Distal Orta Arter Oklüzyonu Tekniği Kullanılarak Farelerde Akut İskemik İnme İndüksiyonu

Özet

Burada, C57BL/6J farelerde transkraniyal elektrokoagülasyon yoluyla distal orta serebral arter tıkanıklığı (dMCAO) modeli oluşturmak ve sonraki nörolojik davranışları ve histopatolojik özellikleri değerlendirmek için bir protokol sunuyoruz.

Özet

İskemik inme, tüm dünyada erişkin popülasyonlar arasında mortalite ve fonksiyonel bozukluğun baskın nedeni olmaya devam etmektedir. İskemik inme hastalarının sadece küçük bir kısmı en uygun zaman aralığında intravasküler tromboliz veya mekanik trombektomi tedavisi almaya uygundur. İnme geçirenler arasında, yaklaşık üçte ikisi uzun bir süre boyunca nörolojik işlev bozukluklarından muzdariptir. İskemik inme için patofizyolojik mekanizmaların daha fazla araştırılması ve etkili terapötik stratejilerin geliştirilmesi için stabil ve tekrarlanabilir bir deneysel iskemik inme modelinin oluşturulması son derece önemlidir. Orta serebral arter (MCA), insanlarda iskemik inmenin baskın lokalizasyonunu temsil eder ve MCA oklüzyonu, fokal serebral iskeminin sık kullanılan modeli olarak hizmet eder. Bu protokolde, C57BL/6 farelerde transkraniyal elektrokoagülasyon yoluyla distal MCA oklüzyonu (dMCAO) modelinin kurulması metodolojisini açıklıyoruz. Oklüzyon bölgesi MCA'nın kortikal dalında yer aldığından, bu model korteksle sınırlı orta derecede enfarktüslü bir lezyon oluşturur. Nörolojik davranışsal ve histopatolojik karakterizasyon, bu modelde görünür motor disfonksiyon, nöron dejenerasyonu ve mikroglia ve astrositlerin belirgin aktivasyonunu göstermiştir. Bu nedenle, bu dMCAO fare modeli, iskemi inmeyi ve popülerleşmenin değerini araştırmak için değerli bir araç sağlar.

Giriş

İnme, yüksek sakatlık ve mortalite insidansı ile karakterize yaygın bir akut serebrovasküler hastalıktır¹. Tüm inme vakalarının yaklaşık %80'i iskemik inme^2'ye aittir. Şimdiye kadar, intravenöz tromboliz, akut iskemik inme tedavisinde sınırlı sayıda üretken yaklaşımdan biri olmaya devam etmektedir. Bununla birlikte, trombolitik tedavinin etkinliği, dar etkili zaman penceresi ve hemorajik dönüşümün ortaya çıkması ile sınırlıdır³. İskemik inmeyi takiben uzun süreli rehabilitasyon aşamasında, önemli sayıda hastanın kalıcı nörolojik işlev bozuklukları yaşaması muhtemeldir⁴. İskemik inmenin altta yatan patofizyolojik mekanizmalarını ortaya çıkarmak ve iskemik inmeyi hedefleyen yeni terapötik stratejilerin geliştirilmesini kolaylaştırmak için acilen daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır. Güvenilir ve tekrarlanabilir bir iskemik inme modelinin oluşturulması, temel araştırmaların yanı sıra iskemik inme alanındaki müteakip translasyonel araştırmalar için çok önemlidir.

1981'de Tamura ve ark. orta serebral arterin (MCA) proksimal bölgesinde transkraniyal elektrokoagülasyon kullanarak bir fokal serebral iskemi modeli ^geliştirdi5. O zamandan beri, çok sayıda araştırmacı, geçici veya kalıcı iskemik inme modelleri oluşturmak için distal MCA oklüzyonunu (dMCAO) indüklemek için ligasyon, kompresyon veya kırpma gibi çeşitli metodolojiler kullanmıştır 6,7,8. Filament modeliyle karşılaştırıldığında, dMCAO modeli, daha küçük enfarktüs boyutu ve daha yüksek sağkalım oranı gibi dikkate değer avantajlar sergiler ve bu da onu iskemik inme^9'u takiben uzun vadeli fonksiyonel iyileşmeyi araştırmak için daha uygun hale getirir. Ek olarak, dMCAO modeli, filament modeline kıyasla yaşlı kemirgenlerde daha yüksek bir hayatta kalma oranı gösterir, bu da onu yaşlı ve komorbid hayvan modellerinde iskemik inmeyi araştırmak için avantajlı bir araç haline getirir¹⁰. Fototrombotik (PT) inme modelinin daha az cerrahi invazivlik ve önemli ölçüde düşük mortalite oranı özelliklerine sahip olduğu gösterilmiştir. Bununla birlikte, PT modeli, dMCAO modeline kıyasla daha fazla hücresel nekroz ve doku ödemi sergiler ve bu da kollateral dolaşımın olmamasına yol açar¹¹. Ayrıca, PT modelinde gözlenen iskemik lezyonların ağırlıklı olarak mikrovasküler oklüzyondan kaynaklandığı ve dMCAO model^12'deki büyük damar embolisinin neden olduğu serebral iskemiden önemli ölçüde farklı olduğu dikkat çekicidir.

Bu yazıda, küçük kemik penceresi kraniyotomi ile distal MCA'yı koagüle ederek murin dMCAO modelini indükleme metodolojisini sunuyoruz. Ek olarak, bu deneysel modelde iskemik hakaretleri ve inme sonuçlarını kapsamlı bir şekilde karakterize etmek için histolojik incelemeler ve davranışsal değerlendirmeler yaptık. Amacımız, araştırmacıları bu model hakkında bilgilendirmek ve iskemik inmenin patolojik mekanizmaları hakkında daha fazla araştırma yapılmasını kolaylaştırmaktır.

Protokol

Deney protokolü, Jianghan Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı ve Çin Hastalık Kontrol Merkezi tarafından yayınlanan Deney Hayvanları Etik Yönergelerine uygun olarak yürütüldü. Bu protokolde 10 haftalık, 24-26 g ağırlığında yetişkin erkek C57BL / 6J fareleri kullanıldı. Tüm fareler, yiyecek ve su ad libitum ile 12 saatlik aydınlık / karanlık döngüsü kontrollü bir ortam altında barındırıldı.

1. Ameliyat öncesi hazırlık

NOT: Bu protokol için gerekli olan temel aletler ve ekipmanlar Şekil 1'de gösterilmiştir.

1. İşlemden önce cerrahi aletleri otoklavlama ile sterilize edin.
2. Ameliyattan 60 dakika önce analjezi için 5 mg / kg'lık bir dozda deri altından meloksikam uygulayın.
3. Fareyi bir indüksiyon odasında% 5 izofluran ile uyuşturun.
4. Isıtma ameliyat panelini %75 etanol ile silin ve sıcaklık 37 °C'ye ayarlandığında ısıtma anahtarını etkinleştirin. Ardından, fareyi, başı cerrahtan uzağa ve kuyruğu cerraha bakacak şekilde tahta üzerinde sol yanal konuma getirin.
5. Fare yüzüne, idame anestezisi için sabit bir %2 izofluran ve 0,3 L/dk oksijen sağlayan bir maske takın. İşlem sırasında kurumasını önlemek için korneanın üzerine göz merhemi sürün.
6. Kürkü sol yörüngeden sol kulak kanalına kadar bir tıraş makinesi ile tıraş edin. Sterilizasyon için kalan kürkü çıkarmak için tüy dökücü kremler kullanın.
7. Üç kez povidon-iyot dezenfektan ve% 75 etanol uygulayarak ameliyat bölgesini hazırlayın.

2. Distal MCAO modeli

1. Ayak parmağı tutamının reflekslerini değerlendirerek farenin derin anestezi uygulanıp uygulanmadığını kontrol edin.
2. Steril bir neşter bıçağı kullanarak sol yörünge ile sol kulak kanalı arasında dikey bir kesi yapın.
3. Cildin yumuşak dokusunu ekartörlerle geri çekin ve temporal kası açığa çıkarın.
4. Temporal kasın apikal ve dorsal segmentlerini kafatasından ayırmak için düz mikroforseps kullanın.
5. Temporal kemiğin altında kafatasının tabanına doğru bir önyargı ile "Y" şeklini alan MCA'nın çatallanmasını tanımlayın (Şekil 2A).
   NOT: MCA'nın çatallanması görsel olarak fark edilemezse (anatomik olarak normal bir varyasyon nedeniyle), en rostral damarı belirleyin.
6. Yarı saydam dokusu ile dura mater görünür hale gelene kadar bir kemik penceresi (4 mm çapında) yapmak için kafatasını inceltmek için elektrikli bir kraniyal matkap kullanın.
   NOT: Bu işlem sırasında aşırı ısınmayı önlemek için kafatasına aralıklı olarak normal salin damlaları ekleyin.
7. MCA dalını ortaya çıkarmak için arterin üzerindeki dura materini kavisli mikro forseps ile çıkarın.
8. Elektrokoteriyi 7 W'a ayarlayın MCA'nın bifurkasyonunun proksimal ve distal bölgelerinde elektrikli pıhtılaşma forsepslerini kullanarak arteri pıhtılaştırın (Şekil 2A). Anatomik bir varyasyon nedeniyle çatallanma görünmediğinde, pıhtılaşmayı doğru bir şekilde tanımlanmış MCA dalı üzerinde (yukarıda belirtildiği gibi) yaklaşık 1 mm aralıklarla iki ayrı yerde^{gerçekleştirin 13}.
9. Bir lazer benekli kan akış ölçer kullanarak sol MCA kortikal dalının kan akışını izleyin.
   NOT: Elektrokoagülasyonu takiben başlangıç değerinin% 40'ından daha az kan akışı azalması gösteren fareler çalışmadan çıkarıldı.
10. 5-0 poliglikolik asit sütürler kullanarak kas ve cildi ayrı ayrı dikin. Steril bir pamuklu çubuk kullanarak cilt insizyonuna diklofenak sodyum jeli ve mupirosin merhem uygulayın.
11. Fareyi bir kurtarma odasına yerleştirin. Tüm fareleri tamamen uyanana kadar izleyin. Her 24 saatte bir 72 saate kadar analjezi için meloksikam (5 mg / kg, SC) sağlayın.

3. Sahte Operasyon

1. Arteriyel pıhtılaşma süreci hariç, yukarıda belirtilenlerle aynı prosedürü çoğaltın.

4. Davranış testleri

NOT: dMCAO'dan önce, farelere 3 gün boyunca günde iki kez davranış eğitimi verildi. dMCAO'dan sonraki 3^{. günde} , testten önce 2 saatlik bir çevresel adaptasyon için fareleri davranışsal test odasına taşıyın.

1. Kavrama gücü testi¹⁴
   NOT: Kavrama gücü ölçer, bir itme-çekme gerinim ölçer ve bir metal yatay çubuk içerir.
   1. Fare kuyruğunun tabanını kavrayın. Fareyi, her iki ön ayağıyla yatay çubuğu kavrayana kadar kademeli olarak metal tutma çubuğuna doğru indirin (Şekil 2B).
   2. Fareyi yaklaşık 2 cm/sn'lik sabit bir hızla geriye doğru çekin ve gövdesini yatay tutun.
   3. Fare ön ayaklarını çubuktan serbest bıraktığında en yüksek kuvveti gram (g) cinsinden kaydedin.
2. Kutup testi¹⁵
   1. Fareyi dikey bir ahşap direğin (50 cm yüksekliğinde, 1 cm çapında) tepesine, başı yukarı bakacak şekilde yerleştirin ve direkten aşağı inmesine izin verin (Şekil 2B).
   2. Farenin dönmesi için geçen süreyi (T dönüşü) ve direğe inmek için toplam süreyi (T toplamı) 60 saniyelik bir kesme süresiyle kaydedin.
3. Yapışkan bant çıkarma testi¹⁶
   1. Fareyi tutun ve farenin sağ ön kısmına bir parça yapışkan bant (2 × 2 mm) yapıştırın (Şekil 2B).
   2. Fareyi yetiştirme kafesine geri koyun ve serbestçe hareket etmesine izin verin.
   3. Yapıştırıcıyı çıkarmak için farenin harcadığı süreyi 60 s sınırıyla kaydedin.
4. Silindir testi¹⁷
   1. Fareyi üstü açık, şeffaf bir cam silindire (çap: 14 cm; yükseklik: 20 cm) yerleştirin ve bir kamera kullanarak 3 dakika boyunca spontan ayakta keşif davranışını kaydedin (Şekil 2B).
      NOT: Deneysel prosedür sırasında, ön ayak hareketlerinin en iyi şekilde kaydedilmesini sağlamak için silindirin yanına iki ayna yerleştirildi.
   2. Sonraki fareyi test etmeden önce kalıntı koku ipuçlarını ortadan kaldırmak için silindiri %75 etanol ile silin.
   3. Videonun oynatma hızını gerçek hızın 1 / 5'ine düşürün ve sol (L) veya sağ ön pençe ( R ) ile duvar dokunuşlarının sayısını veya her iki ön panın (B) aynı anda kullanımını sayın. Sağ ön pençenin kullanım oranını (L-R)/(L + R + B) × %100 olarak hesaplayın.

5. Perfüzyon ve numune hazırlama

1. Fareyi periton enjeksiyonu aşırı dozda pentobarbital (300 mg / kg) ile ötenazi yapın. Fareyi sırtüstü yatırın ve uzuvları hareketsiz hale getirin.
2. Ciltte orta karın boşluğundan başlayıp üst göğüs bölgesine doğru uzanan orta hat kesisi yapın.
3. Cerrahi makas kullanarak göğsü açın ve bir hemostat kullanarak ksifoidi yukarı doğru katlayın. Kalbi ortaya çıkarmak için akciğeri ve diyaframı dikkatlice çıkarın.
4. Perfüzyon iğnesinin ucunu sol ventriküle yerleştirin ve sağ atriyumu makasla delin. Sol ventrikül yoluyla kalbi 20 mL normal salin ile perfüze edin.
5. Farenin başını kesin ve kafa derisini gözler arasındaki orta hat boyunca kesin. Kafatası tabanından başlayarak göz yuvasına kadar açılan kemiği her iki taraftan kesin.
6. Kalvaryumu kaldırın ve bir forseps kullanarak beyni kafatasının tabanından nazikçe ayırın.
   NOT: Farelerin yarısının beyinleri 2,3,5-trifenil tetrazolyum klorür (TTC) boyamasına tabi tutulurken, diğer yarısının beyinleri histolojik incelemeye tabi tutuldu.
7. Takip histolojik analizi için beyinleri gece boyunca %4 paraformaldehit solüsyonuna batırın.

6. Enfarktüs hacminin tanımlanması

1. Beyni buzdolabının -20 °C'lik dondurucu bölmesine 20 dakika boyunca yerleştirin.
2. Beyni 1 mm'lik beyin matriksinin içine yerleştirin ve mikrotom bıçakları kullanarak beyni 2 mm kalınlığında koroner bölümlere ayırın.
3. Beyin bölümlerini 24 oyuklu bir kültür plakasına aktarın ve beyin dokusunu kaplamak için% 2 TTC ekleyin. 24 oyuklu kültür plakasını, sıcaklık 37 °C'ye ayarlanmış olarak 30 dakika boyunca sabit sıcaklıktaki bir fırına koyun.
4. Beyin bölümlerini dikkatlice kaldırın ve 15 dakika boyunca% 4 paraformaldehit çözeltisine sabitleyin.
5. Bu beyin bölümlerinin bir tarama cihazı ile 1200 x 1200 dpi çözünürlükte optik taramasını gerçekleştirin.
6. Görüntü J yazılımını kullanarak her bölümün enfarktüs alanını (sağ hemisferin alanı eksi sol hemisferin yaralanmamış alanı) toplayarak serebral enfarktüs hacmini ölçün (https://imagej.net/software/imagej/index)¹⁸. Enfarktüs hacmi yüzdesini, sağ hemisferin enfarktüs hacmi/hacmi × %100 olarak hesaplayın.

7. Histopatolojik ve immünofloresan boyama analizi

1. Beyin örneklerini paraformaldehit solüsyonundan alın ve 1 saat boyunca akan su ile yıkayın.
2. Beyin örneklerini otomasyon-doku-dehidrasyon makinesine aktarın. Dehidrasyon, vitrifikasyon ve balmumu daldırma için önceden ayarlanmış programı başlatın. Susuz kalmış beyin örneklerini parafine gömün ve bir mikrotom ile 5 μm kalınlığında bölümler halinde dilimleyin.
3. Hematoksilen ve eozin (H&E) boyama
   1. Bölümleri her biri 8 dakika boyunca 3 kez ksilen ile mumdan arındırın.
   2. Her seferinde 5 dakika boyunca gradyan etanol (%100, %95, %90, %80, %70) ve damıtılmış suya art arda daldırarak bölümleri yeniden sulandırın.
   3. Bölümleri hematoksilen çözeltisi ile 5 dakika boyayın.
   4. Kalan hematoksilen kalıntısını yıkamak için bölümleri damıtılmış suyla durulayın, ardından 5 saniyelik bir farklılaşma için %5 hidroklorik asit alkole batırın. Bölümleri 2 dakika damıtılmış su ile yıkayın.
   5. Bölümleri 30 saniye boyunca eozin solüsyonu ile boyayın ve fazla boyama sıvısını damıtılmış su kullanarak durulayın.
   6. Bölümleri her seferinde 5 dakika boyunca art arda %90 etanol, %95 etanol, %100 etanol ve ksilene (2 kez) daldırın. Bölümleri nötr bir balsam montaj ortamı ile monte edin.
4. İmmünofloresan boyama
   1. Bölümleri her seferinde 8 dakika boyunca 3 kez ksilen ile mumdan arındırın.
   2. Her seferinde 5 dakika boyunca art arda gradyan etanol (%100, %95, %90, %80, %70) ve damıtılmış suya batırarak bölümleri yeniden sulandırın.
   3. Sitrat antijen alma solüsyonunu mikrodalgada kaynatmak için önceden ısıtın. Bölümleri antijen alma çözeltisine daldırın. Antijen alma tamponunu düşük güçte (20 W) 20 dakika boyunca tekrar ısıtın.
   4. Mikrodalgayı kapatın ve antijen alma tamponunun oda sıcaklığına (RT) soğumasını bekleyin.
   5. Bölümleri her seferinde 5 dakika boyunca 0.1 mM fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile üç kez yıkayın.
   6. İmmünoglobulinin spesifik olmayan bağlanmasını bloke etmek için bölümleri RT'de 1 saat boyunca bir bloke edici solüsyon (% 5 sığır serum albümini) ile inkübe edin.
   7. Bölümleri tavşan anti-NeuN antikoru (1: 300), tavşan anti-Iba-1 antikoru (1: 500) ve fare anti-GFAP antikoru (1: 500) ile gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
   8. Bölümleri her seferinde 5 dakika boyunca 0.1 mM PBS ile üç kez yıkayın.
   9. Bölümleri keçi anti-tavşan Alexa 594-konjuge IgG (1:500) veya keçi anti-fare Alexa 488-konjuge IgG (1:500) ile RT'de 1 saat inkübe edin.
   10. Bölümleri 0.1 mM PBS ile yıkayın ve bunları 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) içeren bir antifade montaj ortamı ile monte edin.
   11. Sırasıyla 594 nm × 488 nm'de bir floresan mikroskop kullanarak iskemik penumbra içindeki üç mikroskobik alanın (300 μm 300 μm) görüntülerini alın.
   12. ImageJ yazılımını (https://imagej.net/software/imagej/index) kullanarak, iskemik penumbra^19'daki sayımların ortalamasını alarak pozitif boyanmış hücre yoğunluğunu tahmin edin.

Sonuçlar

DMCAO'yu gerçekleştirmek için kullanılan temel aletler, mikrocerrahi aletler seti, izofluran buharlaştırıcı ve Şekil 1'de gösterilen monopolar mikrocerrahi elektrokoagülasyon jeneratörüdür. Bu çalışmanın deneysel prosedürü Şekil 2'de gösterilmiştir. Kısacası, distal MCA'yı ortaya çıkarmak için küçük bir kemik penceresi kraniyotomisi kullanıldı ve daha sonra C57BL / 6 farelerinde kalıcı fokal serebral iskemiyi indüklemek içi...

Tartışmalar

Kraniyotomi elektrokoagülasyon dMCAO modelinin mevcut protokolünde, cerrahi prosedürler minimal invazivlik ile gerçekleştirilir, burada çiğneme fonksiyonu üzerindeki olumsuz etkileri azaltmak için temporalis kasının sadece bir kısmı ayrılır. Farelerin tümü işlemden sonra iyi bir şekilde iyileşti ve gözlemlenen herhangi bir beslenme güçlüğü vakası olmadı. MCA, farenin temporal kemiğinde kolayca ayırt edilebilir, böylece uygun kraniyotomi konumlarının hassas bir şekilde tanımlanmasını k...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride (TTC)	Sigma-Aldrich	108380	Dye for TTC staining
24-well culture plate	Corning (USA)	CLS3527	Vessel for TTC staining
4% paraformaldehyde	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.	G1101	Tissue fixation
5% bovine serum albumin	Wuhan BOSTER Bio Co., Ltd.	AR004	Non-specific antigen blocking
5-0 Polyglycolic acid suture	Jinhuan Medical Co., Ltd	KCR531	Material for surgery
Anesthesia machine	Midmark Corporation	VMR	Anesthetized animal
Antifade mounting medium	Beyotime Biotech	P0131	Seal for IF staining
Automation-tissue-dehydrating  machine	Leica Biosystems (Germany)	TP1020	Dehydrate tissue
Depilatory cream	Veet (France)	20220328	Material for surgery
Diclofenac sodium gel	Wuhan Ma Yinglong Pharmaceutical  Co., Ltd.	H10950214	Analgesia for animal
Drill tip (0.8 mm)	Rwd Life Science Co., Ltd.		Equipment for surgery
Eosin staining solution	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.	G1001	Dye for H&E staining
Eye ointment	Guangzhou Pharmaceutical Co., Ltd	H44023098	Material for surgery
Fluorescence microscope	Olympus (Japan)	BX51	Image acquisition
GFAP Mouse monoclonal antibody	Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA)	3670	Primary antibody for IF staining
Goat anti-mouse Alexa 488-conjugated IgG	Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA)	4408	Second antibody for IF staining
Goat anti-rabbit Alexa 594-conjugated IgG	Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA)	8889	Second antibody for IF staining
Grip strength meter	Shanghai Xinruan Information Technology Co., Ltd.	XR501	Equipment for behavioral test
Hematoxylin staining solution	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.	G1004	Dye for H&E staining
Iba1 Rabbit monoclonal antibody	Abcam	ab178846	Primary antibody for IF staining
Isoflurane	Rwd Life Science Co., Ltd.	R510-22-10	Anesthetized animal
Laser doppler blood flow meter	Moor Instruments (UK)	moorVMS	Blood flow monitoring
Meloxicam	Boehringer-Ingelheim	J20160020	Analgesia for animal
Microdrill	Rwd Life Science Co., Ltd.	78001	Equipment for surgery
Microsurgical instruments set	Rwd Life Science Co., Ltd.	SP0009-R	Equipment for surgery
Microtome	Thermo Fisher Scientific (USA)	HM325	Tissue section production
Microtome blade	Leica Biosystems (Germany)	819	Tissue section production
Monopolar electrocoagulation generator	Spring Scenery Medical Instrument Co., Ltd.	CZ0001	Equipment for surgery
Mupirocin ointment	Tianjin Smith Kline & French Laboratories Ltd.	H10930064	Anti-infection for animal
NeuN Rabbit monoclonal antibody	Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA)	24307	Primary antibody for IF staining
Neutral balsam	Absin Bioscience	abs9177	Seal for H&E staining
Paraffin embedding center	Thermo Fisher Scientific (USA)	EC 350	Produce paraffin blocks
Pentobarbital sodium	Sigma-Aldrich	P3761	Euthanized animal
Phosphate buffered saline	Shanghai Beyotime Biotech Co., Ltd	C0221A	Rinsing for tissue section
Shaver	Shenzhen Codos Electrical Appliances Co.,Ltd.	CP-9200	Equipment for surgery
Sodium citrate solution	Shanghai Beyotime Biotech Co., Ltd.	P0083	Antigen retrieval for IF staining