השראת שבץ איסכמי חריף בעכברים באמצעות טכניקת חסימת העורק האמצעי הדיסטלי

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביסוס מודל חסימת עורק מוחי אמצעי דיסטלי (dMCAO) באמצעות אלקטרוקואגולציה טרנס-גולגולתית בעכברי C57BL/6J ומעריכים את ההתנהגות הנוירולוגית והתכונות ההיסטופתולוגיות שלאחר מכן.

Abstract

שבץ איסכמי נותר הגורם העיקרי לתמותה ולפגיעה תפקודית בקרב האוכלוסיות הבוגרות בעולם. רק מיעוט מחולי שבץ איסכמי זכאים לקבל טרומבוליזה תוך וסקולרית או טיפול תרומבקטומיה מכנית בחלון הזמן האופטימלי. בקרב אותם מחלימים משבץ מוחי, כשני שלישים סובלים מהפרעות נוירולוגיות לאורך תקופה ממושכת. ביסוס מודל שבץ איסכמי ניסיוני יציב וניתן לחזרה הוא משמעותי ביותר להמשך חקירת המנגנונים הפתופיזיולוגיים ופיתוח אסטרטגיות טיפוליות יעילות לשבץ איסכמי. עורק המוח האמצעי (MCA) מייצג את המיקום הדומיננטי של שבץ איסכמי בבני אדם, כאשר חסימת MCA משמשת כמודל הנפוץ של איסכמיה מוחית מוקדית. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את המתודולוגיה של הקמת מודל חסימת MCA דיסטלי (dMCAO) באמצעות אלקטרוקואגולציה טרנס-גולגולתית בעכברי C57BL/6. מכיוון שאתר החסימה ממוקם בענף קליפת המוח של MCA, מודל זה מייצר נגע אוטם בינוני המוגבל לקליפת המוח. אפיון נוירולוגי התנהגותי והיסטופתולוגי הדגים תפקוד מוטורי נראה לעין, ניוון נוירונים והפעלה בולטת של מיקרוגליה ואסטרוציטים במודל זה. לפיכך, מודל עכבר dMCAO זה מספק כלי רב ערך לחקר איסכמיה וערך של פופולריזציה.

Introduction

שבץ מוחי הוא מחלה מוחית חריפה נפוצה המאופיינת בשכיחות גבוהה של נכות ותמותה¹. מתוך כלל מקרי השבץ, כמעט 80% שייכים לשבץ איסכמי². עד כה, פקקת תוך ורידית נותרה אחת ממספר מצומצם של גישות פרודוקטיביות לטיפול בשבץ איסכמי חריף. עם זאת, האפקטיביות של טיפול thrombolytic מוגבל על ידי חלון הזמן האפקטיבי הצר ואת התרחשות של טרנספורמציה hemorrhagic³. בשלב השיקום ארוך הטווח לאחר שבץ איסכמי, מספר לא מבוטל של חולים צפויים לחוות הפרעות נוירולוגיות עמידות⁴. חקירה נוספת נדרשת בדחיפות כדי לפענח את המנגנונים הפתופיזיולוגיים הבסיסיים של שבץ איסכמי, כמו גם להקל על פיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות הממוקדות שבץ איסכמי. הקמתו של מודל מהימן וניתן לשכפול של שבץ איסכמי היא חיונית למחקר בסיסי, כמו גם למחקר תרגומי מאוחר יותר בתחום השבץ האיסכמי.

בשנת 1981, Tamura et al. פיתחו מודל איסכמיה מוחית מוקדית על ידי שימוש באלקטרוקואגולציה טרנס-גולגולתית באתר הפרוקסימלי של עורק המוח האמצעי (MCA)⁵. מאז, חוקרים רבים השתמשו במתודולוגיות שונות כגון קשירה, דחיסה או חיתוך כדי לגרום לחסימת MCA דיסטלית (dMCAO) לקביעת מודלים חולפים או קבועים של שבץ איסכמי ^6,7,8. בהשוואה למודל חוט הלהט, מודל dMCAO מציג יתרונות בולטים כגון גודל אוטם קטן יותר ושיעור הישרדות גבוה יותר, מה שהופך אותו מתאים יותר לחקר התאוששות תפקודית ארוכת טווח לאחר שבץ איסכמי⁹. בנוסף, מודל dMCAO מדגים שיעור הישרדות גבוה יותר במכרסמים מזדקנים בהשוואה למודל חוט הלהט, מה שהופך אותו לכלי יתרון לחקר שבץ איסכמי במודלים של קשישים ובעלי חיים נלווים¹⁰. מודל שבץ פוטוטרומבוטי (PT) הוכח כבעל מאפיינים של פחות פולשניות כירורגית ושיעור תמותה נמוך משמעותית. עם זאת, מודל PT מציג רמה גבוהה יותר של נמק תאי ובצקת רקמות בהשוואה למודל dMCAO, מה שמוביל להיעדר מחזור בטחונות¹¹. יתר על כן, ראוי לציין כי הנגעים האיסכמיים שנצפו במודל PT נובעים בעיקר מחסימת כלי דם, השונה באופן מהותי מהאיסכמיה המוחית הנגרמת על ידי תסחיף כלי דם גדולים במודל dMCAO¹².

במאמר זה, אנו מציגים את המתודולוגיה להשראת מודל dMCAO מורין על ידי קרישת MCA דיסטלי באמצעות קרניוטומיה של חלון עצם קטן. בנוסף, ערכנו בדיקות היסטולוגיות והערכות התנהגותיות כדי לאפיין באופן מקיף את תוצאות העלבונות והשבץ האיסכמי במודל ניסויי זה. אנו שואפים להכיר לחוקרים מודל זה ולהקל על חקירות נוספות של המנגנונים הפתולוגיים של שבץ איסכמי.

Protocol

פרוטוקול הניסוי אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת ג'יאנגהאן ונערך בהתאם להנחיות אתיות של חיות ניסוי שהונפקו על ידי המרכז לבקרת מחלות של סין. עכברי C57BL/6J זכרים בוגרים, בני 10 שבועות, משוקללים 24-26 גרם, שימשו בפרוטוקול זה. כל העכברים שוכנו בסביבה מבוקרת של 12 שעות במחזור אור/חושך עם מזון ומים עד ליביטום.

1. הכנה טרום ניתוחית

הערה: המכשירים והציוד העיקריים הדרושים לפרוטוקול זה מוצגים באיור 1.

1. לפני ההליך, לעקר את כלי הניתוח על ידי autoclaving.
2. מתן meloxicam תת עורית במינון של 5 מ"ג / ק"ג עבור שיכוך כאבים 60 דקות לפני הניתוח.
3. מרדימים את העכבר עם 5% isoflurane בתא אינדוקציה.
4. נגבו את לוח ניתוח החימום באתנול 75% והפעילו את מתג החימום כשהטמפרטורה מוגדרת ל-37°C. לאחר מכן, מקם את העכבר במצב צדדי שמאלי על הלוח, כאשר הראש ממוקם הרחק מהמנתח והזנב פונה לכיוון המנתח.
5. חבר מסכה לפני העכבר המספקת אספקה קבועה של 2% איזופלורן ו-0.3 ליטר/דקה חמצן להרדמה תחזוקתית. החל את משחת העין על הקרנית כדי להגן עליהם מפני ייבוש במהלך ההליך.
6. לגלח את הפרווה מהמסלול השמאלי לתעלת האוזן השמאלית עם מכונת גילוח. השתמש קרמים depilatory כדי להסיר את הפרווה שנותרה לעיקור.
7. הכינו את אזור הניתוח על ידי מריחת חומר חיטוי פובידון-יוד ואתנול 75% שלוש פעמים.

2. דגם MCAO דיסטלי

1. בדוק אם העכבר מורדם עמוקות על ידי הערכת הרפלקסים של צביטת הבוהן.
2. בצע חתך אנכי בין המסלול השמאלי לתעלת האוזן השמאלית באמצעות להב אזמל סטרילי.
3. משכו את הרקמה הרכה של העור עם retractors וחשפו את השריר הרקתי.
4. השתמש microforceps ישר כדי להפריד את המקטעים apical ו dorsal של השריר הרקתי מן הגולגולת.
5. זהו את הביפורקציה של ה-MCA, אשר לובשת צורה "Y" מתחת לעצם הרקתית עם הטיה לכיוון בסיס הגולגולת (איור 2A).
   הערה: אם הביפורקציה של MCA אינה נראית לעין (עקב וריאציה אנטומית נורמלית), ודא את כלי השיט הרוסטרלי ביותר.
6. השתמש מקדח גולגולת חשמלי כדי לדלל את הגולגולת כדי ליצור חלון עצם (4 מ"מ קוטר) עד דורה מאטר, עם מרקם שקוף, הופך גלוי.
   הערה: יש להוסיף לסירוגין טיפות של מי מלח רגילים לגולגולת כדי למנוע התחממות יתר במהלך תהליך זה.
7. הסר את הדורה מאטר מעל העורק עם מלקחיים מיקרו מעוקלים כדי לחשוף את ענף MCA.
8. כוונו את העורק ל-7W. קרשו את העורק באמצעות מלקחיים חשמליים בקרישה באתרים של פרוקסימלי ודיסטלי לביפורקציה של MCA (איור 2A). כאשר הביפורקציה אינה נראית לעין עקב שונות אנטומית, יש לבצע את הקרישה על ענף MCA שזוהה במדויק (כאמור לעיל) בשני מקומות נפרדים במרחק של כ-1 מ"מ זה מזה¹³.
9. עקוב אחר זרימת הדם של ענף קליפת המוח השמאלי MCA באמצעות מד זרימת דם בלייזר.
   הערה: עכברים המציגים ירידה בזרימת הדם של פחות מ -40% מהערך הבסיסי לאחר אלקטרוקואגולציה לא נכללו במחקר.
10. תפרו את השריר והעור בנפרד באמצעות 5-0 תפרים של חומצה פוליגליקולית. החל דיקלופנק נתרן ג'ל משחה mupirocin על חתך העור באמצעות צמר גפן סטרילי.
11. הנח את העכבר בתא שחזור. עקוב אחר כל העכברים עד שהם ערים לחלוטין. לספק meloxicam (5 מ"ג / ק"ג, SC) עבור שיכוך כאבים כל 24 שעות עד 72 שעות.

3. מבצע דאם

1. לשחזר את אותו הליך כמו אלה שהוזכרו לעיל, למעט תהליך של קרישת עורק.

4. מבחנים התנהגותיים

הערה: לפני dMCAO, העכברים עברו אימון התנהגותי פעמיים ביום במשך 3 ימים. ביום^השלישי לאחר dMCAO, העבירו את העכברים לחדר הבדיקות ההתנהגותיות להסתגלות סביבתית של שעתיים לפני הבדיקה.

1. מבחן חוזק אחיזה¹⁴
   הערה: מד חוזק האחיזה כולל מד מאמץ דחיפה-משיכה ומוט אופקי ממתכת.
   1. אחזו בבסיס זנב העכבר. הורידו בהדרגה את העכבר לכיוון מוט האחיזה המתכתי עד שהוא אוחז במוט האופקי עם שתי הכפות הקדמיות (איור 2B).
   2. משוך את העכבר לאחור במהירות קבועה של כ-2 ס"מ לשנייה ושמור על גופו אופקי.
   3. רשום את כוח השיא בגרמים (g) כאשר העכבר משחרר את כפותיו הקדמיות מהמוט.
2. מבחן קוטב¹⁵
   1. הניחו את העכבר על ראש מוט עץ אנכי (50 ס"מ גובה, 1 ס"מ קוטר) כשראשו פונה כלפי מעלה, ואפשרו לו לטפס במורד המוט (איור 2B).
   2. רשום את הזמן שלוקח לעכבר להסתובב (סיבוב T) ואת הזמן הכולל לטפס במורד המוט (T-total) עם זמן חיתוך של 60 שניות.
3. בדיקת הסרת סרט הדבקה¹⁶
   1. החזיקו את העכבר וחברו טלאי של סרט הדבקה (2 × 2 מ"מ) לכפה הקדמית הימנית של העכבר (איור 2B).
   2. החזירו את העכבר לכלוב הגידול ואפשרו לו לנוע בחופשיות.
   3. רשום את הזמן שלקח לעכבר להסיר דבק עם מגבלה של 60 שניות.
4. בדיקת צילינדר¹⁷
   1. הניחו את העכבר בתוך גליל זכוכית פתוח ושקוף (קוטר: 14 ס"מ; גובה: 20 ס"מ) ותיעדו את התנהגות הגישוש הספונטנית שלו בעמידה במשך 3 דקות באמצעות מצלמה (איור 2B).
      הערה: במהלך הליך הניסוי, שתי מראות הוצבו לצד הצילינדר כדי להבטיח רישום אופטימלי של תנועות הגפיים הקדמיות.
   2. נגב את הגליל עם אתנול 75% כדי למנוע שאריות של רמזי ריח לפני בדיקת העכבר הבא.
   3. הפחת את מהירות ההפעלה של הווידאו ל -1/5 מהמהירות בפועל, וספור את מספר נגיעות הקיר עם הכף הקדמית השמאלית (L) או הימנית (R) או שימוש בו זמנית בשתי הכפות הקדמיות (B). חשב את שיעור השימוש של הכף הקדמית הימנית כ- (L-R)/(L + R + B) × 100%.

5. זילוח והכנת מדגם

1. המתת חסד העכבר על ידי מנת יתר של הזרקת הצפק של pentobarbital (300 מ"ג / ק"ג). מקם את העכבר בשכיבה ולשתק את הגפיים.
2. בצע חתך קו אמצע על העור, החל מחלל אמצע הבטן ונמשך לכיוון אזור החזה העליון.
3. פתח את החזה באמצעות מספריים כירורגיים וקפל את הקסיפואיד כלפי מעלה באמצעות המוסטט. בזהירות להסיר את הריאה ואת הסרעפת כדי לחשוף את הלב.
4. הכנס את קצה מחט הזלוף לחדר השמאלי ונקב את אטריום ימין עם מספריים. לערבב את הלב עם 20 מ"ל של מלוחים נורמליים דרך החדר השמאלי.
5. ערפו את ראשו של העכבר וחתכו את הקרקפת לאורך קו האמצע שבין העיניים. חותכים את העצם לאורך שני הצדדים, החל מבסיס הגולגולת ונפתחים לארובת העין.
6. הרימו את הקלבריום ונתקו בעדינות את המוח מבסיס הגולגולת באמצעות מלקחיים.
   הערה: מוחות של מחצית מהעכברים היו נתונים לצביעה של 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride (TTC), בעוד שמוחות מהחצי השני עברו בדיקה היסטולוגית.
7. השרו את המוח בתמיסת פרפורמלדהיד 4% למשך הלילה לצורך ניתוח היסטולוגי המשך.

6. זיהוי נפח אוטם

1. הכניסו את המוח לתא הקפאה בטמפרטורה של -20°C במקרר למשך 20 דקות.
2. מקמו את המוח לתוך מטריצת המוח בקוטר 1 מ"מ וחתכו את המוח למקטעים כליליים בעובי של 2 מ"מ באמצעות להבי מיקרוטום.
3. העבירו את חלקי המוח לצלחת תרבית של 24 בארות והוסיפו 2% TTC כדי לכסות את רקמת המוח. שים את צלחת תרבית 24 בארות בתנור טמפרטורה קבועה במשך 30 דקות עם הטמפרטורה להגדיר על 37 ° C.
4. הרימו בזהירות את חלקי המוח וקיבעו אותם בתמיסת פרפורמלדהיד 4% למשך 15 דקות.
5. בצע סריקה אופטית של חלקי מוח אלה ברזולוציה של 1200 x 1200 dpi על ידי סורק.
6. מדוד את נפח אוטם המוח על ידי סיכום אזור האוטם של כל קטע (שטח של ההמיספרה הימנית פחות אזור לא נפגע של ההמיספרה השמאלית) באמצעות תוכנת תמונה J (https://imagej.net/software/imagej/index)¹⁸. חשב את אחוז נפח האוטם כנפח/נפח אוטם של ההמיספרה הימנית × 100%.

7. ניתוח צביעה היסטופתולוגי ואימונופלואורסצנטי

1. קח את דגימות המוח מתמיסת paraformaldehyde ולשטוף אותם עם מים זורמים במשך 1 שעות.
2. העבירו את דגימות המוח למכונת אוטומציה-רקמות-מייבשות. הפעל את התוכנית המוגדרת מראש להתייבשות, ויטריפיקציה וטבילת שעווה. הטמיעו את דגימות המוח המיובשות בפרפין וחתכו אותן למקטעים בעובי 5 מיקרומטר על ידי מיקרוטום.
3. צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E)
   1. מחלקים את החלקים עם קסילן 3 פעמים למשך 8 דקות כל אחד.
   2. הרטיבו את החלקים על ידי טבילה רצופה באתנול הדרגתי (100%, 95%, 90%, 80%, 70%) ומים מזוקקים למשך 5 דקות בכל פעם.
   3. מכתימים את החלקים בתמיסת המטוקסילין למשך 5 דקות.
   4. שטפו את החלקים במים מזוקקים כדי לשטוף את שאריות המטוקסילין, ולאחר מכן טבלו אותם באלכוהול חומצה הידרוכלורית 5% להבחנה של 5 שניות. שטפו את החלקים במים מזוקקים במשך 2 דקות.
   5. הכתימו את המקטעים בתמיסת אאוזין למשך 30 שניות ושטפו את עודפי נוזל הכתמים במים מזוקקים.
   6. לטבול את החלקים ב-90% אתנול, 95% אתנול, 100% אתנול וקסילן (2 פעמים) ברציפות במשך 5 דקות בכל פעם. הר את החלקים עם אמצעי הרכבה בלסם ניטרלי.
4. צביעה אימונופלואורסצנטית
   1. טווקס את החלקים עם קסילן 3 פעמים במשך 8 דקות בכל פעם.
   2. יש לייבש מחדש את המקטעים על ידי טבילה רצופה באתנול הדרגתי (100%, 95%, 90%, 80%, 70%) ומים מזוקקים למשך 5 דקות בכל פעם.
   3. מחממים את תמיסת שליפת האנטיגן ציטראט לרתיחה במיקרוגל. לטבול את החלקים בתמיסת אחזור האנטיגן. חממו מחדש את מאגר אחזור האנטיגן בהספק נמוך (20 ואט) למשך 20 דקות.
   4. כבו את המיקרוגל ותנו למאגר שליפת האנטיגן להתקרר לטמפרטורת החדר (RT).
   5. שטפו את המקטעים שלוש פעמים במי מלח חוצצים פוספט 0.1 מ"מ (PBS) במשך 5 דקות בכל פעם.
   6. דגרו על החלקים עם תמיסה חוסמת (אלבומין בסרום בקר 5%) ב- RT למשך שעה אחת כדי לחסום את הקישור הלא ספציפי של אימונוגלובולין.
   7. לדגור על החלקים עם נוגדן ארנב נגד NeuN (1: 300), נוגדן ארנב נגד Iba-1 (1: 500) ונוגדן עכבר נגד GFAP (1: 500) ב 4 מעלות צלזיוס במשך הלילה.
   8. שטפו את המקטעים שלוש פעמים עם PBS של 0.1 mM במשך 5 דקות בכל פעם.
   9. דגרו על המקטעים עם IgG מצומד נגד ארנב עז Alexa 594 (1:500) או IgG מצומד נגד עכבר Alexa 488 (1:500) למשך שעה אחת ב-RT.
   10. שטפו את החלקים עם PBS של 0.1 mM והרכיבו אותם עם אמצעי הרכבה נגד דהייה המכיל 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
   11. צלם תמונות של שלושה שדות מיקרוסקופיים (300 מיקרומטר × 300 מיקרומטר) בתוך הפנומברה האיסכמית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ב 594 ננומטר ו 488 ננומטר, בהתאמה.
   12. באמצעות תוכנת ImageJ (https://imagej.net/software/imagej/index), להעריך את צפיפות התאים המוכתמים באופן חיובי על ידי ממוצע ספירות בפנומברה איסכמית¹⁹.

תוצאות

המכשירים העיקריים שמשמשים לביצוע dMCAO הם סט המכשירים המיקרו-כירורגיים, מכשיר האידוי איזופלורן ומחולל הקרישה המיקרו-כירורגי המונופולרי שמוצג באיור 1. ההליך הניסויי של המחקר הזה מומחש באיור 2. בקצרה, נעשה שימוש בקרניוטומיה קטנה של חלון עצם כדי לחשוף את ה- MCA הד...

Discussion

בפרוטוקול הנוכחי של מודל dMCAO electrocoagulation craniotomy, ההליכים הכירורגיים מבוצעים עם פולשניות מינימלית, שבה רק חלק מהשריר הטמפורליס מופרד כדי למתן את ההשפעות השליליות על תפקוד המסטיקציה. כל העכברים התאוששו היטב לאחר ההליך, ללא מקרים נצפים של קשיי האכלה. ניתן להבחין בקלות ב-MCA בעצם הרקתית של העכבר, ו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride (TTC)	Sigma-Aldrich	108380	Dye for TTC staining
24-well culture plate	Corning (USA)	CLS3527	Vessel for TTC staining
4% paraformaldehyde	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.	G1101	Tissue fixation
5% bovine serum albumin	Wuhan BOSTER Bio Co., Ltd.	AR004	Non-specific antigen blocking
5-0 Polyglycolic acid suture	Jinhuan Medical Co., Ltd	KCR531	Material for surgery
Anesthesia machine	Midmark Corporation	VMR	Anesthetized animal
Antifade mounting medium	Beyotime Biotech	P0131	Seal for IF staining
Automation-tissue-dehydrating  machine	Leica Biosystems (Germany)	TP1020	Dehydrate tissue
Depilatory cream	Veet (France)	20220328	Material for surgery
Diclofenac sodium gel	Wuhan Ma Yinglong Pharmaceutical  Co., Ltd.	H10950214	Analgesia for animal
Drill tip (0.8 mm)	Rwd Life Science Co., Ltd.		Equipment for surgery
Eosin staining solution	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.	G1001	Dye for H&E staining
Eye ointment	Guangzhou Pharmaceutical Co., Ltd	H44023098	Material for surgery
Fluorescence microscope	Olympus (Japan)	BX51	Image acquisition
GFAP Mouse monoclonal antibody	Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA)	3670	Primary antibody for IF staining
Goat anti-mouse Alexa 488-conjugated IgG	Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA)	4408	Second antibody for IF staining
Goat anti-rabbit Alexa 594-conjugated IgG	Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA)	8889	Second antibody for IF staining
Grip strength meter	Shanghai Xinruan Information Technology Co., Ltd.	XR501	Equipment for behavioral test
Hematoxylin staining solution	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.	G1004	Dye for H&E staining
Iba1 Rabbit monoclonal antibody	Abcam	ab178846	Primary antibody for IF staining
Isoflurane	Rwd Life Science Co., Ltd.	R510-22-10	Anesthetized animal
Laser doppler blood flow meter	Moor Instruments (UK)	moorVMS	Blood flow monitoring
Meloxicam	Boehringer-Ingelheim	J20160020	Analgesia for animal
Microdrill	Rwd Life Science Co., Ltd.	78001	Equipment for surgery
Microsurgical instruments set	Rwd Life Science Co., Ltd.	SP0009-R	Equipment for surgery
Microtome	Thermo Fisher Scientific (USA)	HM325	Tissue section production
Microtome blade	Leica Biosystems (Germany)	819	Tissue section production
Monopolar electrocoagulation generator	Spring Scenery Medical Instrument Co., Ltd.	CZ0001	Equipment for surgery
Mupirocin ointment	Tianjin Smith Kline & French Laboratories Ltd.	H10930064	Anti-infection for animal
NeuN Rabbit monoclonal antibody	Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA)	24307	Primary antibody for IF staining
Neutral balsam	Absin Bioscience	abs9177	Seal for H&E staining
Paraffin embedding center	Thermo Fisher Scientific (USA)	EC 350	Produce paraffin blocks
Pentobarbital sodium	Sigma-Aldrich	P3761	Euthanized animal
Phosphate buffered saline	Shanghai Beyotime Biotech Co., Ltd	C0221A	Rinsing for tissue section
Shaver	Shenzhen Codos Electrical Appliances Co.,Ltd.	CP-9200	Equipment for surgery
Sodium citrate solution	Shanghai Beyotime Biotech Co., Ltd.	P0083	Antigen retrieval for IF staining