Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
İnsan pluripotent kök hücrelerinden (hPSC) enterik sinir sistemi (ENS) soylarının türetilmesi, ENS gelişimini ve hastalığını incelemek ve rejeneratif tıpta kullanmak için ölçeklenebilir bir hücre kaynağı sağlar. Burada, kimyasal olarak tanımlanmış kültür koşulları kullanılarak hPSC'lerden enterik nöronlar türetmek için ayrıntılı bir in vitro protokol sunulmaktadır.
İnsan enterik sinir sistemi, ENS, dikkate değer nörotransmitter çeşitliliğine sahip geniş bir glial ve nöronal hücre tipleri ağıdır. ENS bağırsak hareketliliğini, enzim sekresyonunu ve besin emilimini kontrol eder ve bağışıklık sistemi ve bağırsak mikrobiyomu ile etkileşime girer. Sonuç olarak, ENS'nin gelişimsel ve edinilmiş kusurları birçok insan hastalığından sorumludur ve Parkinson hastalığının semptomlarına katkıda bulunabilir. Hayvan model sistemlerindeki sınırlamalar ve birincil dokuya erişim, insan ENS çalışmalarında önemli deneysel zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Burada, tanımlanmış kültür koşulları kullanılarak insan pluripotent kök hücrelerinden (hPSC) ENS soylarının etkili in vitro türetilmesi için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Protokolümüz, 15 gün içinde hPSC'lerin enterik nöral krest hücrelerine yönlendirilmiş farklılaşması ile başlar ve 30 gün içinde fonksiyonel enterik nöronların çeşitli alt tiplerini verir. Bu platform, gelişimsel çalışmalar, hastalık modellemesi, ilaç keşfi ve rejeneratif uygulamalar için ölçeklenebilir bir kaynak sağlar.
Enterik sinir sistemi (ENS), periferik sinir sisteminin en büyük bileşenidir. ENS, gastrointestinal sistem içinde yer alan ve bağırsağın neredeyse tüm fonksiyonlarını kontrol eden 400 milyondan fazla nöron içerir1. ENS gelişimi ve fonksiyonu ile enterik nöropatilerdeki kusurlarının moleküler olarak anlaşılması, güvenilir ve otantik bir enterik nöron kaynağına erişim gerektirir. İnsan primer dokusuna erişim sınırlıdır ve hayvan modelleri birçok enterik nöropatide anahtar hastalık fenotiplerini özetlemekte başarısız olmaktadır. İnsan pluripotent kök hücre (hPSC) teknolojisinin, özellikle birincil kaynaklardanizole edilmesi....
1. Medya hazırlığı
NOT: Protokol boyunca belirtilen konsantrasyonlar, medya bileşenlerinin nihai konsantrasyonlarıdır. Tüm ortamları steril koşullar altında laminer akış başlığında hazırlayın ve karanlıkta 4 °C'de saklayın. 2 hafta içinde kullanın.
Bu protokol, kimyasal olarak tanımlanmış kültür koşulları kullanılarak hPSC'lerden enterik nöral krest ve enterik nöronlar türetmek için bir yöntem sağlar (Şekil 1A-B). Yüksek kaliteli nöronların üretilmesi, verimli bir enterik nöral krest indüksiyon adımına bağlıdır. Bu, Şekil 1C'de görüldüğü gibi yaklaşık 0,1 - 0,4 mm boyutunda pürüzsüz yüzeylerle yuvarlak görünmesi gereken serbest yüzen kürelerin morf.......
Burada tarif edilen farklılaşma protokolü, 30-40 gün içinde hPSC'lerden enterik nöronlar elde etmek için sağlam bir in vitro yöntem sağlar (Şekil 1E) ve daha eski kültürlerde glial fibriler asidik protein, GFAP ve SOX10 eksprese eden enterik glia (> gün 55)13,14,19,22. Bu nöronlar ve glia, hPSC'lerin vagal ve enterik nöral krest hücrelerin.......
Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.
Çalışma, UCSF Çığır Açan Biyomedikal Araştırma Programı ve Sandler Vakfı, March of Dimes hibe no. 1-FY18-394 ve 1DP2NS116769-01, NIH Direktörünün Yeni Yenilikçi Ödülü (DP2NS116769) F.F.'ye ve Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü (R01DK121169) F.F.'ye, HM, Larry L. Hillblom Vakfı doktora sonrası bursu tarafından desteklenmektedir. NIH T32-DK007418 bursu ve UCSF Çığır Açan Biyomedikal Araştırma Programı bağımsız doktora sonrası bursu.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
B27 supplement (serum free, minus vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
Basement membrane matrix, Geltrex | Gibco | A14133-2 | |
BMP4 | R&D systems | 314-BP | |
Cell culture centrifuge | Eppendorf, model no. 5810R | 02262501 | |
Cell detachment solution, Accutase | Stemcell Technologies | 07920 | |
CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
Conical tubes | USA scientific | 1475-0511, 1500-1211 | |
Differentiation base medium, Essential 6 | Life Technologies | A1516401 | |
DMEM/F-12 no glutamine | Life Technologies | 21331020 | |
EDTA | Corning | MT-46034CI | |
Feeder-free hPSC maintenance medium, Essential 8 Flex Medium Kit | Life Technologies | A2858501 | |
FGF2 | R&D systems | 233-FB/CF | |
Fibronectin | Corning | 356008 | |
GDNF | Peprotech | 450-10 | |
Hemocytometer | Hausser Scientific | 1475 | |
Human pluripotent stem cells, H9 ESC | WiCell | RRID: CVCL_1240 | |
Incubator with controlled humidity, temperature and CO2 | Thermo Fisher Scientific | Herralcell 150i | |
Inverted microscope | Thermo Fisher Scientific | EVOS FL | |
Laminar flow hood | Thermo Fisher Scientific | 1300 series class II, type A2 | |
Laminin | Cultrex | 3400-010 | |
L-glutamine supplement, Glutagro | Corning | 25-015-CI | |
MEM NEAAs | Corning | 25-025-CI | |
Multiwell plates, Falcon | BD | 353934, 353075 | |
N-2 Supplement | CTS | A1370701 | |
Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103049 | |
PBS (Ca and Mg free) | Life Technologies | 10010023 | |
Pipette filler | Eppendorf | Z768715-1EA | |
Pipette tips | USA scientific | 1111-2830 | |
Pipettes | Fisherbrand | 13-678-11E, 13-678-11F | |
PO | Sigma-Aldrich | P3655 | |
polymer coverslip bottom imaging plates, ibidi | ibidi | 81156 | |
RA | Sigma-Aldrich | R2625 | |
SB431542 | R&D systems | 1614 | |
Trypan blue stain, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
Ultra-low attachment plates | Fisher Scientific | 07-200-601 | |
Y-27632 dihydrochloride | R&D systems | 1254 |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiDaha Fazla Makale Keşfet
This article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır