Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Получение линий энтеральной нервной системы (ЭНС) из плюрипотентных стволовых клеток человека (ПСК) обеспечивает масштабируемый источник клеток для изучения развития и заболеваний ЭНС, а также для использования в регенеративной медицине. Здесь представлен подробный протокол in vitro для получения кишечных нейронов из hPSCs с использованием химически определенных условий культивирования.
Энтеральная нервная система человека, ЭНС, представляет собой обширную сеть глиальных и нейрональных клеток с замечательным разнообразием нейротрансмиттеров. ЭНС контролирует перистальтику кишечника, секрецию ферментов и усвоение питательных веществ, а также взаимодействует с иммунной системой и микробиомом кишечника. Следовательно, дефекты развития и приобретенные дефекты ЭНС ответственны за многие заболевания человека и могут способствовать появлению симптомов болезни Паркинсона. Ограничения в животных модельных системах и доступ к первичным тканям создают значительные экспериментальные проблемы в исследованиях ЭНС человека. Здесь представлен подробный протокол эффективного in vitro получения линий ENS из плюрипотентных стволовых клеток человека, hPSC, с использованием определенных условий культивирования. Наш протокол начинается с направленной дифференцировки hPSCs в клетки кишечного нервного гребня в течение 15 дней и позволяет получить различные подтипы функциональных кишечных нейронов в течение 30 дней. Эта платформа предоставляет масштабируемый ресурс для исследований в области развития, моделирования заболеваний, разработки лекарств и регенеративных приложений.
Энтеральная нервная система (ЭНС) является крупнейшим компонентом периферической нервной системы. ЭНС содержит более 400 миллионов нейронов, которые расположены в желудочно-кишечном тракте и контролируют почти все функции кишечника. Молекулярное понимание развития и функции ЭНС и ее дефектов при энтеральных невропатиях требует доступа к надежному и достоверному источнику энтеральных нейронов. Доступ к первичным тканям человека ограничен, и животные модели не могут воспроизвести ключевые фенотипы заболеваний при многих кишечных невропатиях. Технология плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSC) оказалась чрезвычайно полезной в обеспечении не....
1. Подготовка СМИ
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрации, упомянутые в протоколе, являются конечными концентрациями компонентов среды. Подготовьте все среды в стерильных условиях в ламинарном вытяжном шкафу и храните при температуре 4 °C в темноте. Используйте в течение 2 недель.
Этот протокол обеспечивает метод получения энтерального нервного гребня и энтеральных нейронов из hPSCs с использованием химически определенных условий культивирования (рис. 1A-B). Генерация высококачественных нейронов зависит от эффективного этапа индукции эн?.......
Описанный здесь протокол дифференцировки обеспечивает надежный метод in vitro для получения энтеральных нейронов из hPSCs в течение 30-40 дней (рис. 1E) и кишечной глии, экспрессирующей глиальный фибриллярный кислый белок, GFAP и SOX10 в более старых культурах (> день 55)13,14,19,22.
Авторам нечего раскрывать.
Работа была поддержана грантами от Программы прорывных биомедицинских исследований UCSF и Фонда Сандлера, грантом March of Dimes No 1-FY18-394 и 1DP2NS116769-01, премией директора NIH New Innovator Award (DP2NS116769) для F.F. и Национальным институтом диабета, болезней пищеварительной системы и почек (R01DK121169) для F.F., H.M. поддерживается стипендией Фонда Ларри Л. Хиллблома для постдокторантов. Стипендия NIH T32-DK007418 и независимая постдокторская стипендия UCSF Program for Breakthrough Biomedical Research.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
B27 supplement (serum free, minus vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
Basement membrane matrix, Geltrex | Gibco | A14133-2 | |
BMP4 | R&D systems | 314-BP | |
Cell culture centrifuge | Eppendorf, model no. 5810R | 02262501 | |
Cell detachment solution, Accutase | Stemcell Technologies | 07920 | |
CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
Conical tubes | USA scientific | 1475-0511, 1500-1211 | |
Differentiation base medium, Essential 6 | Life Technologies | A1516401 | |
DMEM/F-12 no glutamine | Life Technologies | 21331020 | |
EDTA | Corning | MT-46034CI | |
Feeder-free hPSC maintenance medium, Essential 8 Flex Medium Kit | Life Technologies | A2858501 | |
FGF2 | R&D systems | 233-FB/CF | |
Fibronectin | Corning | 356008 | |
GDNF | Peprotech | 450-10 | |
Hemocytometer | Hausser Scientific | 1475 | |
Human pluripotent stem cells, H9 ESC | WiCell | RRID: CVCL_1240 | |
Incubator with controlled humidity, temperature and CO2 | Thermo Fisher Scientific | Herralcell 150i | |
Inverted microscope | Thermo Fisher Scientific | EVOS FL | |
Laminar flow hood | Thermo Fisher Scientific | 1300 series class II, type A2 | |
Laminin | Cultrex | 3400-010 | |
L-glutamine supplement, Glutagro | Corning | 25-015-CI | |
MEM NEAAs | Corning | 25-025-CI | |
Multiwell plates, Falcon | BD | 353934, 353075 | |
N-2 Supplement | CTS | A1370701 | |
Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103049 | |
PBS (Ca and Mg free) | Life Technologies | 10010023 | |
Pipette filler | Eppendorf | Z768715-1EA | |
Pipette tips | USA scientific | 1111-2830 | |
Pipettes | Fisherbrand | 13-678-11E, 13-678-11F | |
PO | Sigma-Aldrich | P3655 | |
polymer coverslip bottom imaging plates, ibidi | ibidi | 81156 | |
RA | Sigma-Aldrich | R2625 | |
SB431542 | R&D systems | 1614 | |
Trypan blue stain, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
Ultra-low attachment plates | Fisher Scientific | 07-200-601 | |
Y-27632 dihydrochloride | R&D systems | 1254 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеСмотреть дополнительные статьи
This article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены