 0,22 мкм. Хранить в стерильном контейнере при температуре 4 °C.
   ВНИМАНИЕ: АА и БИС являются высокотоксичными веществами. Работайте под вытяжным шкафом и используйте надлежащие элементы защиты (перчатки, защитную одежду, маску и защитные очки).
3. Приготовьте раствор для предотвращения сшивки белков (ЦП), смешав 38 мкл 37% раствора формальдегида (ЖК) с 50 мкл 40% исходного раствора акриламида (стадия 2.2) в 912 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS; Таблица 1) Получить конечную концентрацию 1,4% формальдегида и 2% акриламида.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда готовьте раствор CP свежим и будьте предельно точны при пипетировании. Например, используйте пипетку P1000 для забора 900 μл PBS и пипетку P20 для забора оставшихся 12 μл PBS.
4. Приготовьте мономерный раствор
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте раствор сразу после приготовления; хранить при температуре -20 °C не менее 24 часов перед использованием.
   1. Смешайте 500 мкл 38% раствора SA (шаг 2.1), 250 μл 40% раствора AA и 50 μл раствора BIS (шаг 2.2), а также 100 μл 10x PBS (Таблица 1).
   2. Распределите этот конечный объем 900 мкл в 10 микроцентрифужных пробирках по 1,5 мл по 90 мкл мономерного раствора каждая. Хранить при температуре -20 °C до 2 недель.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор SA может оставаться на кончике при пипетировании, потому что он очень вязкий; Будьте осторожны и выдавайте все.
5. Приготовьте денатурирующий раствор
   1. Смешайте 114,3 мл 350 мМ раствора додецилсульфата натрия (SDS), приготовленного в ультрачистой воде, с 10 мл 4 М раствора натрия хлорида, приготовленного в сверхчистой воде. Добавьте 12 г триса, помешивая, в стакан объемом 250 мл.
      ВНИМАНИЕ: SDS очень токсичен; Используйте его под вытяжным шкафом в перчатках, защитной одежде, маске и защитных очках.
   2. Отрегулируйте pH до 9 с помощью концентрированного раствора соляной кислоты. Смешайте до 200 мл сверхчистой воды и храните в стерильной колбе при температуре 4 °C.
6. Приготовьте 10% раствор персульфата аммония (APS) и 10% раствор TEMED.
   1. Растворите 0,1 г APS в 1 мл сверхчистой воды.
   2. Приготовьте 1 мл 10% раствора TEMED в ультрачистой воде.
   3. Приготовьте по 100 мкл аликвот обоих растворов в микроцентрифужных стерильных пробирках объемом 1,5 мл и храните их при температуре -20 °C до 1 месяца.
7. Приготовьте раствор параформальдегида.
   1. Растворите 2 г параформальдегида в 40 мл PBS при перемешивании при 60 °C. Добавляйте 1 М NaOH по каплям, пока раствор не превратится из белого в бесцветный.
      ВНИМАНИЕ: Формальдегид очень токсичен; Используйте его под вытяжным шкафом в перчатках, защитной одежде, маске и защитных очках.
   2. Охладите раствор до комнатной температуры и отрегулируйте pH с помощью NaOH до 7,2 в конечном объеме 50 мл. Отфильтровать стерильным шприцевым фильтром 0,22 мкм и хранить в стерильном контейнере.
   3. Приготовьте аликвоты по 1 мл в стерильных микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 мл и храните при температуре -20 °С.
8. Приготовьте раствор параформальдегида/глутаральдегида.
   1. Добавьте 0,2 г параформальдегида в 3,5 мл ультрачистой воды и 50 мкл 16 М раствора NaOH. Нагрейте раствор до 60 °C, чтобы растворить параформальдегид.
   2. Остудите и добавьте 300 мкл 70% глутаральдегида. Увеличьте объем до 5 мл с помощью ультрачистой воды и, наконец, до 10 мл с помощью PBS.
      ВНИМАНИЕ: Параформальдегид и глутаральдегид обладают высокой токсичностью; Используйте их под вытяжным шкафом в перчатках, защитной одежде, маске и защитных очках.
   3. Приготовьте аликвоты по 1 мл в стерильных микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 мл и храните при температуре -20 °С.

3. Подготовка культур от паразитов

1. Выращивайте T. cruzi epimastigotes.
   1. Используйте аксеническую культуру в колбе Т-25 (площадь роста 25^см2 ) и поддерживайте культуры в логарифмической фазе путем субкультивирования каждые 48-72 ч в среде для инфузии печени триптозы (LIT) с 10% сывороткой плода телят (FCS; Таблица 1).
   2. Убедитесь, что крышка надежно закрыта, и держите колбу с культурой вертикально при температуре 28 °C для инкубации. Контролируйте рост паразитов путем подсчета клеток в камере Нейбауэра во время каждой субкультуры.
      Примечание: Для штамма Dm28c, используемого в этом исследовании, концентрация эпимастигот в культурах логарифмической фазы составляет от 1 до 5 x 10⁷ паразитов/мл.
   3. Приготовьте суспензию 2 х^{10 6} эпимастигот/мл из логарифмической культуры в среде ЛИТ с добавлением 10% FCS. Центрифугируйте суспензию при давлении 5 000 x g в течение 10 минут при комнатной температуре (RT). Промойте PBS один или два раза и снова суспендируйте в 200 мкл PBS.
   4. Приклейте к круглому покровному стекло толщиной 12 мм, предварительно покрытому поли-D-лизином (секция 1). Инкубировать при RT в течение 15-20 мин. Перейдите к шагу по предотвращению сшивки (раздел 4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы можно зафиксировать эпимастиготы холодным метанолом в течение 7 минут или раствором параформальдегида/глутаральдегида (шаг 2.8) в течение 10 минут при температуре RT до прилипания паразитов к покровному листу. Возможно хранение неподвижных паразитов при температуре 4 °C до 1 недели.
2. Получите амастиготы из инфицированных клеток Vero.
   1. Положите стерильный круглый покровный лист диаметром 12 мм на дно 24-луночного планшета для культивирования тканей. Приготовьте суспензию 2 x 10⁵ клеток Vero/мл в модифицированной среде Dulbecco Eagle (DMEM) с добавлением 2% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS). Семян 500 мкл суспензии на лунку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании используется DMEM с 2% FCS, чтобы позволить клеткам расти медленнее.
   2. Инкубировать в течение ночи (ON; 12-16 ч) при 37 °C и 5%_CO2 для обеспечения прикрепления клеток.
   3. После инкубации клетки дважды промыть, используя 500 мкл стерильного PBS. Добавляйте трипомастиготы T. cruzi в клетки при кратности инфекции (MOI) 10 на 100 мкл DMEM с 2% FCS на лунку, что соответствует одному миллиону трипомастигот на лунку. Инкубировать при 37 °C и 5%_CO2 в течение 6 часов.
   4. После инкубации дважды промойте планшеты PBS. Добавьте 500 мкл DMEM с добавлением 2% FCS. На этом этапе перейдите к шагу предотвращения сшивки (раздел 4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Интрацитоплазматические амастиготы будут видны через инвертированный оптический микроскоп через 2 дня после заражения (дополнительный рисунок 1). В качестве альтернативы трипомастиготы можно зафиксировать холодным метанолом в течение 7 мин при -20 °C или параформальдегидом/глутаральдегидом в течение 10 мин при RT, до прилипания паразитов к покровному стеклу.
3. Получение трипомастиготов из инфицированных клеток Vero.
   1. Соберите надосадочную жидкость монослоя клеток Vero (30%-40% слияние), зараженного трипомастиготами (MOI 1:10; На инкубации) через 4 дня после заражения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для колбы Т-25 используемая начальная концентрация клеток Vero составляет 800 000 клеток, а для колбы Т-75 - два миллиона клеток.
   2. Определение концентрации трипомастиготы с помощью камеры Нейбауэра для подсчета клеток. Центрифуга 4 x 10⁶ трипомастигот при 7 000 x g при RT в течение 10 мин.
   3. Дважды промойте PBS и повторно суспендируйте в 200 мкл PBS. Нанесите на круглый покровный лист толщиной 12 мм, покрытый поли-D-лизином (раздел 1). Инкубировать в течение 10-15 минут при RT. Приступайте к этапу профилактики сшивки (раздел 4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы зафиксируйте трипомастиготы холодным метанолом в течение 7 минут при -20 °C или параформальдегидом/глутаральдегидом в течение 10 минут при RT до прилипания паразитов к покровному стеклу.

4. Выполнение профилактики сшивки (ДЕНЬ 1)

1. Погрузите покровное стекло диаметром 12 мм с прилипшими паразитами или инфицированными клетками (лицевой стороной вверх) в 24-луночный планшет с 0,5 мл раствора CP (шаг 2,3) в каждую лунку.
2. Заполните пустые лунки водой, чтобы уменьшить испарение. Заклейте пластину герметизирующей пленкой. Выдерживать в течение 5 ч при 37 °C. Этот этап может быть продлен до инкубации ON при 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда погружайте покровное стекло в раствор; Не наносите фиксирующий раствор пипеткой на покровные стекла.

5. Выполнение гелеобразования образца

1. Соберите влажную камеру в чашке Петри с запечатывающей пленкой поверх папиросной бумаги (рисунок 2А). Добавьте воду в папиросную бумагу и выдерживайте при температуре -20 °C в течение 20 минут, чтобы остыть. Разморозьте аликвоту TEMED и APS на льду в течение 20 минут (шаг 2.6).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не замораживайте-размораживая APS более трех раз.
2. Положите прохладную влажную камеру на лед (рисунок 2А). Выньте из инкубатора планшет на 24 лунки, приготовленный в секции 4. Отсадите раствор CP с помощью пипетки Пастера объемом 3 мл, оставляя немного раствора, иначе покровные стекла будет трудно удалить.
3. Снимите пинцетом 12 мм покровные стекла с фиксирующего раствора и разложите их на папиросной бумаге паразитами вверх.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Полезно использовать стерильную иглу, чтобы поднять покровную крышку, а затем удерживать ее пинцетом.
4. К аликвоте 90 мкл мономерного раствора (шаг 2.4) добавить 5 мкл TEMED и 5 мкл ранее размороженного APS. Перемешивать вихревым миксером не более 2-3 с; Закрывать трубку крышкой не нужно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда добавляйте TEMED первым, а APS последним. Добавление сначала APS и TEMED в последний раз в мономерный раствор ускоряет процесс гелеобразования, не оставляя времени на манипуляции.
5. Быстро нанесите одну каплю объемом 35 мкл на уплотнительную пленку влажной камеры для каждого покровного стекла. Сразу же поднимите покровный лист пинцетом и положите на каплю (рисунок 2Б) паразитами вниз.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сделайте не более двух конвертов за один раз; Очень важно не затягивать с этим шагом, потому что раствор очень быстро полимеризуется.
6. Инкубируйте влажную камеру в течение 5 минут на льду, а затем в течение 1 часа при температуре 37 °C. Включите нагревательный блок на 95 °C, чтобы обеспечить правильную температуру для следующего шага.

Рисунок 2: Детали этапа гелеобразования. (A) Сборка влажной камеры. (B) Опускание покровных стекол на раствор мономера с TEMED и APS для гелеобразования. (C) Схематическое изображение геля, собранного для визуализации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

6. Денатурация гелеобразных образцов и выполнение изотропного расширения

1. Удалите раствор для денатурации (шаг 2,5) с температуры 4 °C. Если он выпал в осадок, поставьте его на водяную баню с горячей водой до полного растворения.
2. Добавьте по 2 мл денатурирующего раствора в каждую лунку 6-луночного планшета. Перенесите покровные стекла с шага 5.3 на пластину с раствором для денатурации. Инкубировать в течение 15 минут при РТ с легким встряхиванием, чтобы гель отделился от покровного стекла.
3. Осторожно переложите гель (сняв его с покровного стекла 12 мм) металлическим шпателем в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл с 1 мл денатурирующего раствора. Используйте колпачковые замки для фиксации пробирок. Выдерживать в течение 1 ч 30 мин при температуре 95 °C в нагревательном блоке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе гели начинают расширяться; Будьте осторожны при переносе геля в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
   ВНИМАНИЕ: После инкубации температура в пробирке, содержащей гель, составляет 95 °C, что может быть опасно. Используйте защитные перчатки и дайте трубкам остыть, прежде чем брать их в руки, чтобы избежать ожогов и выступов.
4. Выполнение первого раунда расширения
   1. Отсадите денатурирующий раствор из микроцентрифужной пробирки объемом 1,5 мл с гелем с помощью пипетки P1000. Перенесите гель из микроцентрифужной пробирки объемом 1,5 мл в чашку Петри с 10 мл сверхчистой воды в течение 30 минут с помощью небольшого шпателя.
   2. Замените сверхчистую воду с помощью одноразовой пипетки Пастера объемом 3 мл. Incubate ON в RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны с гелями, потому что после первых 30 минут инкубации они стали хрупкими.
   3. Смените сверхчистую воду с помощью одноразовой пипетки Пастера объемом 3 мл еще раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Достаточно трех водных инкубаций по 30 минут каждая, но для практичности лучше оставить вторую инкубацию включенной.

7. Выполнение флуоресцентного мечения целевых белков (ДЕНЬ 2)

1. Удалите воду из чашки Петри с помощью геля с помощью одноразовой пипетки Пастера объемом 3 мл. Измерьте диаметр геля с помощью штангенциркуля, чтобы рассчитать расширение (от четырех до пяти раз).
2. Дважды умыться 10 мл PBS в течение 15 минут. Разрежьте гель лезвием бритвы на квадраты размером примерно 10 мм х 10 мм в центре круглого геля. Используйте один квадрат для каждого тестируемого условия.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Гель сжимается после инкубации PBS. Гели могут храниться в PBS при температуре 4 °C до 1 недели.
3. Переложите каждый квадрат в 12-луночный планшет и инкубируйте с 500 мкл первичного антитела, разведенного в 2% PBS-бычьем сывороточном альбумине (BSA) в течение 2 ч 30 мин при 37 °C с встряхиванием.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация альтернативных антител может быть выполнена при 4 °C. Минимальный объем антитела, который можно использовать, составляет 300 мкл в 24-луночном планшете. Как правило, используйте в два раза большую концентрацию антител, чем для обычного иммуномечения.
4. Трижды промыть 2 мл PBS с 0,1% полисорбатом 20 в течение 10 минут, встряхивая в 6-луночной тарелке.
5. Переложите гель в 12-луночный планшет и инкубируйте с 500 мкл вторичного антитела в PBS с DAPI и 10 мкг/мл NHS-эфира, конъюгированного с нужным флуорофором, в течение 2 ч 30 мин при 37 °C с легким встряхиванием.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, используйте в два раза больше концентраций антител, чем для обычного иммуномечения. В качестве альтернативы эту инкубацию можно проводить при температуре 4 °C.
6. Трижды промыть 2 мл PBS с 0,1% полисорбатом 20 в течение 10 минут, встряхивая в 6-луночной тарелке.
7. Переложите гель в чашку Петри со сверхчистой водой. Выдерживать в течение 30 минут. Дважды смените воду с помощью одноразовой пипетки Пастера объемом 3 мл, как это сделано в шаге 6.4.

8. Визуализация и обработка изображений (ДЕНЬ 3)

1. Удалите воду из чашек Петри с помощью одноразовой пипетки Пастера объемом 3 мл и измерьте диаметр геля штангенциркулем для расчета коэффициента расширения.
2. Отрежьте небольшой кусочек размером ~10 мм x 10 мм лезвием бритвы и положите его на блюдо со стеклянным дном 35 мм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы поместите гель между предметным стеклом и покровным стеклом (без поли-D-лизина). Предметное стекло должно иметь две меньшие части предметного стекла, разрезанные алмазным ножом, прикрепленными по бокам, чтобы сформировать камеру толщиной примерно с гелем.
3. Проверьте ориентацию при 10-кратном или 20-кратном увеличении. Чтобы правильно сосредоточиться, убедитесь, что паразиты находятся лицом к покровному листу; в противном случае нужно перевернуть гель и снова проверить (Рисунок 2C).
4. Как только будет найдена правильная ориентация, высушите оставшийся гель бумагой для микроскопии. Накройте гель покровным стеклом с покрытием из поли-D-лизина.
5. Добавьте в гель небольшую каплю сверхчистой воды для визуализации с помощью конфокального микроскопа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения правильной визуализации крайне важно поддерживать ориентацию геля на протяжении всего процесса, чтобы сторона геля, содержащего клетки рядом с его поверхностью, была обращена к чашке со стеклянным дном в конце. При использовании посуды диаметром 35 мм добавление поли-D-лизина в покровное стекло, расположенное на дне, уменьшает смещение геля во время получения изображения.
6. Параметры получения изображения
   1. Визуализируйте образцы в конфокальный микроскоп (Таблица материалов) с помощью объектива с 63-кратным погружением в масло с числовой апертурой 1,4.
   2. Получите стеки Z, ширину каждого шага z и время экспозиции на пиксель, которые будут определены опытным путем в зависимости от выборки, интенсивности сигнала и оптимизации времени сбора. При желании используйте скан-зум для эффективного увеличения.
   3. Откройте стек Z с помощью программного обеспечения для обработки изображений (Таблица материалов). Для каждого канала сгруппируйте сложенные изображения с помощью опции «Сгруппировать Z-проект ». Выберите проекцию максимальной интенсивности.
   4. Чтобы объединить изображения, используйте инструмент «Объединить каналы » и выберите цвет каждого канала. Добавьте масштабную линейку с помощью инструмента «Масштабная линейка » в программном обеспечении для обработки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы можно раскрасить каждый канал по своему усмотрению (см. примеры в репрезентативных результатах).

Результаты

Если протокол был выполнен правильно (Рисунок 1), образцы будут видны в виде плоского и полупрозрачного геля, который может быть увеличен в воде до 4-4,5 раз (Рисунок 3A). Это расширение обеспечило эффективное разрешение около 70 нм, которое м...

Обсуждение

Ультраструктурная экспансионная микроскопия — это метод, который позволяет получать изображения биологических образцов с высоким разрешением путем их физического расширения в несколько раз по сравнению с первоначальным размером. Протокол U-ExM включает в себя неско...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 micrometers sterile syringe filters PES	Membrane solutions	SFPES030022S
1 L beaker	Schott Duran	10005227
1.5-mL SPINWIN Micro Centrifuge Tube	Tarson	T38-500010
10 mL disposable sterile serynge	NP	66-32
10 mL serological pipette sterile	Jet Biofil	GSP211010
12-mm coverslips	Merienfeld GmbH	01 115 20	Round coverslips
12-well plates	Jet Biofil	TCP011012
22-mm coverslips	Corning	2845-22	Square coverslips
24-well plates	Jet Biofil	TCP-011-024
250 mL beaker	Schott Duran	C108.1
3 mL Pasteur pipette	Deltalab	200037
35-mm glass bottom dishes	Matsunami glass ind	D11130H
4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride	Sigma Aldrich	D9542	DAPI
5 ml serological pipette sterile	Jet Biofil	GSP010005
6-well plates	Sarstedt	83.3920
Acrilamide	BioRad	1610101
Ammonium persulfate	Sigma Aldrich	A3678-25G	APS
ATTO 647 NHS ester	BOC Sciences	F10-0107	For pan-proteome labelling
Biosafty Cabinet	Telstar	Bio II A/P
Bovine Sodium Albumine	Sigma Aldrich	A7906	BSA
CO2 Incubator	Sanyo	MCO-15A
Confocal Microscope	Zeiss	LSM 880
Disposable Petridish	Tarsons	460095	90 mm diameter
DMEM, High Glucose	Thermo Fisher Cientific	12100046	Powder
Electronic digital caliper	Radar	RADAR-SLIDE-CALIPER
Ethanol Absolute	Supelco	1,00,98,31,000
Fetal Calf Serum	Internegocios SA	FCS FRA 500	Sterile and heat-inactivated
Fiji image processing package	ImageJ		doi:10.1038/nmeth.2019
Formaldehyde 37%	Sigma Aldrich	F8775	FA
Glass Petridish	Marienfeld Superior	PM-3400300	60 mm diameter
Glucosa D(+)	Cicarelli	716214
Glutaraldehyde 70%	Sigma Aldrich	G7776
Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 555	Invitrogen	A-21422
Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody FICT	Jackson Immunoresearch	115-095-003
Graduated cylinder	Nalgene	3663-1000
Graduated glass flask	Glassco	GL-274.202.01	100 mL
Heating Block	IBR		Made in house
Hemin	Frontier Scientific	H651-9
Hydrochloric acid 36.8-38.0%	Ciccarelli	918110
Ice bucket	Corning	1167U68
Incubator	Tecno Dalvo	TOC130
Liver Infusion	Difco	226920
Magnetic stirrer and heater	Lab companion	HP-3000
Metal spatula	SALTTECH	200MM
Metal tweezers	Marienfeld Superior	PM-6633002
Methanol absolut	Cicarelli	897110
Microcentrifuge tube 1.5 mL	Tarson	500010-N
Microscopy grade paper KimWipes	Kimtech Science	B0013HT2QW
Milli-Q water sistem	Merk Millipore	IQ-7003
mouse anti- alpha tubulin clone DM1A	Sigma Aldrich	T9026
mouse anti-PFR	Purified antibodies		Donated by Dr. Ariel Silber (USP)
N,N´-methylenbisacrilamide	ICN	193997	BIS
Na2HPO4	Cicarelli	834214
Neubauer chamber	Boeco	BOE 01
p1000 pipette	Gilson	PIPETMAN P1000
p1000 pipette tips	Tarson	TAR-521020B
p20 pipette	Gilson	PIPETMAN P20
p20 pipette tips	Tarson	TAR-527108
p200 pipette	Gilson	PIPETMAN P200
p200 pipette tips	Tarson	TAR-521010Y
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148	PFA
pH / ORP / °C meter	HANNA Instruments	HI 2211
Poly-D-Lysine 0.1%	Sigma Aldrich	P8920
Potassium Chloride	Cicarelli	867212	KCl
Razor blade	Printex	BS 2982:1992
Sealing FIlm "Parafilm M"	Bemis	PM996
Sodium Acrilate	Sigma Aldrich	408220-25G	SA
Sodium Bicarbonate	Cicarelli	929211	NaHCO3
Sodium Chloride	Cicarelli	750214	NaCl
Sodium Dodecyl Sulfate	BioRad	1610302	SDS
Sodium Hidroxide	Merk	1-06498	NaOH
Sorvall ST 16 Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	75004380
T-25 flasks	Corning	430639
TEMED	Invitrogen	15524-010
Tissue paper	Elite
Triptose	Merck	1106760500
Tris	BioRad	1610719
Tween-20	Biopack	2003-07	Polysorbate 20
Vaccum pump	Silfab	N33-A
Vero cells	ATCC	CRL-1587
Vortex MIxer	Dragon Lab	MX-S