Differentiation of Enteric Nervous System Lineages from Human Pluripotent Stem Cells(인간 만능줄기세포와 장 신경계 계통의 분화)

요약

인간 만능 줄기 세포(hPSC)에서 장 신경계(ENS) 계통을 추출하면 ENS 발병 및 질병을 연구하고 재생 의학에 사용할 수 있는 확장 가능한 세포 소스를 얻을 수 있습니다. 여기에서는 화학적으로 정의된 배양 조건을 사용하여 hPSC에서 장 뉴런을 유도하기 위한 자세한 in vitro 프로토콜이 제시됩니다.

초록

인간의 장 신경계(ENS)는 신경전달물질의 다양성이 현저한 신경교세포와 신경세포의 대규모 네트워크입니다. ENS는 장 운동성, 효소 분비, 영양소 흡수를 조절하고 면역 체계 및 장내 마이크로바이옴과 상호 작용합니다. 결과적으로, ENS의 발달 및 후천적 결함은 많은 인간 질병의 원인이 되며 파킨슨병의 증상에 기여할 수 있습니다. 동물 모델 시스템의 한계와 일차 조직에 대한 접근은 인간 ENS 연구에서 중요한 실험적 과제를 제기합니다. 여기에서는 정의된 배양 조건을 사용하여 인간 만능 줄기 세포(hPSC)에서 ENS 계통을 효과적으로 체 외 에서 유도하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 당사의 프로토콜은 15일 이내에 hPSC를 장 신경능선 세포로 직접 분화하는 것으로 시작하여 30일 이내에 다양한 하위 유형의 기능성 장 신경 세포를 생성합니다. 이 플랫폼은 개발 연구, 질병 모델링, 약물 발견 및 재생 애플리케이션을 위한 확장 가능한 리소스를 제공합니다.

서문

장 신경계(ENS)는 말초 신경계에서 가장 큰 구성 요소입니다. ENS는 위장관 내에 위치한 4억 개 이상의 뉴런을 포함하고 있으며 장의 거의 모든 기능을 제어합니다¹. 장 신경병증의 ENS 발달 및 기능, 결함에 대한 분자적 이해를 위해서는 신뢰할 수 있고 확실한 장 신경 세포 공급원에 접근해야 합니다. 인간의 일차 조직에 대한 접근은 제한적이며, 동물 모델은 많은 장 신경병증에서 주요 질병 표현형을 요약하지 못합니다. 인간 만능 줄기 세포(hPSC) 기술은 원하는 세포 유형, 특히 1차 공급원에서 분리하기 어려운 세포 유형을 무제한으로 제공하는 데 매우 유익한 것으로 입증되었습니다 2,3,4,5,6,7. 여기에서는 hPSC에서 ENS 배양을 얻기 위한 단계적이고 강력한 in vitro 방법에 대한 세부 정보를 제공합니다. 이러한 확장 가능한 hPSC 유래 배양은 발달 연구, 질병 ....

프로토콜

1. 미디어 준비

참고: 프로토콜 전체에서 언급된 농도는 미디어 구성 요소의 최종 농도입니다. 멸균 상태에서 모든 매체를 층류 후드에서 준비하고 어두운 곳에서 4°C에서 보관합니다. 2주 이내에 사용하십시오.

1. hPSC 유지 배지: 기본 배지와 함께 피더가 없는 hPSC 유지 배지 보충제(20μL/mL)를 혼합합니다.
2. 배지 A: 뼈 형태 유전 단백질 4(BMP4, 1ng/mL), SB431542(10μM) 및 CHIR99021(600nM)를 분화 기본 배지에 추가합니다.
3. 배지 B: SB431542(10 μM) 및 CHIR99021(1.5 μM)를 분화 기본 매체에 추가합니다.
4. 배지 C: SB431542(10 μM), CHIR99021(1.5 μM) 및 RA(1 μM)를 분화 베이스 배지에 추가합니다.
5. 신경능선 완료(NCC) 배지: 신경기저 배지에 FGF2(10ng/mL), CHIR99021(3μM), N2 보충제(10μL/mL), B27 보충제(20μL/mL), L-글루타민 보충제(10μL/mL) 및 MEM NEAAs(10μL/mL)를 추가합니다.
6. ENC 배지: GDNF(10ng/mL), 아스코르브산(100μ....

토론

여기에 설명된 분화 프로토콜은 30-40일 이내에 hPSC에서 장 뉴런을 얻고(그림 1E) 더 오래된 배양에서 신경교세포, GFAP 및 SOX10을 발현하는 장내 신경교세포를 얻기 위한 강력한 시험관 내 방법을 제공합니다(> 55일)13,14,19,22. 이러한 뉴런과 신경교세포는 hPSC를 미주신경 및 장.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A5960
B27 supplement (serum free, minus vitamin A)	Gibco	12587-010
Basement membrane matrix, Geltrex	Gibco	A14133-2
BMP4	R&D systems	314-BP
Cell culture centrifuge	Eppendorf, model no. 5810R	02262501
Cell detachment solution, Accutase	Stemcell Technologies	07920
CHIR99021	Tocris	4423
Conical tubes	USA scientific	1475-0511, 1500-1211
Differentiation base medium, Essential 6	Life Technologies	A1516401
DMEM/F-12 no glutamine	Life Technologies	21331020
EDTA	Corning	MT-46034CI
Feeder-free hPSC maintenance medium, Essential 8 Flex Medium Kit	Life Technologies	A2858501
FGF2	R&D systems	233-FB/CF
Fibronectin	Corning	356008
GDNF	Peprotech	450-10
Hemocytometer	Hausser Scientific	1475
Human pluripotent stem cells, H9 ESC	WiCell	RRID: CVCL_1240
Incubator with controlled humidity, temperature and CO2	Thermo Fisher Scientific	Herralcell 150i
Inverted microscope	Thermo Fisher Scientific	EVOS FL
Laminar flow hood	Thermo Fisher Scientific	1300 series class II, type A2
Laminin	Cultrex	3400-010
L-glutamine supplement, Glutagro	Corning	25-015-CI
MEM NEAAs	Corning	25-025-CI
Multiwell plates, Falcon	BD	353934, 353075
N-2 Supplement	CTS	A1370701
Neurobasal Medium	Life Technologies	21103049
PBS (Ca and Mg free)	Life Technologies	10010023
Pipette filler	Eppendorf	Z768715-1EA
Pipette tips	USA scientific	1111-2830
Pipettes	Fisherbrand	13-678-11E, 13-678-11F
PO	Sigma-Aldrich	P3655
polymer coverslip bottom imaging plates, ibidi	ibidi	81156
RA	Sigma-Aldrich	R2625
SB431542	R&D systems	1614
Trypan blue stain, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250-061
Ultra-low attachment plates	Fisher Scientific	07-200-601
Y-27632 dihydrochloride	R&D systems	1254