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요약

인간 만능 줄기 세포(hPSC)에서 장 신경계(ENS) 계통을 추출하면 ENS 발병 및 질병을 연구하고 재생 의학에 사용할 수 있는 확장 가능한 세포 소스를 얻을 수 있습니다. 여기에서는 화학적으로 정의된 배양 조건을 사용하여 hPSC에서 장 뉴런을 유도하기 위한 자세한 in vitro 프로토콜이 제시됩니다.

초록

인간의 장 신경계(ENS)는 신경전달물질의 다양성이 현저한 신경교세포와 신경세포의 대규모 네트워크입니다. ENS는 장 운동성, 효소 분비, 영양소 흡수를 조절하고 면역 체계 및 장내 마이크로바이옴과 상호 작용합니다. 결과적으로, ENS의 발달 및 후천적 결함은 많은 인간 질병의 원인이 되며 파킨슨병의 증상에 기여할 수 있습니다. 동물 모델 시스템의 한계와 일차 조직에 대한 접근은 인간 ENS 연구에서 중요한 실험적 과제를 제기합니다. 여기에서는 정의된 배양 조건을 사용하여 인간 만능 줄기 세포(hPSC)에서 ENS 계통을 효과적으로 체 외 에서 유도하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 당사의 프로토콜은 15일 이내에 hPSC를 장 신경능선 세포로 직접 분화하는 것으로 시작하여 30일 이내에 다양한 하위 유형의 기능성 장 신경 세포를 생성합니다. 이 플랫폼은 개발 연구, 질병 모델링, 약물 발견 및 재생 애플리케이션을 위한 확장 가능한 리소스를 제공합니다.

서문

장 신경계(ENS)는 말초 신경계에서 가장 큰 구성 요소입니다. ENS는 위장관 내에 위치한 4억 개 이상의 뉴런을 포함하고 있으며 장의 거의 모든 기능을 제어합니다1. 장 신경병증의 ENS 발달 및 기능, 결함에 대한 분자적 이해를 위해서는 신뢰할 수 있고 확실한 장 신경 세포 공급원에 접근해야 합니다. 인간의 일차 조직에 대한 접근은 제한적이며, 동물 모델은 많은 장 신경병증에서 주요 질병 표현형을 요약하지 못합니다. 인간 만능 줄기 세포(hPSC) 기술은 원하는 세포 유형, 특히 1차 공급원에서 분리하기 어려운 세포 유형을 무제한으로 제공하는 데 매우 유익한 것으로 입증되었습니다 2,3,4,5,6,7. 여기에서는 hPSC에서 ENS 배양을 얻기 위한 단계적이고 강력한 in vitro 방법에 대한 세부 정보를 제공합니다. 이러한 확장 가능한 hPSC 유래 배양은 발달 연구, 질병 모델링 및 고처리량 약물 스크리닝을 위한 길을 열어주며 재생 의학을 위한 이식 가능한 세포를 제공할 수 있습니다.

장 뉴런 계통은 배아 발생 중 ENS 발달 경로를 따르는 신경 능선(NC) 세포에서 파생됩니다. 배아에서 NC 세포는 접히는 신경판의 가장자리를 따라 나타납니다. 그들은 증식, 이동 및 감각 뉴런, 슈반 세포, 멜라닌 세포, 두개안면 골격 및 장 뉴런 및 아교 세포8,9,10을 포함한 다양한 세포 유형을 생성합니다. 세포의 운명 결정은 NC 세포가 나오는 전방-후방 축을 따라 뚜렷한 영역, 즉 두개골 NC, 미주 NC, 몸통 NC 및 천골 NC에 따라 달라집니다. ENS는 미주신경 및 천골 NC 세포에서 발생하며, 전자는 장의 길이를 따라 광범위하게 이동하고 장을 식민지화하기 때문에 장 뉴런의 집단을 지배합니다11.

PSC로부터 NC 세포를 유도하는 것은 일반적으로 이중 SMAD 억제와 WNT 경로 활성화의 조합을 포함한다12,13. 최근까지 모든 NC 유도 프로토콜에는 배양 조건에서 혈청 및 기타 동물성 제품 첨가제가 포함되었습니다. 화학적으로 정의되지 않은 매체는 NC 유도의 재현성을 낮출 뿐만 아니라 기계론적 발달 연구에 도전합니다. 이러한 문제를 극복하기 위해 Barber 등(14)은 화학적으로 정의된 배양 조건을 사용하여 NC 유도 프로토콜을 개발했으며, 따라서 혈청 치환 인자(예: KSR)에 의존하는 대체 방법보다 유리했습니다(예: KSR)13,14. 이는 기저 배지 치환과 Fattahi 등이 hPSC에서 장내 NC 세포를 유도하기 위해 처음 제시한 프로토콜을 최적화하여 얻은 것입니다. 이 개선된 시스템은 여기에 제시된 hPSC 차별화 프로토콜의 기초입니다. 레티노산(RA) 외에도 BMP, FGF, WNT 및 TGFβ 신호 전달을 정밀하게 조절하여 15일 동안 장 신경능선(ENC) 세포를 유도하는 것으로 시작됩니다. 그런 다음 신경교세포주 유래 신경영양인자(GDNF)로 세포를 처리하여 ENS 계통을 도출합니다. 모든 배지 조성은 화학적으로 정의되며 30-40일 이내에 강력한 장 신경 세포 배양을 생성합니다.

본 명세서에 기술된 단층 세포 배양 시스템 외에도, 자유-부유 배아체(15,16)를 사용하는 대안적인 NC 유도 접근법이 개발되었다. 이러한 배양에서 이동 세포는 미주 NC를 나타내는 부분 집합과 함께 NC 마커를 발현하는 것으로 나타났습니다. 이러한 배양에서 장내 NC 전구체를 농축하기 위해 일차 장 조직과의 동반 배양이 사용되었습니다. 이 연구의 배지 구성에는 신경 성장 인자, NT3 및 뇌 유래 신경 영양 인자와 같은 다양한 요인의 조합이 포함되어 있습니다. 이 단계에서는 이러한 요인이 장 뉴런 전구체 헌신 정체성에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 완전히 명확하지 않습니다. 단층과 배아체 기반 배양에서 장내 NC 유도를 효율적으로 비교하려면 더 많은 데이터가 필요합니다. 이러한 전략의 다양한 문화권 레이아웃을 감안할 때 각 방법의 사용을 고려하고 특정 응용 프로그램에 따라 최적화해야 합니다.

여기에 제시된 프로토콜은 재현 가능하며 다른 hPSC(유도 및 배아) 라인 8,14,16을 사용하여 당사와 다른 사람들에 의해 성공적으로 테스트되었습니다.

프로토콜

1. 미디어 준비

참고: 프로토콜 전체에서 언급된 농도는 미디어 구성 요소의 최종 농도입니다. 멸균 상태에서 모든 매체를 층류 후드에서 준비하고 어두운 곳에서 4°C에서 보관합니다. 2주 이내에 사용하십시오.

  1. hPSC 유지 배지: 기본 배지와 함께 피더가 없는 hPSC 유지 배지 보충제(20μL/mL)를 혼합합니다.
  2. 배지 A: 뼈 형태 유전 단백질 4(BMP4, 1ng/mL), SB431542(10μM) 및 CHIR99021(600nM)를 분화 기본 배지에 추가합니다.
  3. 배지 B: SB431542(10 μM) 및 CHIR99021(1.5 μM)를 분화 기본 매체에 추가합니다.
  4. 배지 C: SB431542(10 μM), CHIR99021(1.5 μM) 및 RA(1 μM)를 분화 베이스 배지에 추가합니다.
  5. 신경능선 완료(NCC) 배지: 신경기저 배지에 FGF2(10ng/mL), CHIR99021(3μM), N2 보충제(10μL/mL), B27 보충제(20μL/mL), L-글루타민 보충제(10μL/mL) 및 MEM NEAAs(10μL/mL)를 추가합니다.
  6. ENC 배지: GDNF(10ng/mL), 아스코르브산(100μM), N2 보충제(10μL/mL), B27 보충제(20μL/mL), L-글루타민 보충제(10μL/mL) 및 MEM NEAA(10μL/mL)를 신경기저 배지에 추가합니다.
  7. 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 1x: PBS에서 500mM EDTA(1000x)를 최종 농도 500μM로 희석합니다.
    참고: 달리 명시되지 않는 한 이 프로토콜 전체에서 Ca2+ 및 Mg2+ 무료 PBS를 사용하십시오.

2. 배양 플레이트의 코팅

  1. 기저막 매트릭스 코팅 플레이트: 50mL 혈청학적 피펫을 사용하여 세게 피펫팅하여 50mL의 냉각된 DMEM:F12에 500μL의 동결 부분 표본을 빠르게 해동하고 희석합니다. 희석된 기저막 매트릭스 용액(웰 표면적의cm2 당 100μL)으로 웰을 코팅하고 37°C에서 밤새 배양합니다. 사용하기 전에 코팅 매체를 흡입하십시오. 기저막 매트릭스의 젤라틴화를 방지하려면 가능한 한 빨리 이 단계를 수행하고 차가운 DMEM:F12를 사용하여 동결된 부분 표본을 용해하십시오.
    알림: 기저막 매트릭스 온도는 응고를 방지하기 위해 해동(얼음 위) 및 분취(얼음 위의 튜브) 중에 차갑게 유지해야 합니다.
  2. PO/FN/라미닌 코팅 플레이트: 1000x 스톡을 희석하여 PBS에서 15μg/mL 폴리오르니틴(PO) 용액을 준비합니다. 웰 표면적의cm2 당 100μL의 PO/PBS 용액을 웰에 코팅하고 37°C에서 밤새 플레이트를 배양합니다. 다음 날, PO/PBS를 흡인하고 2μg/mL의 피브로넥틴(FN) 및 2μg/mL의 라미닌을 함유한 갓 만든 FN/라미닌/PBS 용액으로 웰 표면적의cm2 당 100μL로 웰을 코팅합니다. 플레이트는 37°C에서 최소 2시간 배양 후 사용할 수 있습니다. 사용하기 전에 FN/라미닌/PBS를 흡입하십시오.

3. hPSC 문화 유지

알림: 모든 세포 배양 단계는 가습 인큐베이터에서 5% CO2 및 37°C입니다.

  1. hPSC 배양액에서 hPSC 배지를 흡인하고 콜로니가 ~80% 합류할 때까지 격일로 새 배지(웰 표면적의cm2 당 200μL)를 추가합니다.
  2. 통과시키기 위해 hPSC 배지를 흡인하고 웰 표면적의cm2 당 100μL의 PBS로 세포를 세척합니다.
    참고: 세포를 세척하기 위해 Ca2+ 및 Mg2+ 무료 PBS를 사용하는 것이 중요합니다.
  3. 500 μM EDTA(웰 표면적의cm2 당 100 μL)를 추가합니다. 접시의 뚜껑을 교체합니다. 도립 현미경을 통해 관찰하고 세포에서 콜로니 가장자리가 분리되었는지 모니터링합니다(2-4분).
  4. 5 또는 10 mL 혈청학적 피펫을 사용하여 동일한 부피의 hPSC 배지를 각 웰에 주입하고 몇 차례 위아래로 피펫팅하여 세포를 기계적으로 수확합니다.
    참고: 최적의 EDTA 배양 시간은 iPSC 라인에 따라 다릅니다. 콜로니를 분리하기 위한 격렬한 피펫팅은 과도한 콜로니 해리와 세포 사멸로 이어질 수 있으므로 피하십시오. 분화 플레이트를 시작하기 위해 passaging을 할 때 EDTA로 세포를 1-2분 더 배양합니다.
  5. 세포 현탁액을 15mL 코니컬 튜브에 옮깁니다. 세포를 회전시키고(2분, 290 x g, 20-25 °C) 상층액을 조심스럽게 버립니다.
  6. 적절한 부피의 hPSC 배지에 세포를 재현탁시키고 새로운 기저막 매트릭스 코팅판의 웰로 옮깁니다.
    참고: 정기적인 hPSC 유지 관리의 경우 1:18 - 1:24 통과 비율을 사용하십시오(1:18은 6-웰 플레이트의 단일 웰에서 분리된 셀의 1/3을 완전한 새 플레이트로 이전하는 것을 의미). 차별화 플레이트를 시작하려면 5:6 통과 비율을 따르십시오.
  7. 5% CO2 및 37°C에서 배양합니다.

4. 신경능선 유도

참고: 이 단계는 그림 1A에 개략적으로 표시되어 있습니다. 세포가 약 80% 합류할 때 NC 분화를 시작합니다. 이것은 세포가 5:6 비율로 통과할 때 1-2일 이내에 달성됩니다(위 참조). 만능 및 완전 미분화 hPSC 세포로 0일에 NC 분화를 시작합니다. 높은 효율성을 위해 콜로니 경계에는 최소한의 분화 세포가 있어야 합니다. 콜로니가 크거나 도립 현미경을 사용하여 모니터링할 때 콜로니의 중심이 두꺼워지거나 어두워지기 시작할 때 구별을 위한 통로 및 플레이트 hPSC. 밀도와 형태에 주의를 기울이는 것은 세포주에 따라 다를 수 있고 cm당 50,000-200,000까지 다양할 수 있기 때문에 도금된 세포의 수보다 더 신뢰할 수 있는 경향이 있습니다2.

  1. 0일차에 hPSC 유지 배지를 1ng/mL BMP4, 10μM SB431542, 600nM CHIR99021(웰 표면적cm2 당 배지 200μL)를 포함하는 배지 A로 교체합니다.
  2. 2일째에는 셀이 100% 합류해야 합니다. 사용한 배지 A를 부드럽게 흡인하고 10μM SB431542, 1.5μM CHIR99021(웰 표면적의cm2 당 배지 200μL)를 포함하는 배지 B를 공급합니다.
    참고: NC 유도 중에 배양액이 성장함에 따라 세포가 기본 단층에서 분리될 수 있습니다. 오래된 매체를 부드럽게 제거하고 웰 측면에 새 매체를 추가하여 과도한 세포 손실을 방지하십시오.
  3. 4일째에 배지 B(웰 표면적의cm2 당 배지 200μL)로 셀을 다시 공급합니다.
  4. 6일째에 매체 B를 10μM SB431542, 1.5μM CHIR99021 및 1μM 레티노산(웰 표면적cm2 당 배지 400μL)을 포함하는 매체 C로 교체합니다.
  5. 8일째와 10일째에는 6일째로 먹이십시오.

5. ENC 스페로이드 형성

참고: 이 단계는 그림 1B에 개략적으로 표시되어 있습니다.

  1. 12일째에 배지 C를 부드럽게 흡인하고 웰 표면적의cm2 당 100μL의 PBS로 세포를 세척합니다. 동일한 부피의 세포 분리 용액을 추가하고 5%CO2 및 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
  2. 10ng/mL FGF2, 3μM CHIR99021, 10μL/mL N2 보충제, 20μL/mL B27 보충제, 10μL/mL L-글루타민 보충제 및 10μL/mL MEM NEAA를 포함하는 동일한 부피의 NCC 배지를 추가하여 세포 분리 용액을 희석합니다. 혈청학적 피펫을 사용하여 단일 세포 현탁액을 수확하고 15mL 코니컬 튜브에 추가합니다.
  3. 세포를 회전시키고(2분, 290 x g, 20-25 °C) 상층액을 조심스럽게 버립니다.
  4. 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 12mL(전체 6웰 플레이트의 경우)의 NCC 배지를 추가하고 기계적으로 위아래로 1-2회 피펫팅하여 세포를 완전히 재현탁합니다. 셀 현탁액을 초저 부착 플레이트로 옮깁니다.
    참고: 약 10cm2의 ENC 단층 셀이 2mL의 NCC 배지에 재현탁되고 초저 부착 플레이트의 1웰로 옮겨집니다. 이는 전체 6웰 NC 인덕션 플레이트를 전체 6웰 초저 부착 플레이트로 옮기는 것과 같습니다.
  5. 14일째에는 작은 스페로이드가 각 웰의 중앙에 모일 때까지 플레이트를 부드럽게 소용돌이칩니다. P1000 마이크로피펫을 사용하여 느린 원을 그리며 각 웰의 둘레 주위에서 사용된 NCC 배지를 흡입합니다. 자유롭게 떠다니는 스페로이드를 제거하지 마십시오.
  6. 세포에 원래 부피의 NCC 배지를 공급합니다.

6. EN 감응작용

참고: 이 단계는 그림 1B에 개략적으로 표시되어 있습니다.

  1. 15일째에 사용한 것과 동일한 기술을 적용하여 배지를 부드럽게 제거하고 PBS로 스페로이드를 세척합니다. 스페로이드를 피하면서 가능한 한 많은 PBS를 제거합니다.
  2. 세포 분리 용액 (웰 표면적의 cm2 당 100 μL)을 추가하고 5 % CO2 및 37 ° C에서 30 분 동안 배양 하여 스페로이드를 단일 세포로 해리시킵니다.
  3. 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 동일한 부피의 ENC 배지(10ng/mL GDNF, 100μM 아스코르브산, 10μL/mL N2 보충제, 20μL/mL B27 보충제, 10μL/mL L-글루타민 보충제 및 신경기저 배지에 10μL/mL MEM NEAA 포함)를 각 웰에 추가하고 나머지 스페로이드를 2-3차례의 기계적 피펫팅으로 분해합니다. 세포를 50mL 코니컬 튜브로 옮깁니다.
    알림: 강제 피펫팅 또는 팁 개구부가 작은 피펫 사용으로 인해 발생할 수 있는 과도한 전단 응력과 세포 사멸을 피하십시오.
  4. 세포를 회전시키고(2분, 290 x g, 20-25 °C) 상층액을 조심스럽게 버립니다. 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 5~10mL의 ENC 배지를 추가하고 1-2회 위아래로 피펫팅하여 세포를 완전히 재현탁합니다.
  5. trypan blue와 혈구계와 같은 세포 계수 방법을 사용하여 생존 가능한 세포의 농도를 계수합니다.
    주의: 트리판 블루는 발암 의심 물질입니다. 주의해서 다루고 적절하게 폐기하십시오.
  6. mL당 약 ~ 1,000,000개의 세포의 밀도에서 표면적의cm2 당 약 300,000-400,000개의 생존 가능한 세포를 도금하는 것을 목표로 하는 충분한 양의 ENC 배지를 추가합니다. 플레이트의 웰에서 FN/라미닌/PBS 용액을 흡입합니다.
    참고: 이 단계는 프로토콜의 최종 재도금 단계를 표시하므로 EN 배양에 대해 계획된 분석에 따라 플레이트 형식을 선택하십시오. 장 뉴런 전구 세포는 15일에 동결될 수 있습니다. 세포 분리 용액으로 구체를 해리한 후 10% DMSO 또는 Stem-cellbanker와 같은 동결 매체에서 약 5 x 106 cells/mL에서 전구체를 재현탁시킵니다. 필요한 경우 5μM Y-27632 ROCK 억제제를 사용하여 따뜻한 ENC 매체에서 해동합니다. 원하는 플레이트 형식의 플레이트 셀. 몇 시간 후에 미디어를 새 ENC로 교체합니다.
  7. 세포를 PO/FN/라미닌 코팅된 웰에 부드럽게 추가합니다. 특히 384웰 플레이트와 같이 웰 크기가 더 작은 플레이트를 사용할 때 PO/FN/라미닌 코팅에 셀이 부착되는 것을 방지하는 셀 현탁액 아래에 기포가 갇히지 않도록 하십시오. 이것은 세포 사멸로 이어질 수 있습니다.
  8. 30-40일까지 ENC 배지 (웰 표면적 cm2 당 200 μL)로 격일로 셀을 공급 한 후 공급 빈도를 줄이지만 (일주일에 한 번 또는 두 번으로) 공급 부피를 두 배로 늘립니다 (웰 표면적의 cm2 당 400 μL의 매체까지).
    참고: 배지를 과도하게 제거하고 추가하면 웰 표면에서 신경 세포 배양이 분리되는 것을 촉진할 수 있으므로 이는 중요합니다. 특히 장기 배양에서 박리를 전향적으로 예방하려면 일주일에 한 번 ENC에 FN(2μg/mL) 및 라미닌(2μg/mL)을 보충하십시오.

결과

이 프로토콜은 화학적으로 정의된 배양 조건을 사용하여 hPSC에서 장 신경능선 및 장 뉴런을 유도하는 방법을 제공합니다(그림 1A-B). 고품질 뉴런을 생성하는 것은 효율적인 장 신경능선 유도 단계에 달려 있습니다. 이것은 그림 1C에서 볼 수 있듯이 약 0.1 - 0.4 mm 크기의 매끄러운 표면으로 둥글게 보여야 하는 자유 부동 구의 형태를 확인하?...

토론

여기에 설명된 분화 프로토콜은 30-40일 이내에 hPSC에서 장 뉴런을 얻고(그림 1E) 더 오래된 배양에서 신경교세포, GFAP 및 SOX10을 발현하는 장내 신경교세포를 얻기 위한 강력한 시험관 내 방법을 제공합니다(> 55일)13,14,19,22. 이러한 뉴런과 신경교세포는 hPSC를 미주신경 및 장...

공개

저자는 밝힐 것이 없습니다.

감사의 말

이 연구는 UCSF Program for Breakthrough Biomedical Research 및 Sandler Foundation의 보조금, March of Dimes 보조금 번호 1-FY18-394 및 1DP2NS116769-01, F.F.에 NIH Director's New Innovator Award(DP2NS116769), F.F.에 대한 National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases(R01DK121169)의 보조금으로 지원되었으며, H.M.은 Larry L. Hillblom Foundation 박사후 연구원의 지원을 받습니다. NIH T32-DK007418 펠로우십 및 UCSF 획기적인 생물 의학 연구를 위한 프로그램, 독립적인 박사후 연구원.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Ascorbic acidSigma-AldrichA5960
B27 supplement (serum free, minus vitamin A)Gibco12587-010
Basement membrane matrix, GeltrexGibcoA14133-2
BMP4R&D systems314-BP
Cell culture centrifugeEppendorf, model no. 5810R02262501
Cell detachment solution, AccutaseStemcell Technologies07920
CHIR99021Tocris4423
Conical tubesUSA scientific1475-0511, 1500-1211
Differentiation base medium, Essential 6Life TechnologiesA1516401
DMEM/F-12 no glutamineLife Technologies21331020
EDTACorningMT-46034CI
Feeder-free hPSC maintenance medium, Essential 8 Flex Medium KitLife TechnologiesA2858501
FGF2R&D systems233-FB/CF
FibronectinCorning356008
GDNFPeprotech450-10
HemocytometerHausser Scientific1475
Human pluripotent stem cells, H9 ESCWiCellRRID: CVCL_1240
Incubator with controlled humidity, temperature and CO2Thermo Fisher ScientificHerralcell 150i
Inverted microscopeThermo Fisher ScientificEVOS FL
Laminar flow hoodThermo Fisher Scientific1300 series class II, type A2
LamininCultrex3400-010
L-glutamine supplement, GlutagroCorning25-015-CI
MEM NEAAsCorning25-025-CI
Multiwell plates, FalconBD353934, 353075
N-2 SupplementCTSA1370701
Neurobasal MediumLife Technologies21103049
PBS (Ca and Mg free)Life Technologies10010023
Pipette fillerEppendorfZ768715-1EA
Pipette tipsUSA scientific1111-2830
PipettesFisherbrand13-678-11E, 13-678-11F
POSigma-AldrichP3655
polymer coverslip bottom imaging plates, ibidiibidi81156
RASigma-AldrichR2625
SB431542R&D systems1614
Trypan blue stain, 0.4%Thermo Fisher Scientific15250-061
Ultra-low attachment platesFisher Scientific07-200-601
Y-27632 dihydrochlorideR&D systems1254

참고문헌

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