התמיינות של שושלות מערכת העצבים האנטרית מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

Summary

הפקת שושלות של מערכת העצבים האנטרית (ENS) מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC) מספקת מקור מדרגי של תאים לחקר התפתחות ומחלות של ENS, ולשימוש ברפואה רגנרטיבית. כאן, מוצג פרוטוקול מבחנה מפורט להפקת נוירונים אנטריים מתאי גזע גזעיים גזעיים (hPSCs) באמצעות תנאי תרבית המוגדרים כימית.

Abstract

מערכת העצבים האנטרית האנושית, ENS, היא רשת גדולה של סוגי תאי גלייה ותאי עצב עם מגוון נוירוטרנסמיטרים מדהים. מערכת ENS שולטת בתנועתיות המעי, בהפרשת אנזימים ובספיגת אבות מזון, ומקיימת אינטראקציה עם מערכת החיסון ועם מיקרוביום המעי. כתוצאה מכך, פגמים התפתחותיים ונרכשים של ENS אחראים למחלות אנושיות רבות ועשויים לתרום לסימפטומים של מחלת פרקינסון. מגבלות במערכות מודל של בעלי חיים וגישה לרקמות ראשוניות מציבות אתגרים ניסיוניים משמעותיים במחקרים של ENS אנושי. כאן, מוצג פרוטוקול מפורט לגזירה חוץ גופית יעילה של שושלות ENS מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים, hPSC, תוך שימוש בתנאי תרבית מוגדרים. הפרוטוקול שלנו מתחיל בהתמיינות מכוונת של hPSCs לתאי פסגה עצבית אנטרית תוך 15 יום ומניב תת-סוגים מגוונים של נוירונים אנטריים פונקציונליים תוך 30 יום. פלטפורמה זו מספקת משאב מדרגי למחקרים התפתחותיים, מידול מחלות, גילוי תרופות ויישומים רגנרטיביים.

Introduction

מערכת העצבים האנטרית (ENS) היא המרכיב הגדול ביותר של מערכת העצבים ההיקפית. ה-ENS מכיל יותר מ-400 מיליון תאי עצב הממוקמים במערכת העיכול ושולטים כמעט בכל תפקודי^{המעי 1}. הבנה מולקולרית של התפתחות ותפקוד ENS ופגמיו בנוירופתיות אנטריות דורשת גישה למקור אמין ואותנטי של נוירונים אנטריים. הגישה לרקמה הראשונית האנושית מוגבלת, ומודלים של בעלי חיים אינם מצליחים לשחזר פנוטיפים של מחלות מפתח בנוירופתיות אנטריות רבות. טכנולוגיית תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC) הוכחה כמועילה ביותר במתן מקור בלתי מוגבל של סוגי תאים רצויים, במיוחד אלה שקשה לבודד ממקורות ראשוניים 2,3,4,5,6,7.

Protocol

1. הכנת מדיה

הערה: הריכוזים המוזכרים לאורך הפרוטוקול הם ריכוזים סופיים של רכיבי המדיה. הכינו את כל המדיה בתנאים סטריליים במכסה מנוע של זרימה למינרית, ואחסנו בטמפרטורה של 4°C בחושך. יש להשתמש תוך שבועיים.

1. אמצעי תחזוקה hPSC: יש לערבב תוסף בינוני לתחזוקת hPSC ללא מזין (20 מיקרוליטר/מ"ל) עם מדיום הבסיס שלו.
2. בינוני A: הוסף חלבון מורפוגנטי עצם 4 (BMP4; 1 ננוגרם/מ"ל), SB431542 (10 מיקרומטר) ו-CHIR99021 (600 ננומטר) לתווך בסיס התמיינות (Differentiation Base Medium).
3. בינוני B: הוסף SB431542 (10 μM) ו- CHIR99021 (1.5 μM) למדיום בסיס התמיינות (differentiation base medium).
4. בינוני C: הוסף SB43154....

תוצאות

פרוטוקול זה מספק שיטה להפיק פסגה עצבית אנטרית ותאי עצב אנטריים מתאי גזע גזעיים גזעיים (hPSCs) באמצעות תנאי תרבית המוגדרים כימית (איור 1A-B). יצירת נוירונים באיכות גבוהה תלויה בשלב אינדוקציה יעיל של סמל עצבי אנטרי. ניתן להעריך זאת באופן חזותי על-ידי בדיקת המורפולוגיה של.......

Discussion

פרוטוקול ההתמיינות המתואר כאן מספק שיטה חזקה במבחנה להשגת תאי עצב אנטריים מתאי גזע גזעיים גזעיים (hPSCs) בתוך 30-40 יום (איור 1E) ותאי גליה אנטריים המבטאים חלבון חומצי גליה פיברילרי, GFAP ו-SOX10 בתרביות ישנות יותר (> יום 55)13,14,19,22........

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A5960
B27 supplement (serum free, minus vitamin A)	Gibco	12587-010
Basement membrane matrix, Geltrex	Gibco	A14133-2
BMP4	R&D systems	314-BP
Cell culture centrifuge	Eppendorf, model no. 5810R	02262501
Cell detachment solution, Accutase	Stemcell Technologies	07920
CHIR99021	Tocris	4423
Conical tubes	USA scientific	1475-0511, 1500-1211
Differentiation base medium, Essential 6	Life Technologies	A1516401
DMEM/F-12 no glutamine	Life Technologies	21331020
EDTA	Corning	MT-46034CI
Feeder-free hPSC maintenance medium, Essential 8 Flex Medium Kit	Life Technologies	A2858501
FGF2	R&D systems	233-FB/CF
Fibronectin	Corning	356008
GDNF	Peprotech	450-10
Hemocytometer	Hausser Scientific	1475
Human pluripotent stem cells, H9 ESC	WiCell	RRID: CVCL_1240
Incubator with controlled humidity, temperature and CO2	Thermo Fisher Scientific	Herralcell 150i
Inverted microscope	Thermo Fisher Scientific	EVOS FL
Laminar flow hood	Thermo Fisher Scientific	1300 series class II, type A2
Laminin	Cultrex	3400-010
L-glutamine supplement, Glutagro	Corning	25-015-CI
MEM NEAAs	Corning	25-025-CI
Multiwell plates, Falcon	BD	353934, 353075
N-2 Supplement	CTS	A1370701
Neurobasal Medium	Life Technologies	21103049
PBS (Ca and Mg free)	Life Technologies	10010023
Pipette filler	Eppendorf	Z768715-1EA
Pipette tips	USA scientific	1111-2830
Pipettes	Fisherbrand	13-678-11E, 13-678-11F
PO	Sigma-Aldrich	P3655
polymer coverslip bottom imaging plates, ibidi	ibidi	81156
RA	Sigma-Aldrich	R2625
SB431542	R&D systems	1614
Trypan blue stain, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250-061
Ultra-low attachment plates	Fisher Scientific	07-200-601
Y-27632 dihydrochloride	R&D systems	1254