Дифференцировка линий энтеральной нервной системы из плюрипотентных стволовых клеток человека

Резюме

Получение линий энтеральной нервной системы (ЭНС) из плюрипотентных стволовых клеток человека (ПСК) обеспечивает масштабируемый источник клеток для изучения развития и заболеваний ЭНС, а также для использования в регенеративной медицине. Здесь представлен подробный протокол in vitro для получения кишечных нейронов из hPSCs с использованием химически определенных условий культивирования.

Аннотация

Энтеральная нервная система человека, ЭНС, представляет собой обширную сеть глиальных и нейрональных клеток с замечательным разнообразием нейротрансмиттеров. ЭНС контролирует перистальтику кишечника, секрецию ферментов и усвоение питательных веществ, а также взаимодействует с иммунной системой и микробиомом кишечника. Следовательно, дефекты развития и приобретенные дефекты ЭНС ответственны за многие заболевания человека и могут способствовать появлению симптомов болезни Паркинсона. Ограничения в животных модельных системах и доступ к первичным тканям создают значительные экспериментальные проблемы в исследованиях ЭНС человека. Здесь представлен подробный протокол эффективного in vitro получения линий ENS из плюрипотентных стволовых клеток человека, hPSC, с использованием определенных условий культивирования. Наш протокол начинается с направленной дифференцировки hPSCs в клетки кишечного нервного гребня в течение 15 дней и позволяет получить различные подтипы функциональных кишечных нейронов в течение 30 дней. Эта платформа предоставляет масштабируемый ресурс для исследований в области развития, моделирования заболеваний, разработки лекарств и регенеративных приложений.

Введение

Энтеральная нервная система (ЭНС) является крупнейшим компонентом периферической нервной системы. ЭНС содержит более 400 миллионов нейронов, которые расположены в желудочно-кишечном тракте и контролируют почти все функции кишечника. Молекулярное понимание развития и функции ЭНС и ее дефектов при энтеральных невропатиях требует доступа к надежному и достоверному источнику энтеральных нейронов. Доступ к первичным тканям человека ограничен, и животные модели не могут воспроизвести ключевые фенотипы заболеваний при многих кишечных невропатиях. Технология плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSC) оказалась чрезвычайно полезной в обеспечении неограниченного источника желаемых типов клеток, особенно тех, которые трудно выделить из первичных источников 2,3,4,5,6,7. Здесь мы подробно описываем поэтапный и надежный метод in vitro для получения культур ЭНС из ЧПСК. Эти масштабируемые культуры, полученные из hPSC, открывают возможности для исследований развития, моделирования заболеваний и высокопроизводительного скрининга лекарств и могут обеспечить трансплантируемые клетки для регенеративной медицины.

Линии кишечных нейронов происходят от клеток нервного гребня (НК), следующих по пути развития ЭНС во время эмбриогенеза. У эмбрионов NC-клетки появляются по краям складчатой нервной пластинки. Они размножаются, мигрируют и дают начало множеству различных типов клеток, включая сенсорные нейроны, шванновские клетки, меланоциты, черепно-лицевой скелет и энтеральные нейроны, а также глии ^8,9,10. Решение о судьбе клетки зависит от отдельной области вдоль передне-задней оси, из которой выходят НК-клетки, т.е. краниальной НК, НК блуждающего нерва, НК туловища и НК крестца. ЭНС развивается из вагусных и сакральных НК-клеток, причем первые доминируют в популяции кишечных нейронов из-за обширной миграции по длине кишечника и колонизации кишечника¹¹.

Получение НК-клеток из ПСК обычно включает комбинацию двойного ингибирования SMAD и активации пути WNT^12,13. До недавнего времени все протоколы индукции НЗ включали добавление сыворотки и других добавок продуктов животного происхождения в условия культивирования. Химически неопределенные среды не только снижают воспроизводимость индукции ЧПУ, но и затрудняют механистические исследования развития. Чтобы преодолеть эти проблемы, Barber et^{al. 14} разработали протокол индукции NC с использованием химически определенных условий культивирования и, следовательно, имел преимущество по сравнению с альтернативными методами, которые полагаются на факторы замещения сыворотки (например, KSR)^13,14. Это было получено путем замещения базальных сред и оптимизации протокола, первоначально представленного Fattahi et al. для получения кишечных НК из hPSCs. Эта усовершенствованная система является основой представленного здесь протокола дифференцировки hPSC. Он начинается с индукции клеток кишечного нервного гребня (ENC) в течение 15-дневного периода путем точной модуляции сигналов BMP, FGF, WNT и TGFβ в дополнение к ретиноевой кислоте (RA). Затем мы получаем линии ЭНС путем обработки клеток нейротрофическим фактором глиальных клеток (GDNF). Все композиции сред определяются химически и дают устойчивые культуры кишечных нейронов в течение 30-40 дней.

В дополнение к описанной здесь монослойной системе культивирования клеток были разработаны альтернативные подходы к индукции НК, в которых используются свободно плавающие эмбриоидные тельца^15,16. Было показано, что мигрирующие клетки в этих культурах экспрессируют маркеры NC с субпопуляцией, представляющей НК блуждающего нерва. Кокультуры с первичной тканью кишечника были использованы для обогащения кишечных предшественников НК в этих культурах. Медиа-композиции в этих исследованиях содержат комбинацию различных факторов, таких как фактор роста нервов, NT3 и нейротрофический фактор мозга. На данном этапе не совсем ясно, как эти факторы могут повлиять на идентичность предшественников энтеральных нейронов. Для эффективного сравнения индукции энтерального НК в монослое и культурах, основанных на эмбриоидном теле, требуется больше данных. Учитывая различия в расположении культур в этих стратегиях, использование каждого метода должно быть рассмотрено и оптимизировано в соответствии с конкретным приложением.

Представленный здесь протокол является воспроизводимым и был успешно протестирован нами и другими специалистами с использованием^{различных линий} hPSC (индуцированных и эмбриональных) ^8,14,16.

протокол

1. Подготовка СМИ

ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрации, упомянутые в протоколе, являются конечными концентрациями компонентов среды. Подготовьте все среды в стерильных условиях в ламинарном вытяжном шкафу и храните при температуре 4 °C в темноте. Используйте в течение 2 недель.

1. Среда для поддержания hPSC: Смешайте добавку для поддерживающей среды hPSC без кормушки (20 мкл/мл) с ее основной средой.
2. Среда А: Добавьте костный морфогенетический белок 4 (BMP4; 1 нг/мл), SB431542 (10 мкМ) и CHIR99021 (600 нМ) в среду основания для дифференцировки.
3. Среда В: Добавьте SB431542 (10 мкМ) и CHIR99021 (1,5 мкМ) в среду основания для дифференцировки.
4. Среда C: Добавьте SB431542 (10 мкМ), CHIR99021 (1,5 мкМ) и RA (1 мкМ) в среду основания для дифференцировки.
5. Среда Neural crest complete (NCC): добавьте FGF2 (10 нг/мл), CHIR99021 (3 μM), добавку N2 (10 μл/мл), добавку B27 (20 μл/мл), добавку L-глутамина (10 μл/мл) и MEM NEAA (10 μл/мл) в нейробазальную среду.
6. Среда ENC: добавьте GDNF (10 нг/мл), аскорбиновую кислоту (100 мкМ), добавку N2 (10 мкл/мл), добавку B27 (20 мкл/мл), добавку L-глутамина (10 мкл/мл) и MEM NEAA (10 мкл/мл) в нейробазальную среду.
7. Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) 1х: Развести 500 мМ ЭДТА (1000х) до конечной концентрации 500 мкМ в PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте PBS без Ca²⁺ и Mg²⁺ на протяжении всего этого протокола, если не указано иное.

2. Покрытие культуральных пластин

1. Планшеты с покрытием базальной мембраны: Быстро разморозьте и разведите 500 мкл замороженной аликвоты матрицы базальной мембраны в 50 мл охлажденного DMEM:F12 путем энергичного пипетирования с помощью серологической пипетки объемом 50 мл. Покройте лунки разбавленным матричным раствором базальной мембраны (100 мкл на^см2 площади лунки) и инкубируйте их в течение ночи при температуре 37 °С. Перед применением отсадите защитную среду. Чтобы предотвратить желатинизацию матрицы базальной мембраны, выполните этот шаг как можно быстрее и используйте холодный DMEM:F12 для растворения замороженной аликвоты.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Температура матрицы базальной мембраны должна поддерживаться на низком уровне во время размораживания (на льду) и аликвотирования (трубки на льду) для предотвращения коагуляции.
2. Пластины, покрытые PO/FN/ламинином: Приготовьте раствор полиорнитина (PO) в PBS с концентрацией 15 мкг/мл, разбавив 1000x запас. Промазать лунки 100 мкл раствора PO/PBS на^см2 площади лунки и инкубировать планшеты в течение ночи при температуре 37 °C. На следующий день аспирируйте ПО/ПБС и покройте лунки в концентрации 100 мкл на^см2 площади лунки свежеприготовленным раствором FN/ламинина/PBS, содержащим 2 мкг/мл фибронектина (FN) и 2 мкг/мл ламинина. Планшеты можно использовать после инкубации минимум в течение 2 часов при 37 °C. Аспират FN/ламинин/PBS перед применением.

3. Поддержание культуры hPSC

ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы инкубации клеток происходят при 5%_CO2 и 37 °C в увлажненном инкубаторе.

1. Отбирайте среду hPSC из культуры hPSC и добавляйте свежую среду (200 μL на^см2 площади лунки) через день до тех пор, пока колонии не станут ~80% сливаться.
2. Для прохождения необходимо аспирировать среду hPSC и промыть ячейки 100 мкл PBS на^см2 площади поверхности лунки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно использовать Ca²⁺ и Mg²⁺ free PBS для промывания клеток.
3. Добавьте 500 мкМ ЭДТА (100 мкл на^см2 площади лунки). Установите на место крышку тарелки. Наблюдайте в перевернутый микроскоп и контролируйте клетки на предмет отслойки краев колонии (2-4 мин).
4. Используйте серологическую пипетку объемом 5 или 10 мл, чтобы передать один и тот же объем среды hPSC в каждую лунку и механически собрать клетки, несколько раз пипетируя вверх и вниз.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальное время инкубации ЭДТА зависит от линии iPSC. Избегайте энергичного пипетирования для отделения колоний, так как это может привести к чрезмерной диссоциации колонии и гибели клеток. При прохождении для начала дифференцировочной пластины инкубируйте клетки с ЭДТА в течение 1-2 мин дольше.
5. Переложите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 мл. Открутите клетки (2 мин, 290 х г, 20-25 °С) и осторожно выбросьте надосадочную жидкость.
6. Ресуспендирование клеток в соответствующем объеме среды hPSC и перенос в лунки новой пластины с покрытием матрицы базальной мембраны.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для регулярного поддержания hPSC используйте соотношение пассажа 1:18 - 1:24 (1:18 означает перенос одной трети клеток, диссоциированных из одной лунки 6-луночного планшета, в полностью новую пластину). Чтобы начать дифференцировочную пластину, соблюдайте коэффициент пропускания 5:6.
7. Инкубировать при 5%_CO2 и 37 °C.

4. Индукция нервного гребня

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг схематически представлен на рисунке 1А. Дифференцировку NC начинают, когда клетки примерно на 80% сливаются. Это будет достигнуто в течение 1-2 дней при прохождении клеток в соотношении 5:6 (см. выше). Начните дифференцировку НЦ в день 0 с плюрипотентных и полностью недифференцированных клеток hPSC. Для высокой эффективности границы колонии должны иметь минимальное количество дифференцирующих клеток. Проход и планшет hPSC для дифференцировки, когда колонии большие, или центр колонии начинает утолщаться/темнеть при наблюдении с помощью инвертированного микроскопа. Обращать внимание на слияние и морфологию, как правило, более надежно, чем на количество пластинчатых клеток, поскольку оно может варьироваться в зависимости от клеточной линии и может варьироваться от 50 000 до 200 000 на см² .

1. В день 0 замените поддерживающую среду hPSC на среду A, содержащую 1 нг/мл BMP4, 10 мкМ SB431542, 600 нМ CHIR99021 (200 мкл среды на^см2 площади скважины).
2. На 2-й день клетки должны быть на 100% сливающимися. Отработавшую среду А аккуратно отсасывать и подавать ячейки со средой В, содержащей 10 мкМ SB431542, 1,5 мкМ CHIR99021 (200 мкл среды на^см2 площади лунки).
   Примечание: По мере роста культур во время индукции NC клетки могут отделяться от нижележащего монослоя. Избегайте избыточной потери клеток, аккуратно удаляя старую среду и добавляя свежую среду на бортик лунки.
3. На 4-й день снова подайте в ячейки Medium B (200 мкл среды на^см2 площади лунки).
4. На 6-й день замените среду В на среду С, содержащую 10 мкМ SB431542, 1,5 мкМ CHIR99021 и 1 мкМ ретиноевой кислоты (400 мкл среды на^см2 площади лунки).
5. На 8 и 10 день кормите как на 6 день.

5. Формирование сфероида ENC

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг схематически представлен на рисунке 1B.

1. На 12-й день осторожно отсасывайте среду С и промойте ячейки 100 мкл PBS на^см2 площади лунки. Добавьте такой же объем раствора для отделения клеток и инкубируйте в течение 30 минут при 5%_CO2 и 37 °C.
2. Раствор для отделения клеток разбавляют путем добавления того же объема среды NCC, содержащей 10 нг/мл FGF2, 3 мкМ CHIR99021, 10 мкл/мл добавки N2, 20 мкл/мл добавки B27, 10 мкл/мл добавки L-глутамина и 10 мкл/мл MEM NEAA. С помощью серологической пипетки соберите одноклеточную суспензию и добавьте ее в коническую пробирку объемом 15 мл.
3. Открутите клетки (2 мин, 290 х г, 20-25 °С) и осторожно выбросьте надосадочную жидкость.
4. С помощью серологической пипетки объемом 10 мл добавьте 12 мл (для полного 6-луночного планшета) среды NCC и полностью ресуспендируйте клетки путем механического пипетирования вверх и вниз 1-2 раза. Перенесите суспензию ячеек на пластину со сверхнизким уровнем крепления.
   Примечание: Приблизительно 10^см2 монослойных ячеек ENC ресуспендируют в 2 мл среды NCC и переносят в одну лунку планшета со сверхнизким уровнем прикрепления. Это эквивалентно тому, как если бы полная 6-луночная индукционная пластина с ЧПУ была перенесена в полную 6-луночную пластину со сверхнизким креплением.
5. На 14-й день осторожно поворачивайте пластины, пока в центре каждой лунки не соберутся маленькие сфероиды. С помощью микропипетки P1000 медленными круговыми движениями аспирируйте отработанную среду NCC по окружности каждой лунки. Старайтесь избегать удаления свободно плавающих сфероидов.
6. Подавайте в клетки исходный объем среды НКЦ.

6. Индукция EN

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг схематически представлен на рисунке 1B.

1. На 15-й день примените ту же технику, что и на 14-й день, чтобы аккуратно удалить среду и промыть сфероиды PBS. Удалите как можно больше PBS, избегая сфероидов.
2. Добавить раствор для отрыва клеток (100 мкл на^см2 площади лунки) и диссоциировать сфероиды на отдельные клетки путем инкубации в течение 30 мин при 5%_СО2 и 37 °С.
3. С помощью серологической пипетки объемом 10 мл добавьте в каждую лунку равное количество среды ENC (содержащей 10 нг/мл GDNF, 100 мкМ аскорбиновой кислоты, 10 мкл/мл добавки N2, 20 мкл/мл добавки B27, 10 мкл/мл добавки L-глутамина и 10 мкл/мл MEM NEAA в нейробазальной среде) и разбейте оставшиеся сфероиды путем 2-3 раундов механического пипетирования. Переложите клетки в коническую пробирку объемом 50 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте чрезмерного стресса и гибели клеток, которые могут произойти из-за принудительного пипетирования или использования пипеток с меньшим отверстием наконечника.
4. Открутите клетки (2 мин, 290 х г, 20-25 °С) и осторожно выбросьте надосадочную жидкость. С помощью серологической пипетки объемом 10 мл добавьте ~ 5-10 мл среды ENC и полностью ресуспендируйте клетки путем пипетирования вверх и вниз 1-2 раза.
5. Подсчитайте концентрацию жизнеспособных клеток с помощью трипанового синего и метода подсчета клеток, такого как гемоцитометр.
   ВНИМАНИЕ: Трипановый синий является подозреваемым канцерогеном. Обращайтесь с осторожностью, утилизируйте надлежащим образом.
6. Добавьте достаточное количество среды ENC, чтобы покрыть примерно 300 000-400 000 жизнеспособных клеток на^см2 площади поверхности с плотностью около ~ 1 000 000 клеток на мл. Аспират FN/ламинин/PBS раствор из лунок планшета.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите формат планшета в соответствии с анализами, которые запланированы для культур EN, поскольку этот этап знаменует собой заключительный этап повторного покрытия протокола. Предшественники кишечных нейронов можно замораживать на 15-й день. После диссоциации сфер раствором для отслойки клеток ресуспендируйте предшественники в концентрации примерно 5 x 10⁶ клеток/мл в замораживающей среде, такой как 10% ДМСО или Stem-cellbanker. При необходимости разморозьте в теплой среде ENC с 5 мкМ ингибитором Y-27632 ROCK. Пластинчатые ячейки в нужном формате пластины. Замените носитель свежим ENC через пару часов.
7. Аккуратно добавьте ячейки в лунки, покрытые PO/FN/ламинином. Избегайте попадания пузырьков под клеточную суспензию, предотвращая прикрепление клеток к покрытию PO/FN/ламинина, особенно при использовании планшетов с меньшим размером лунки, таких как 384-луночные планшеты. Это может привести к гибели клеток.
8. Кормите клетки через день средой ENC (200 мкл на^см2 площади лунки) до 30-40 дня, после чего уменьшите частоту подачи (до одного-двух раз в неделю), но увеличьте объем подачи в два раза (до 400 мкл среды на^см2 площади лунки).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это важно, так как чрезмерное удаление и добавление среды может способствовать отделению культуры нейронов от поверхности лунок. Для проспективной профилактики отслойки, особенно при длительном посеве, добавляйте ЭНК с FN (2 мкг/мл) и ламинином (2 мкг/мл) один раз в неделю.

Результаты

Этот протокол обеспечивает метод получения энтерального нервного гребня и энтеральных нейронов из hPSCs с использованием химически определенных условий культивирования (рис. 1A-B). Генерация высококачественных нейронов зависит от эффективного этапа индукции эн?...

Обсуждение

Описанный здесь протокол дифференцировки обеспечивает надежный метод in vitro для получения энтеральных нейронов из hPSCs в течение 30-40 дней (рис. 1E) и кишечной глии, экспрессирующей глиальный фибриллярный кислый белок, GFAP и SOX10 в более старых культурах (> день 55)13,14,19,22.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A5960
B27 supplement (serum free, minus vitamin A)	Gibco	12587-010
Basement membrane matrix, Geltrex	Gibco	A14133-2
BMP4	R&D systems	314-BP
Cell culture centrifuge	Eppendorf, model no. 5810R	02262501
Cell detachment solution, Accutase	Stemcell Technologies	07920
CHIR99021	Tocris	4423
Conical tubes	USA scientific	1475-0511, 1500-1211
Differentiation base medium, Essential 6	Life Technologies	A1516401
DMEM/F-12 no glutamine	Life Technologies	21331020
EDTA	Corning	MT-46034CI
Feeder-free hPSC maintenance medium, Essential 8 Flex Medium Kit	Life Technologies	A2858501
FGF2	R&D systems	233-FB/CF
Fibronectin	Corning	356008
GDNF	Peprotech	450-10
Hemocytometer	Hausser Scientific	1475
Human pluripotent stem cells, H9 ESC	WiCell	RRID: CVCL_1240
Incubator with controlled humidity, temperature and CO2	Thermo Fisher Scientific	Herralcell 150i
Inverted microscope	Thermo Fisher Scientific	EVOS FL
Laminar flow hood	Thermo Fisher Scientific	1300 series class II, type A2
Laminin	Cultrex	3400-010
L-glutamine supplement, Glutagro	Corning	25-015-CI
MEM NEAAs	Corning	25-025-CI
Multiwell plates, Falcon	BD	353934, 353075
N-2 Supplement	CTS	A1370701
Neurobasal Medium	Life Technologies	21103049
PBS (Ca and Mg free)	Life Technologies	10010023
Pipette filler	Eppendorf	Z768715-1EA
Pipette tips	USA scientific	1111-2830
Pipettes	Fisherbrand	13-678-11E, 13-678-11F
PO	Sigma-Aldrich	P3655
polymer coverslip bottom imaging plates, ibidi	ibidi	81156
RA	Sigma-Aldrich	R2625
SB431542	R&D systems	1614
Trypan blue stain, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250-061
Ultra-low attachment plates	Fisher Scientific	07-200-601
Y-27632 dihydrochloride	R&D systems	1254