Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Получение линий энтеральной нервной системы (ЭНС) из плюрипотентных стволовых клеток человека (ПСК) обеспечивает масштабируемый источник клеток для изучения развития и заболеваний ЭНС, а также для использования в регенеративной медицине. Здесь представлен подробный протокол in vitro для получения кишечных нейронов из hPSCs с использованием химически определенных условий культивирования.

Аннотация

Энтеральная нервная система человека, ЭНС, представляет собой обширную сеть глиальных и нейрональных клеток с замечательным разнообразием нейротрансмиттеров. ЭНС контролирует перистальтику кишечника, секрецию ферментов и усвоение питательных веществ, а также взаимодействует с иммунной системой и микробиомом кишечника. Следовательно, дефекты развития и приобретенные дефекты ЭНС ответственны за многие заболевания человека и могут способствовать появлению симптомов болезни Паркинсона. Ограничения в животных модельных системах и доступ к первичным тканям создают значительные экспериментальные проблемы в исследованиях ЭНС человека. Здесь представлен подробный протокол эффективного in vitro получения линий ENS из плюрипотентных стволовых клеток человека, hPSC, с использованием определенных условий культивирования. Наш протокол начинается с направленной дифференцировки hPSCs в клетки кишечного нервного гребня в течение 15 дней и позволяет получить различные подтипы функциональных кишечных нейронов в течение 30 дней. Эта платформа предоставляет масштабируемый ресурс для исследований в области развития, моделирования заболеваний, разработки лекарств и регенеративных приложений.

Введение

Энтеральная нервная система (ЭНС) является крупнейшим компонентом периферической нервной системы. ЭНС содержит более 400 миллионов нейронов, которые расположены в желудочно-кишечном тракте и контролируют почти все функции кишечника. Молекулярное понимание развития и функции ЭНС и ее дефектов при энтеральных невропатиях требует доступа к надежному и достоверному источнику энтеральных нейронов. Доступ к первичным тканям человека ограничен, и животные модели не могут воспроизвести ключевые фенотипы заболеваний при многих кишечных невропатиях. Технология плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSC) оказалась чрезвычайно полезной в обеспечении не....

протокол

1. Подготовка СМИ

ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрации, упомянутые в протоколе, являются конечными концентрациями компонентов среды. Подготовьте все среды в стерильных условиях в ламинарном вытяжном шкафу и храните при температуре 4 °C в темноте. Используйте в течение 2 недель.

  1. Среда для поддержания hPSC: Смешайте добавку для поддерживающей среды hPSC без кормушки (20 мкл/мл) с ее основной средой.
  2. Среда А: Добавьте костный морфогенетический белок 4 (BMP4; 1 нг/мл), SB431542 (10 мкМ) и CHIR99021 (600 нМ) в среду основания для дифференцировки.
  3. Среда В: Добавьте SB431542 (10 мкМ) и CHIR99021 (1,5 мкМ) в среду....

Результаты

Этот протокол обеспечивает метод получения энтерального нервного гребня и энтеральных нейронов из hPSCs с использованием химически определенных условий культивирования (рис. 1A-B). Генерация высококачественных нейронов зависит от эффективного этапа индукции эн?.......

Обсуждение

Описанный здесь протокол дифференцировки обеспечивает надежный метод in vitro для получения энтеральных нейронов из hPSCs в течение 30-40 дней (рис. 1E) и кишечной глии, экспрессирующей глиальный фибриллярный кислый белок, GFAP и SOX10 в более старых культурах (> день 55)13,14,19,22.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Работа была поддержана грантами от Программы прорывных биомедицинских исследований UCSF и Фонда Сандлера, грантом March of Dimes No 1-FY18-394 и 1DP2NS116769-01, премией директора NIH New Innovator Award (DP2NS116769) для F.F. и Национальным институтом диабета, болезней пищеварительной системы и почек (R01DK121169) для F.F., H.M. поддерживается стипендией Фонда Ларри Л. Хиллблома для постдокторантов. Стипендия NIH T32-DK007418 и независимая постдокторская стипендия UCSF Program for Breakthrough Biomedical Research.

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Ascorbic acidSigma-AldrichA5960
B27 supplement (serum free, minus vitamin A)Gibco12587-010
Basement membrane matrix, GeltrexGibcoA14133-2
BMP4R&D systems314-BP
Cell culture centrifugeEppendorf, model no. 5810R02262501
Cell detachment solution, AccutaseStemcell Technologies07920
CHIR99021Tocris4423
Conical tubesUSA scientific1475-0511, 1500-1211
Differentiation base medium, Essential 6Life TechnologiesA1516401
DMEM/F-12 no glutamineLife Technologies21331020
EDTACorningMT-46034CI
Feeder-free hPSC maintenance medium, Essential 8 Flex Medium KitLife TechnologiesA2858501
FGF2R&D systems233-FB/CF
FibronectinCorning356008
GDNFPeprotech450-10
HemocytometerHausser Scientific1475
Human pluripotent stem cells, H9 ESCWiCellRRID: CVCL_1240
Incubator with controlled humidity, temperature and CO2Thermo Fisher ScientificHerralcell 150i
Inverted microscopeThermo Fisher ScientificEVOS FL
Laminar flow hoodThermo Fisher Scientific1300 series class II, type A2
LamininCultrex3400-010
L-glutamine supplement, GlutagroCorning25-015-CI
MEM NEAAsCorning25-025-CI
Multiwell plates, FalconBD353934, 353075
N-2 SupplementCTSA1370701
Neurobasal MediumLife Technologies21103049
PBS (Ca and Mg free)Life Technologies10010023
Pipette fillerEppendorfZ768715-1EA
Pipette tipsUSA scientific1111-2830
PipettesFisherbrand13-678-11E, 13-678-11F
POSigma-AldrichP3655
polymer coverslip bottom imaging plates, ibidiibidi81156
RASigma-AldrichR2625
SB431542R&D systems1614
Trypan blue stain, 0.4%Thermo Fisher Scientific15250-061
Ultra-low attachment platesFisher Scientific07-200-601
Y-27632 dihydrochlorideR&D systems1254

Ссылки

  1. Gershon, M. D. The enteric nervous system: a second brain. Hosp Pract. 34 (7), 35-38 (1999).
  2. Haggarty, S. J., Silva, M. C., Cross, A., Brandon, N. J., Perlis, R. H. Advancing drug discovery for neuropsychiatric dis....

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

in vitro

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены