Différenciation des lignées du système nerveux entérique à partir de cellules souches pluripotentes humaines

Résumé

La dérivation de lignées du système nerveux entérique (ENS) à partir de cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) fournit une source évolutive de cellules pour étudier le développement et la maladie de l’ENS, et à utiliser en médecine régénérative. Ici, un protocole in vitro détaillé pour dériver des neurones entériques à partir de hPSC en utilisant des conditions de culture chimiquement définies est présenté.

Résumé

Le système nerveux entérique humain, ENS, est un vaste réseau de types de cellules gliales et neuronales avec une diversité remarquable de neurotransmetteurs. Le SNE contrôle la motilité intestinale, la sécrétion d’enzymes et l’absorption des nutriments et interagit avec le système immunitaire et le microbiome intestinal. Par conséquent, les défauts développementaux et acquis du SNE sont responsables de nombreuses maladies humaines et peuvent contribuer aux symptômes de la maladie de Parkinson. Les limites des systèmes de modèles animaux et l’accès aux tissus primaires posent des défis expérimentaux importants dans les études du SNE humain. Ici, un protocole détaillé est présenté pour une dérivation in vitro efficace des lignées ENS à partir de cellules souches pluripotentes humaines, hPSC, en utilisant des conditions de culture définies. Notre protocole commence par une différenciation dirigée des hPSC en cellules de la crête neurale entérique en 15 jours et produit divers sous-types de neurones entériques fonctionnels en 30 jours. Cette plate-forme fournit une ressource évolutive pour les études de développement, la modélisation de maladies, la découverte de médicaments et les applications régénératives.

Introduction

Le système nerveux entérique (SNE) est le composant le plus important du système nerveux périphérique. Le SNE contient plus de 400 millions de neurones qui sont situés dans le tractus gastro-intestinal et contrôlent presque toutes les fonctions de l’intestin¹. La compréhension moléculaire du développement et de la fonction du SNE et de ses défauts dans les neuropathies entériques nécessite l’accès à une source fiable et authentique de neurones entériques. L’accès aux tissus primaires humains est limité, et les modèles animaux ne parviennent pas à récapituler les phénotypes clés de la maladie dans de nombreuses neuropathies entériques. La technologie des cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) s’est avérée extrêmement bénéfique en fournissant une source illimitée de types de cellules souhaités, en particulier celles qui sont difficiles à isoler à partir de sources primaires 2,3,4,5,6,7. Ici, nous fournissons les détails d’une méthode in vitro robuste et par étapes pour obtenir des cultures ENS à partir de hPSC. Ces cultures évolutives dérivées de hPSC ouvrent la voie aux études de développement, à la modélisation des maladies et au criblage de médicaments à haut débit et peuvent fournir des cellules transplantables pour la médecine régénérative.

Les lignées de neurones entériques sont dérivées de cellules de crête neurale (NC) suivant le chemin de développement du SNE au cours de l’embryogenèse. Chez les embryons, les cellules NC émergent le long des marges de la plaque neurale pliée. Ils prolifèrent, migrent et donnent naissance à de nombreux types de cellules différents, notamment les neurones sensoriels, les cellules de Schwann, les mélanocytes, le squelette craniofacial et les neurones entériques et glia ^8,9,10. La décision du destin cellulaire dépend de la région distincte le long de l’axe antéro-postérieur d’où émergent les cellules NC, c’est-à-dire NC crânienne, NC vagale, NC tronc et NC sacrée. Le SNE se développe à partir de cellules NC vagales et sacrées, les premières dominant la population des neurones entériques en raison de la migration extensive le long de l’intestin et colonisant l’intestin¹¹.

La dérivation des cellules NC à partir des CSP implique généralement une combinaison d’inhibition double de SMAD et d’activation de la voie WNT^12,13. Jusqu’à récemment, tous les protocoles d’induction de la NC impliquaient des additifs sériques et d’autres produits animaux dans les conditions de culture. Les milieux chimiquement indéfinis réduisent non seulement la reproductibilité de l’induction CN, mais remettent également en question les études de développement mécanistes. Pour surmonter ces défis, Barber et coll.¹⁴ ont mis au point un protocole d’induction de la NC en utilisant des conditions de culture chimiquement définies et s’est donc avéré avantageux par rapport aux autres méthodes qui reposent sur des facteurs de remplacement sérique (p. ex., KSR)^13,14. Ceci a été obtenu par des remplacements de milieux basaux et l’optimisation d’un protocole présenté à l’origine par Fattahi et al pour dériver des cellules NC entériques à partir de hPSC. Ce système amélioré est à la base du protocole de différenciation hPSC qui est présenté ici. Elle commence par l’induction de cellules entériques de la crête neurale (ENC) sur une période de 15 jours par une modulation précise de la signalisation BMP, FGF, WNT et TGFβ en plus de l’acide rétinoïque (RA). Nous dérivons ensuite les lignées ENS en traitant des cellules avec du facteur neurotrophique dérivé de la lignée cellulaire gliale (GDNF). Toutes les compositions de milieux sont définies chimiquement et produisent des cultures neuronales entériques robustes en 30 à 40 jours.

En plus du système de culture cellulaire monocouche décrit ici, d’autres approches d’induction NC ont été développées qui utilisent des corps embryoïdes flottants^15,16. Il a été démontré que les cellules migratrices de ces cultures expriment des marqueurs NC avec un sous-ensemble représentant le NC vagal. Des co-cultures avec du tissu intestinal primaire ont été utilisées pour enrichir les précurseurs entériques des NC dans ces cultures. La composition des milieux dans ces études contient une combinaison de différents facteurs tels que le facteur de croissance nerveuse, NT3 et le facteur neurotrophique dérivé du cerveau. À ce stade, il n’est pas tout à fait clair comment ces facteurs pourraient affecter les identités d’engagement des précurseurs des neurones entériques. Pour une comparaison efficace de l’induction entérique des NC dans la monocouche et les cultures basées sur le corps embryoïde, davantage de données sont nécessaires. Étant donné les différentes dispositions de culture dans ces stratégies, l’utilisation de chaque méthode doit être envisagée et optimisée en fonction de l’application spécifique à l’esprit.

Le protocole présenté ici est reproductible et a été testé avec succès par nous et d’autres en utilisant différentes lignées hPSC (induites et embryonnaires) ^8,14,16.

Protocole

1. Préparation des supports

REMARQUE : Les concentrations mentionnées tout au long du protocole sont les concentrations finales des composants du milieu. Préparez tous les milieux dans des conditions stériles dans une hotte à flux laminaire et conservez-les à 4 °C dans l’obscurité. Utilisation dans les 2 semaines.

1. Milieu d’entretien hPSC : Mélanger un supplément de milieu d’entretien hPSC sans alimentateur (20 μL/mL) avec son milieu de base.
2. Milieu A : Ajouter la protéine morphogénétique osseuse 4 (BMP4 ; 1 ng/mL), SB431542 (10 μM) et CHIR99021 (600 nM) au milieu de base de différenciation.
3. Milieu B : Ajouter SB431542 (10 μM) et CHIR99021 (1,5 μM) au milieu de base de différenciation.
4. Milieu C : Ajouter SB431542 (10 μM), CHIR99021 (1,5 μM) et RA (1 μM) au milieu de base de différenciation.
5. Milieu de crête neurale complète (NCC) : Ajouter FGF2 (10 ng/mL), CHIR99021 (3 μM), supplément N2 (10 μL/mL), supplément B27 (20 μL/mL), supplément de L-glutamine (10 μL/mL) et MEM NEAAs (10 μL/mL) au milieu neurobasal.
6. Milieu ENC : Ajouter du GDNF (10 ng/mL), de l’acide ascorbique (100 μM), un supplément de N2 (10 μL/mL), un supplément de B27 (20 μL/mL), un supplément de L-glutamine (10 μL/mL) et des NEAA MEM (10 μL/mL) au milieu neurobasal.
7. Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) 1x : Diluer 500 mM d’EDTA (1000x) jusqu’à une concentration finale de 500 μM dans du PBS.
   REMARQUE : Utilisez du PBS sans Ca²⁺ et Mg²⁺ tout au long de ce protocole, sauf indication contraire.

2. Revêtement des plaques de culture

1. Plaques revêtues de matrice de membrane basale : Décongeler rapidement et diluer une aliquote congelée de 500 μL de matrice de membrane basale dans 50 mL de DMEM :F12 réfrigéré en pipetant vigoureusement à l’aide d’une pipette sérologique de 50 mL. Enduire les puits avec la solution de matrice diluée de la membrane basale (100 μL par^cm2 de surface du puits) et les incuber toute la nuit à 37 °C. Aspirez le produit d’enrobage avant utilisation. Pour éviter la gélatinisation de la matrice de la membrane basale, effectuez cette étape le plus rapidement possible et utilisez du DMEM :F12 froid pour dissoudre l’aliquote congelée.
   REMARQUE : La température de la matrice de la membrane basale doit être maintenue froide pendant la décongélation (sur glace) et l’aliquotage (tubes sur glace) pour prévenir la coagulation.
2. Plaques revêtues de PO/FN/laminine : Préparez une solution de polyornithine (PO) de 15 μg/mL dans du PBS en diluant un stock 1000x. Enduire les puits avec 100 μL de solution PO/PBS par cm² de surface de puits et incuber les plaques pendant la nuit à 37 °C. Le lendemain, aspirer le PO/PBS et enduire les puits à 100 μL par cm² de surface du puits avec une solution fraîchement préparée de FN/laminine/PBS contenant 2 μg/mL de fibronectine (FN) et 2 μg/mL de laminine. Les plaques peuvent être utilisées après un minimum de 2 h d’incubation à 37 °C. Aspirer FN/laminin/PBS avant utilisation.

3. Maintien de la culture hPSC

REMARQUE : Toutes les étapes d’incubation des cellules se font à 5 % de CO₂ et à 37 °C dans un incubateur humidifié.

1. Aspirer le milieu hPSC de la culture hPSC et ajouter du milieu frais (200 μL par cm² de surface du puits) tous les deux jours jusqu’à ce que les colonies soient confluentes à ~80 %.
2. Pour le passage, aspirez le milieu hPSC et lavez les cellules avec 100 μL de PBS par^cm2 de surface de puits.
   REMARQUE : Il est important d’utiliser du PBS libre Ca²⁺ et Mg²⁺ pour laver les cellules.
3. Ajouter 500 μM d’EDTA (100 μL par cm² de surface de puits). Replacez le couvercle de la plaque. Observez à l’aide d’un microscope inversé et surveillez les cellules pour décoller les bords de la colonie (2 à 4 min).
4. À l’aide d’une pipette sérologique de 5 ou 10 ml, transférez le même volume de milieu hPSC dans chaque puits et récoltez mécaniquement les cellules en pipetant de haut en bas à quelques reprises.
   REMARQUE : Le temps d’incubation optimal de l’EDTA dépend de la ligne iPSC. Évitez le pipetage vigoureux pour détacher les colonies, car cela peut entraîner une dissociation excessive des colonies et la mort cellulaire. Lors du passage pour démarrer une plaque de différenciation, incuber les cellules avec de l’EDTA pendant 1 à 2 minutes de plus.
5. Transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 ml. Faites tourner les cellules (2 min, 290 x g, 20-25 °C) et jetez soigneusement le surnageant.
6. Remettre les cellules en suspension dans un volume approprié de milieu hPSC et transférer dans les puits d’une nouvelle plaque revêtue d’une matrice de membrane basale.
   REMARQUE : Pour un entretien régulier des hPSC, utilisez un rapport de passage de 1:18 à 1:24 (1:18 signifie le transfert d’un tiers des cellules dissociées d’un seul puits d’une plaque à 6 puits dans une nouvelle plaque complète). Pour démarrer une plaque de différenciation, suivez un rapport de passage de 5:6.
7. Incuber à 5% de CO₂ et 37 °C.

4. Induction de la crête neurale

REMARQUE : Cette étape est représentée schématiquement à la figure 1A. Commencer la différenciation NC lorsque les cellules sont confluentes à environ 80 %. Cela sera réalisé en 1 à 2 jours lorsque les cellules sont passées à un rapport de 5:6 (voir ci-dessus). Commencer la différenciation NC au jour 0 avec des cellules hPSC pluripotentes et totalement indifférenciées. Pour une efficacité élevée, les limites de la colonie doivent avoir un minimum de cellules différenciatrices. Passage et plaque hPSC pour la différenciation lorsque les colonies sont grandes, ou que le centre de la colonie commence à s’épaissir/s’assombrir lorsqu’il est surveillé à l’aide d’un microscope inversé. Prêter attention à la confluence et à la morphologie a tendance à être plus fiable que le nombre de cellules plaquées, car cela peut varier en fonction de la lignée cellulaire et peut varier de 50 000 à 200 000 par^cm2.

1. Le jour 0, remplacer le milieu d’entretien hPSC par le milieu A contenant 1 ng/mL de BMP4, 10 μM SB431542, 600 nM de CHIR99021 (200 μL de milieu par cm² de surface de puits).
2. Le jour 2, les cellules devraient être confluentes à 100 %. Aspirez doucement le milieu A épuisé et alimentez les cellules avec le milieu B contenant 10 μM de SB431542, 1,5 μM de CHIR99021 (200 μL de milieu par cm² de surface de puits).
   REMARQUE : Au fur et à mesure que les cultures se développent pendant l’induction NC, les cellules peuvent se détacher de la monocouche sous-jacente. Évitez la perte excessive de cellules en retirant délicatement les vieux milieux et en ajoutant des milieux frais sur le côté du puits.
3. Le jour 4, nourrir à nouveau les cellules avec du milieu B (200 μL de milieu par cm² de surface de puits).
4. Le 6e jour, remplacer le milieu B par le milieu C contenant 10 μM de SB431542, 1,5 μM CHIR99021 et 1 μM d’acide rétinoïque (400 μL de milieu par cm² de surface du puits).
5. Les jours 8 et 10, nourrissez comme le jour 6.

5. Formation du sphéroïde ENC

REMARQUE : Cette étape est représentée schématiquement à la figure 1B.

1. Le 12e jour, aspirer doucement le milieu C et laver les cellules avec 100 μL de PBS par cm² de surface de puits. Ajouter le même volume de solution de détachement cellulaire et incuber pendant 30 min à 5 % de CO₂ et 37 °C.
2. Diluer la solution de détachement cellulaire en ajoutant le même volume de milieu NCC contenant 10 ng/mL de FGF2, 3 μM de CHIR99021, 10 μL/mL de supplément de N2, 20 μL/mL de supplément de B27, 10 μL/mL de supplément de L-glutamine et 10 μL/mL DE MEM NEAA. À l’aide d’une pipette sérologique, prélever la suspension unicellulaire et l’ajouter dans un tube conique de 15 ml.
3. Faites tourner les cellules (2 min, 290 x g, 20-25 °C) et jetez soigneusement le surnageant.
4. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 ml, ajoutez 12 ml (pour une plaque complète de 6 puits) de milieu NCC et remettez complètement les cellules en suspension en pipetant mécaniquement de haut en bas 1 à 2 fois. Transférez la suspension cellulaire sur une plaque de fixation ultra-basse.
   REMARQUE : Environ 10^cm2 de cellules monocouches ENC sont remises en suspension dans 2 mL de milieu NCC et transférés dans un puits d’une plaque de fixation à très faible épaisseur. Cela équivaut à une plaque d’induction NC complète à 6 puits transférée dans une plaque de fixation ultra-basse à 6 puits complète.
5. Le 14e jour, faites tourner doucement les assiettes jusqu’à ce que de petits sphéroïdes soient rassemblés au centre de chaque puits. À l’aide d’une micropipette P1000 et dans un mouvement circulaire lent, aspirez le milieu NCC usagé sur la circonférence de chaque puits. Essayez d’éviter d’enlever les sphéroïdes flottants.
6. Alimentez les cellules avec le volume d’origine de milieu NCC.

6. Induction EN

REMARQUE : Cette étape est représentée schématiquement à la figure 1B.

1. Le 15e jour, appliquez la même technique que celle utilisée le 14e jour pour retirer délicatement le milieu et laver les sphéroïdes avec du PBS. Retirez autant de PBS que possible en évitant les sphéroïdes.
2. Ajouter une solution de décollement cellulaire (100 μL par^cm2 de surface de puits) et dissocier les sphéroïdes en cellules uniques en les incubant pendant 30 min à 5 % de CO₂ et 37 °C.
3. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL, ajouter un volume égal de milieu ENC (contenant 10 ng/mL de GDNF, 100 μM d’acide ascorbique, 10 μL/mL de supplément de N2, 20 μL/mL de supplément de B27, 10 μL/mL de supplément de L-glutamine et 10 μL/mL DE MEM NEAA dans le milieu neurobasal) dans chaque puits et casser les sphéroïdes restants par 2 ou 3 cycles de pipetage mécanique. Transférez les cellules dans un tube conique de 50 ml.
   REMARQUE : Évitez les contraintes excessives et la mort cellulaire qui peuvent survenir lors d’un pipetage forcé ou de l’utilisation de pipettes avec une ouverture de pointe plus petite.
4. Faites tourner les cellules (2 min, 290 x g, 20-25 °C) et jetez soigneusement le surnageant. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 ml, ajoutez ~ 5 à 10 ml de milieu ENC et remettez complètement les cellules en suspension en pipetant vers le haut et vers le bas 1 à 2 fois.
5. Comptez la concentration de cellules viables à l’aide du bleu trypan et d’une méthode de comptage cellulaire telle qu’un hémocytomètre.
   ATTENTION : Le bleu trypan est un cancérogène suspecté. Manipulez avec soin, éliminez de manière appropriée.
6. Ajouter un volume suffisant de milieu ENC visant à plaquer environ 300 000 à 400 000 cellules viables par cm² de surface à une densité d’environ ~ 1 000 000 de cellules par ml. Aspirer la solution FN/laminine/PBS des puits de la plaque.
   REMARQUE : Choisissez le format de la plaque en fonction des tests prévus pour les cultures EN, car cette étape marque l’étape finale de replacage du protocole. Les progéniteurs des neurones entériques peuvent être congelés au 15e jour. Après avoir dissocié les sphères avec une solution de détachement cellulaire, remettre les progéniteurs en suspension à environ 5 x 10⁶ cellules/mL dans un milieu de congélation tel que 10% DMSO ou Stem-cellbanker. Si nécessaire, décongeler dans un milieu ENC chaud avec un inhibiteur de ROCK Y-27632 de 5 μM. Cellules de plaque dans le format de plaque souhaité. Remplacez le support par de l’ENC frais après quelques heures.
7. Ajoutez délicatement les cellules dans les puits recouverts de PO/FN/laminine. Évitez que les bulles ne se coincent sous la suspension cellulaire, empêchant la fixation des cellules au revêtement PO/FN/laminine, en particulier lors de l’utilisation de plaques de plus petite taille de puits telles que des plaques de 384 puits. Cela pourrait conduire à la mort cellulaire.
8. Nourrir les cellules tous les deux jours avec un milieu ENC (200 μL par cm² de surface de puits) jusqu’au jour 30-40, après quoi réduire la fréquence d’alimentation (à une ou deux fois par semaine) mais doubler le volume d’alimentation (à 400 μL de milieu par cm² de surface de puits).
   REMARQUE : Ceci est important car un retrait et un ajout excessifs de milieux pourraient faciliter le détachement de la culture neuronale de la surface des puits. Pour prévenir prospectivement le détachement, en particulier pour les cultures à long terme, compléter la CEN avec du FN (2 μg/mL) et de la laminine (2 μg/mL) une fois par semaine.

Résultats

Ce protocole fournit une méthode pour dériver la crête neurale entérique et les neurones entériques des hPSC en utilisant des conditions de culture chimiquement définies (Figure 1A-B). La génération de neurones de haute qualité dépend d’une étape efficace d’induction de la crête neurale entérique. Cela peut être évalué visuellement en vérifiant la morphologie des sphères flottantes qui doivent être rondes avec des surfaces lisses d’une taille d’env...

Discussion

Le protocole de différenciation décrit ici fournit une méthode in vitro robuste pour obtenir des neurones entériques à partir de hPSC dans un délai de 30 à 40 jours (Figure 1E) et des cellules gliales entériques exprimant la protéine acide fibrillaire gliale, GFAP et SOX10 dans des cultures plus anciennes (> jour 55)13,14,19,22. Ces neurones et ce...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A5960
B27 supplement (serum free, minus vitamin A)	Gibco	12587-010
Basement membrane matrix, Geltrex	Gibco	A14133-2
BMP4	R&D systems	314-BP
Cell culture centrifuge	Eppendorf, model no. 5810R	02262501
Cell detachment solution, Accutase	Stemcell Technologies	07920
CHIR99021	Tocris	4423
Conical tubes	USA scientific	1475-0511, 1500-1211
Differentiation base medium, Essential 6	Life Technologies	A1516401
DMEM/F-12 no glutamine	Life Technologies	21331020
EDTA	Corning	MT-46034CI
Feeder-free hPSC maintenance medium, Essential 8 Flex Medium Kit	Life Technologies	A2858501
FGF2	R&D systems	233-FB/CF
Fibronectin	Corning	356008
GDNF	Peprotech	450-10
Hemocytometer	Hausser Scientific	1475
Human pluripotent stem cells, H9 ESC	WiCell	RRID: CVCL_1240
Incubator with controlled humidity, temperature and CO2	Thermo Fisher Scientific	Herralcell 150i
Inverted microscope	Thermo Fisher Scientific	EVOS FL
Laminar flow hood	Thermo Fisher Scientific	1300 series class II, type A2
Laminin	Cultrex	3400-010
L-glutamine supplement, Glutagro	Corning	25-015-CI
MEM NEAAs	Corning	25-025-CI
Multiwell plates, Falcon	BD	353934, 353075
N-2 Supplement	CTS	A1370701
Neurobasal Medium	Life Technologies	21103049
PBS (Ca and Mg free)	Life Technologies	10010023
Pipette filler	Eppendorf	Z768715-1EA
Pipette tips	USA scientific	1111-2830
Pipettes	Fisherbrand	13-678-11E, 13-678-11F
PO	Sigma-Aldrich	P3655
polymer coverslip bottom imaging plates, ibidi	ibidi	81156
RA	Sigma-Aldrich	R2625
SB431542	R&D systems	1614
Trypan blue stain, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250-061
Ultra-low attachment plates	Fisher Scientific	07-200-601
Y-27632 dihydrochloride	R&D systems	1254