Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Özet

İnsan pluripotent kök hücrelerinden (hPSC) enterik sinir sistemi (ENS) soylarının türetilmesi, ENS gelişimini ve hastalığını incelemek ve rejeneratif tıpta kullanmak için ölçeklenebilir bir hücre kaynağı sağlar. Burada, kimyasal olarak tanımlanmış kültür koşulları kullanılarak hPSC'lerden enterik nöronlar türetmek için ayrıntılı bir in vitro protokol sunulmaktadır.

Özet

İnsan enterik sinir sistemi, ENS, dikkate değer nörotransmitter çeşitliliğine sahip geniş bir glial ve nöronal hücre tipleri ağıdır. ENS bağırsak hareketliliğini, enzim sekresyonunu ve besin emilimini kontrol eder ve bağışıklık sistemi ve bağırsak mikrobiyomu ile etkileşime girer. Sonuç olarak, ENS'nin gelişimsel ve edinilmiş kusurları birçok insan hastalığından sorumludur ve Parkinson hastalığının semptomlarına katkıda bulunabilir. Hayvan model sistemlerindeki sınırlamalar ve birincil dokuya erişim, insan ENS çalışmalarında önemli deneysel zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Burada, tanımlanmış kültür koşulları kullanılarak insan pluripotent kök hücrelerinden (hPSC) ENS soylarının etkili in vitro türetilmesi için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Protokolümüz, 15 gün içinde hPSC'lerin enterik nöral krest hücrelerine yönlendirilmiş farklılaşması ile başlar ve 30 gün içinde fonksiyonel enterik nöronların çeşitli alt tiplerini verir. Bu platform, gelişimsel çalışmalar, hastalık modellemesi, ilaç keşfi ve rejeneratif uygulamalar için ölçeklenebilir bir kaynak sağlar.

Giriş

Enterik sinir sistemi (ENS), periferik sinir sisteminin en büyük bileşenidir. ENS, gastrointestinal sistem içinde yer alan ve bağırsağın neredeyse tüm fonksiyonlarını kontrol eden 400 milyondan fazla nöron içerir1. ENS gelişimi ve fonksiyonu ile enterik nöropatilerdeki kusurlarının moleküler olarak anlaşılması, güvenilir ve otantik bir enterik nöron kaynağına erişim gerektirir. İnsan primer dokusuna erişim sınırlıdır ve hayvan modelleri birçok enterik nöropatide anahtar hastalık fenotiplerini özetlemekte başarısız olmaktadır. İnsan pluripotent kök hücre (hPSC) teknolojisinin, özellikle birincil kaynaklardanizole edilmesi....

Protokol

1. Medya hazırlığı

NOT: Protokol boyunca belirtilen konsantrasyonlar, medya bileşenlerinin nihai konsantrasyonlarıdır. Tüm ortamları steril koşullar altında laminer akış başlığında hazırlayın ve karanlıkta 4 °C'de saklayın. 2 hafta içinde kullanın.

  1. hPSC bakım ortamı: Besleyici içermeyen hPSC bakım ortamı takviyesini (20 μL/mL) temel ortamıyla karıştırın.
  2. Orta A: Farklılaşma baz ortamına kemik morfogenetik protein 4 (BMP4; 1 ng / mL), SB431542 (10 μM) ve CHIR99021 (600 nM) ekleyin.
  3. Orta B: Farklılaşma temel ortamına SB431542 (10 μM) ve CHIR99021 (1,5 μM) ekleyin.
  4. Orta C: Farklılaşma te....

Temsili Sonuçlar

Bu protokol, kimyasal olarak tanımlanmış kültür koşulları kullanılarak hPSC'lerden enterik nöral krest ve enterik nöronlar türetmek için bir yöntem sağlar (Şekil 1A-B). Yüksek kaliteli nöronların üretilmesi, verimli bir enterik nöral krest indüksiyon adımına bağlıdır. Bu, Şekil 1C'de görüldüğü gibi yaklaşık 0,1 - 0,4 mm boyutunda pürüzsüz yüzeylerle yuvarlak görünmesi gereken serbest yüzen kürelerin morf.......

Tartışmalar

Burada tarif edilen farklılaşma protokolü, 30-40 gün içinde hPSC'lerden enterik nöronlar elde etmek için sağlam bir in vitro yöntem sağlar (Şekil 1E) ve daha eski kültürlerde glial fibriler asidik protein, GFAP ve SOX10 eksprese eden enterik glia (> gün 55)13,14,19,22. Bu nöronlar ve glia, hPSC'lerin vagal ve enterik nöral krest hücrelerin.......

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Çalışma, UCSF Çığır Açan Biyomedikal Araştırma Programı ve Sandler Vakfı, March of Dimes hibe no. 1-FY18-394 ve 1DP2NS116769-01, NIH Direktörünün Yeni Yenilikçi Ödülü (DP2NS116769) F.F.'ye ve Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü (R01DK121169) F.F.'ye, HM, Larry L. Hillblom Vakfı doktora sonrası bursu tarafından desteklenmektedir. NIH T32-DK007418 bursu ve UCSF Çığır Açan Biyomedikal Araştırma Programı bağımsız doktora sonrası bursu.

....

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Ascorbic acidSigma-AldrichA5960
B27 supplement (serum free, minus vitamin A)Gibco12587-010
Basement membrane matrix, GeltrexGibcoA14133-2
BMP4R&D systems314-BP
Cell culture centrifugeEppendorf, model no. 5810R02262501
Cell detachment solution, AccutaseStemcell Technologies07920
CHIR99021Tocris4423
Conical tubesUSA scientific1475-0511, 1500-1211
Differentiation base medium, Essential 6Life TechnologiesA1516401
DMEM/F-12 no glutamineLife Technologies21331020
EDTACorningMT-46034CI
Feeder-free hPSC maintenance medium, Essential 8 Flex Medium KitLife TechnologiesA2858501
FGF2R&D systems233-FB/CF
FibronectinCorning356008
GDNFPeprotech450-10
HemocytometerHausser Scientific1475
Human pluripotent stem cells, H9 ESCWiCellRRID: CVCL_1240
Incubator with controlled humidity, temperature and CO2Thermo Fisher ScientificHerralcell 150i
Inverted microscopeThermo Fisher ScientificEVOS FL
Laminar flow hoodThermo Fisher Scientific1300 series class II, type A2
LamininCultrex3400-010
L-glutamine supplement, GlutagroCorning25-015-CI
MEM NEAAsCorning25-025-CI
Multiwell plates, FalconBD353934, 353075
N-2 SupplementCTSA1370701
Neurobasal MediumLife Technologies21103049
PBS (Ca and Mg free)Life Technologies10010023
Pipette fillerEppendorfZ768715-1EA
Pipette tipsUSA scientific1111-2830
PipettesFisherbrand13-678-11E, 13-678-11F
POSigma-AldrichP3655
polymer coverslip bottom imaging plates, ibidiibidi81156
RASigma-AldrichR2625
SB431542R&D systems1614
Trypan blue stain, 0.4%Thermo Fisher Scientific15250-061
Ultra-low attachment platesFisher Scientific07-200-601
Y-27632 dihydrochlorideR&D systems1254

Referanslar

  1. Gershon, M. D. The enteric nervous system: a second brain. Hosp Pract. 34 (7), 35-38 (1999).
  2. Haggarty, S. J., Silva, M. C., Cross, A., Brandon, N. J., Perlis, R. H. Advancing drug discovery for neuropsychiatric dis....

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

This article has been published

Video Coming Soon