A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפקת שושלות של מערכת העצבים האנטרית (ENS) מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC) מספקת מקור מדרגי של תאים לחקר התפתחות ומחלות של ENS, ולשימוש ברפואה רגנרטיבית. כאן, מוצג פרוטוקול מבחנה מפורט להפקת נוירונים אנטריים מתאי גזע גזעיים גזעיים (hPSCs) באמצעות תנאי תרבית המוגדרים כימית.

Abstract

מערכת העצבים האנטרית האנושית, ENS, היא רשת גדולה של סוגי תאי גלייה ותאי עצב עם מגוון נוירוטרנסמיטרים מדהים. מערכת ENS שולטת בתנועתיות המעי, בהפרשת אנזימים ובספיגת אבות מזון, ומקיימת אינטראקציה עם מערכת החיסון ועם מיקרוביום המעי. כתוצאה מכך, פגמים התפתחותיים ונרכשים של ENS אחראים למחלות אנושיות רבות ועשויים לתרום לסימפטומים של מחלת פרקינסון. מגבלות במערכות מודל של בעלי חיים וגישה לרקמות ראשוניות מציבות אתגרים ניסיוניים משמעותיים במחקרים של ENS אנושי. כאן, מוצג פרוטוקול מפורט לגזירה חוץ גופית יעילה של שושלות ENS מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים, hPSC, תוך שימוש בתנאי תרבית מוגדרים. הפרוטוקול שלנו מתחיל בהתמיינות מכוונת של hPSCs לתאי פסגה עצבית אנטרית תוך 15 יום ומניב תת-סוגים מגוונים של נוירונים אנטריים פונקציונליים תוך 30 יום. פלטפורמה זו מספקת משאב מדרגי למחקרים התפתחותיים, מידול מחלות, גילוי תרופות ויישומים רגנרטיביים.

Introduction

מערכת העצבים האנטרית (ENS) היא המרכיב הגדול ביותר של מערכת העצבים ההיקפית. ה-ENS מכיל יותר מ-400 מיליון תאי עצב הממוקמים במערכת העיכול ושולטים כמעט בכל תפקודיהמעי 1. הבנה מולקולרית של התפתחות ותפקוד ENS ופגמיו בנוירופתיות אנטריות דורשת גישה למקור אמין ואותנטי של נוירונים אנטריים. הגישה לרקמה הראשונית האנושית מוגבלת, ומודלים של בעלי חיים אינם מצליחים לשחזר פנוטיפים של מחלות מפתח בנוירופתיות אנטריות רבות. טכנולוגיית תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC) הוכחה כמועילה ביותר במתן מקור בלתי מוגבל של סוגי תאים רצויים, במיוחד אלה שקשה לבודד ממקורות ראשוניים 2,3,4,5,6,7.

Protocol

1. הכנת מדיה

הערה: הריכוזים המוזכרים לאורך הפרוטוקול הם ריכוזים סופיים של רכיבי המדיה. הכינו את כל המדיה בתנאים סטריליים במכסה מנוע של זרימה למינרית, ואחסנו בטמפרטורה של 4°C בחושך. יש להשתמש תוך שבועיים.

  1. אמצעי תחזוקה hPSC: יש לערבב תוסף בינוני לתחזוקת hPSC ללא מזין (20 מיקרוליטר/מ"ל) עם מדיום הבסיס שלו.
  2. בינוני A: הוסף חלבון מורפוגנטי עצם 4 (BMP4; 1 ננוגרם/מ"ל), SB431542 (10 מיקרומטר) ו-CHIR99021 (600 ננומטר) לתווך בסיס התמיינות (Differentiation Base Medium).
  3. בינוני B: הוסף SB431542 (10 μM) ו- CHIR99021 (1.5 μM) למדיום בסיס התמיינות (differentiation base medium).
  4. בינוני C: הוסף SB43154....

תוצאות

פרוטוקול זה מספק שיטה להפיק פסגה עצבית אנטרית ותאי עצב אנטריים מתאי גזע גזעיים גזעיים (hPSCs) באמצעות תנאי תרבית המוגדרים כימית (איור 1A-B). יצירת נוירונים באיכות גבוהה תלויה בשלב אינדוקציה יעיל של סמל עצבי אנטרי. ניתן להעריך זאת באופן חזותי על-ידי בדיקת המורפולוגיה של.......

Discussion

פרוטוקול ההתמיינות המתואר כאן מספק שיטה חזקה במבחנה להשגת תאי עצב אנטריים מתאי גזע גזעיים גזעיים (hPSCs) בתוך 30-40 יום (איור 1E) ותאי גליה אנטריים המבטאים חלבון חומצי גליה פיברילרי, GFAP ו-SOX10 בתרביות ישנות יותר (> יום 55)13,14,19,22........

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

העבודה נתמכה על ידי מענקים מתוכנית UCSF למחקר ביו-רפואי פורץ דרך וקרן סנדלר, מענק March of Dimes מס' 1-FY18-394 ו- 1DP2NS116769-01, פרס החדשנות החדשה של מנהל ה- NIH (DP2NS116769) ל- F.F. והמכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות (R01DK121169) ל- F.F., H.M. נתמך על ידי מלגת הפוסט-דוקטורט של קרן לארי ל. הילבלום, מלגת NIH T32-DK007418 ותוכנית UCSF למחקר ביו-רפואי פורץ דרך מלגת פוסט-דוקטורט עצמאית.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Ascorbic acidSigma-AldrichA5960
B27 supplement (serum free, minus vitamin A)Gibco12587-010
Basement membrane matrix, GeltrexGibcoA14133-2
BMP4R&D systems314-BP
Cell culture centrifugeEppendorf, model no. 5810R02262501
Cell detachment solution, AccutaseStemcell Technologies07920
CHIR99021Tocris4423
Conical tubesUSA scientific1475-0511, 1500-1211
Differentiation base medium, Essential 6Life TechnologiesA1516401
DMEM/F-12 no glutamineLife Technologies21331020
EDTACorningMT-46034CI
Feeder-free hPSC maintenance medium, Essential 8 Flex Medium KitLife TechnologiesA2858501
FGF2R&D systems233-FB/CF
FibronectinCorning356008
GDNFPeprotech450-10
HemocytometerHausser Scientific1475
Human pluripotent stem cells, H9 ESCWiCellRRID: CVCL_1240
Incubator with controlled humidity, temperature and CO2Thermo Fisher ScientificHerralcell 150i
Inverted microscopeThermo Fisher ScientificEVOS FL
Laminar flow hoodThermo Fisher Scientific1300 series class II, type A2
LamininCultrex3400-010
L-glutamine supplement, GlutagroCorning25-015-CI
MEM NEAAsCorning25-025-CI
Multiwell plates, FalconBD353934, 353075
N-2 SupplementCTSA1370701
Neurobasal MediumLife Technologies21103049
PBS (Ca and Mg free)Life Technologies10010023
Pipette fillerEppendorfZ768715-1EA
Pipette tipsUSA scientific1111-2830
PipettesFisherbrand13-678-11E, 13-678-11F
POSigma-AldrichP3655
polymer coverslip bottom imaging plates, ibidiibidi81156
RASigma-AldrichR2625
SB431542R&D systems1614
Trypan blue stain, 0.4%Thermo Fisher Scientific15250-061
Ultra-low attachment platesFisher Scientific07-200-601
Y-27632 dihydrochlorideR&D systems1254

References

  1. Gershon, M. D. The enteric nervous system: a second brain. Hosp Pract. 34 (7), 35-38 (1999).
  2. Haggarty, S. J., Silva, M. C., Cross, A., Brandon, N. J., Perlis, R. H. Advancing drug discovery for neuropsychiatric dis....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved