A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
הפקת שושלות של מערכת העצבים האנטרית (ENS) מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC) מספקת מקור מדרגי של תאים לחקר התפתחות ומחלות של ENS, ולשימוש ברפואה רגנרטיבית. כאן, מוצג פרוטוקול מבחנה מפורט להפקת נוירונים אנטריים מתאי גזע גזעיים גזעיים (hPSCs) באמצעות תנאי תרבית המוגדרים כימית.
מערכת העצבים האנטרית האנושית, ENS, היא רשת גדולה של סוגי תאי גלייה ותאי עצב עם מגוון נוירוטרנסמיטרים מדהים. מערכת ENS שולטת בתנועתיות המעי, בהפרשת אנזימים ובספיגת אבות מזון, ומקיימת אינטראקציה עם מערכת החיסון ועם מיקרוביום המעי. כתוצאה מכך, פגמים התפתחותיים ונרכשים של ENS אחראים למחלות אנושיות רבות ועשויים לתרום לסימפטומים של מחלת פרקינסון. מגבלות במערכות מודל של בעלי חיים וגישה לרקמות ראשוניות מציבות אתגרים ניסיוניים משמעותיים במחקרים של ENS אנושי. כאן, מוצג פרוטוקול מפורט לגזירה חוץ גופית יעילה של שושלות ENS מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים, hPSC, תוך שימוש בתנאי תרבית מוגדרים. הפרוטוקול שלנו מתחיל בהתמיינות מכוונת של hPSCs לתאי פסגה עצבית אנטרית תוך 15 יום ומניב תת-סוגים מגוונים של נוירונים אנטריים פונקציונליים תוך 30 יום. פלטפורמה זו מספקת משאב מדרגי למחקרים התפתחותיים, מידול מחלות, גילוי תרופות ויישומים רגנרטיביים.
מערכת העצבים האנטרית (ENS) היא המרכיב הגדול ביותר של מערכת העצבים ההיקפית. ה-ENS מכיל יותר מ-400 מיליון תאי עצב הממוקמים במערכת העיכול ושולטים כמעט בכל תפקודיהמעי 1. הבנה מולקולרית של התפתחות ותפקוד ENS ופגמיו בנוירופתיות אנטריות דורשת גישה למקור אמין ואותנטי של נוירונים אנטריים. הגישה לרקמה הראשונית האנושית מוגבלת, ומודלים של בעלי חיים אינם מצליחים לשחזר פנוטיפים של מחלות מפתח בנוירופתיות אנטריות רבות. טכנולוגיית תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC) הוכחה כמועילה ביותר במתן מקור בלתי מוגבל של סוגי תאים רצויים, במיוחד אלה שקשה לבודד ממקורות ראשוניים 2,3,4,5,6,7.
1. הכנת מדיה
הערה: הריכוזים המוזכרים לאורך הפרוטוקול הם ריכוזים סופיים של רכיבי המדיה. הכינו את כל המדיה בתנאים סטריליים במכסה מנוע של זרימה למינרית, ואחסנו בטמפרטורה של 4°C בחושך. יש להשתמש תוך שבועיים.
פרוטוקול זה מספק שיטה להפיק פסגה עצבית אנטרית ותאי עצב אנטריים מתאי גזע גזעיים גזעיים (hPSCs) באמצעות תנאי תרבית המוגדרים כימית (איור 1A-B). יצירת נוירונים באיכות גבוהה תלויה בשלב אינדוקציה יעיל של סמל עצבי אנטרי. ניתן להעריך זאת באופן חזותי על-ידי בדיקת המורפולוגיה של.......
פרוטוקול ההתמיינות המתואר כאן מספק שיטה חזקה במבחנה להשגת תאי עצב אנטריים מתאי גזע גזעיים גזעיים (hPSCs) בתוך 30-40 יום (איור 1E) ותאי גליה אנטריים המבטאים חלבון חומצי גליה פיברילרי, GFAP ו-SOX10 בתרביות ישנות יותר (> יום 55)13,14,19,22........
למחברים אין מה לחשוף.
העבודה נתמכה על ידי מענקים מתוכנית UCSF למחקר ביו-רפואי פורץ דרך וקרן סנדלר, מענק March of Dimes מס' 1-FY18-394 ו- 1DP2NS116769-01, פרס החדשנות החדשה של מנהל ה- NIH (DP2NS116769) ל- F.F. והמכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות (R01DK121169) ל- F.F., H.M. נתמך על ידי מלגת הפוסט-דוקטורט של קרן לארי ל. הילבלום, מלגת NIH T32-DK007418 ותוכנית UCSF למחקר ביו-רפואי פורץ דרך מלגת פוסט-דוקטורט עצמאית.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
B27 supplement (serum free, minus vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
Basement membrane matrix, Geltrex | Gibco | A14133-2 | |
BMP4 | R&D systems | 314-BP | |
Cell culture centrifuge | Eppendorf, model no. 5810R | 02262501 | |
Cell detachment solution, Accutase | Stemcell Technologies | 07920 | |
CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
Conical tubes | USA scientific | 1475-0511, 1500-1211 | |
Differentiation base medium, Essential 6 | Life Technologies | A1516401 | |
DMEM/F-12 no glutamine | Life Technologies | 21331020 | |
EDTA | Corning | MT-46034CI | |
Feeder-free hPSC maintenance medium, Essential 8 Flex Medium Kit | Life Technologies | A2858501 | |
FGF2 | R&D systems | 233-FB/CF | |
Fibronectin | Corning | 356008 | |
GDNF | Peprotech | 450-10 | |
Hemocytometer | Hausser Scientific | 1475 | |
Human pluripotent stem cells, H9 ESC | WiCell | RRID: CVCL_1240 | |
Incubator with controlled humidity, temperature and CO2 | Thermo Fisher Scientific | Herralcell 150i | |
Inverted microscope | Thermo Fisher Scientific | EVOS FL | |
Laminar flow hood | Thermo Fisher Scientific | 1300 series class II, type A2 | |
Laminin | Cultrex | 3400-010 | |
L-glutamine supplement, Glutagro | Corning | 25-015-CI | |
MEM NEAAs | Corning | 25-025-CI | |
Multiwell plates, Falcon | BD | 353934, 353075 | |
N-2 Supplement | CTS | A1370701 | |
Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103049 | |
PBS (Ca and Mg free) | Life Technologies | 10010023 | |
Pipette filler | Eppendorf | Z768715-1EA | |
Pipette tips | USA scientific | 1111-2830 | |
Pipettes | Fisherbrand | 13-678-11E, 13-678-11F | |
PO | Sigma-Aldrich | P3655 | |
polymer coverslip bottom imaging plates, ibidi | ibidi | 81156 | |
RA | Sigma-Aldrich | R2625 | |
SB431542 | R&D systems | 1614 | |
Trypan blue stain, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
Ultra-low attachment plates | Fisher Scientific | 07-200-601 | |
Y-27632 dihydrochloride | R&D systems | 1254 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved