Induktion eines akuten ischämischen Schlaganfalls bei Mäusen mit der Technik des distalen Mittelarterienverschlusses

Zusammenfassung

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Etablierung eines distalen Modells für einen Verschluss der mittleren Hirnarterie (dMCAO) durch transkranielle Elektrokoagulation bei C57BL/6J-Mäusen vor und bewerten das anschließende neurologische Verhalten und die histopathologischen Merkmale.

Zusammenfassung

Der ischämische Schlaganfall ist nach wie vor die vorherrschende Ursache für Mortalität und Funktionsbeeinträchtigungen in der erwachsenen Bevölkerung weltweit. Nur eine Minderheit der Patienten mit ischämischem Schlaganfall kommt für eine intravaskuläre Thrombolyse oder eine mechanische Thrombektomietherapie innerhalb des optimalen Zeitfensters in Frage. Von den Schlaganfallüberlebenden leiden rund zwei Drittel über einen längeren Zeitraum an neurologischen Funktionsstörungen. Die Etablierung eines stabilen und wiederholbaren experimentellen ischämischen Schlaganfallmodells ist äußerst wichtig für die weitere Untersuchung der pathophysiologischen Mechanismen und die Entwicklung wirksamer therapeutischer Strategien für den ischämischen Schlaganfall. Die mittlere Hirnarterie (MCA) stellt die vorherrschende Lokalisation des ischämischen Schlaganfalls beim Menschen dar, wobei der MCA-Verschluss als häufig verwendetes Modell der fokalen zerebralen Ischämie dient. In diesem Protokoll beschreiben wir die Methodik zur Etablierung des distalen MCA-Okklusionsmodells (dMCAO) durch transkranielle Elektrokoagulation bei C57BL/6-Mäusen. Da sich die Okklusionsstelle am kortikalen Ast der MCA befindet, erzeugt dieses Modell eine mittelschwere Infarktläsion, die auf den Kortex beschränkt ist. Neurologische Verhaltens- und histopathologische Charakterisierungen haben in diesem Modell eine sichtbare motorische Dysfunktion, Neuronendegeneration und eine ausgeprägte Aktivierung von Mikroglia und Astrozyten gezeigt. Somit bietet dieses dMCAO-Mausmodell ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung des Ischämieschlaganfalls und den Wert der Popularisierung.

Einleitung

Der Schlaganfall ist eine häufige akute zerebrovaskuläre Erkrankung, die durch eine hohe Inzidenz von Behinderungen und Todesfällen gekennzeichnet^{ist 1}. Von allen Schlaganfallfällen gehören fast 80% zum ischämischen Schlaganfall². Bisher ist die intravenöse Thrombolyse einer der wenigen produktiven Ansätze zur Behandlung des akuten ischämischen Schlaganfalls. Die Wirksamkeit der thrombolytischen Behandlung wird jedoch durch das enge Wirkzeitfenster und das Auftreten einer hämorrhagischen Transformation eingeschränkt³. In der langfristigen Rehabilitationsphase nach einem ischämischen Schlaganfall ist bei einer beträchtlichen Anzahl von Patienten mit dauerhaften neurologischen Funktionsstörungen zu rechnen⁴. Weitere Untersuchungen sind dringend erforderlich, um die zugrundeliegenden pathophysiologischen Mechanismen des ischämischen Schlaganfalls zu entschlüsseln und die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien für den ischämischen Schlaganfall zu erleichtern. Die Etablierung eines verlässlichen und replizierbaren Modells des ischämischen Schlaganfalls ist sowohl für die Grundlagenforschung als auch für die anschließende translationale Forschung auf dem Gebiet des ischämischen Schlaganfalls von entscheidender Bedeutung.

Im Jahr 1981 entwickelten Tamura et al. ein fokales zerebrales Ischämiemodell, indem sie transkranielle Elektrokoagulation an der proximalen Stelle der mittleren Hirnarterie (MCA) ^einsetzten5. Seitdem haben zahlreiche Forscher verschiedene Methoden wie Ligatur, Kompression oder Clipping eingesetzt, um einen distalen MCA-Verschluss (dMCAO) zu induzieren, um transiente oder permanente ischämische Schlaganfallmodelle zu etablieren ^6,7,8. Im Vergleich zum Filamentmodell weist das dMCAO-Modell bemerkenswerte Vorteile auf, wie z. B. eine geringere Infarktgröße und eine höhere Überlebensrate, wodurch es sich besser für die Untersuchung der langfristigen funktionellen Wiederherstellung nach einem ischämischen Schlaganfall eignet⁹. Darüber hinaus zeigt das dMCAO-Modell eine höhere Überlebensrate bei gealterten Nagetieren im Vergleich zum Filamentmodell, was es zu einem vorteilhaften Werkzeug für die Untersuchung des ischämischen Schlaganfalls in älteren und komorbiden Tiermodellen macht¹⁰. Es wurde gezeigt, dass das photothrombotische (PT) Schlaganfallmodell die Merkmale einer geringeren chirurgischen Invasivität und einer signifikant niedrigen Mortalitätsrate aufweist. Das PT-Modell weist jedoch im Vergleich zum dMCAO-Modell ein höheres Maß an zellulärer Nekrose und Gewebeödem auf, was zu einem Fehlen einer kollateralen Zirkulation führt¹¹. Darüber hinaus ist bemerkenswert, dass die im PT-Modell beobachteten ischämischen Läsionen überwiegend auf einen mikrovaskulären Verschluss zurückzuführen sind, der sich wesentlich von der zerebralen Ischämie unterscheidet, die durch eine große Gefäßembolie im dMCAO-Modell induziert wird¹².

In dieser Arbeit stellen wir die Methodik zur Induktion des murinen dMCAO-Modells durch Koagulation des distalen MCA über eine kleine Knochenfensterkraniotomie vor. Zusätzlich führten wir histologische Untersuchungen und Verhaltensbewertungen durch, um die ischämischen Insulte und Schlaganfallergebnisse in diesem experimentellen Modell umfassend zu charakterisieren. Unser Ziel ist es, die Forscher mit diesem Modell vertraut zu machen und weitere Untersuchungen der pathologischen Mechanismen des ischämischen Schlaganfalls zu ermöglichen.

Protokoll

Das Versuchsprotokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee der Universität Jianghan genehmigt und in Übereinstimmung mit den ethischen Richtlinien für Versuchstiere durchgeführt, die vom Center for Disease Control of China herausgegeben wurden. In diesem Protokoll wurden adulte männliche C57BL/6J-Mäuse im Alter von 10 Wochen mit einem Gewicht von 24-26 g verwendet. Alle Mäuse wurden in einer 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus-kontrollierten Umgebung mit Futter und Wasser ad libitum untergebracht.

1. Präoperative Vorbereitung

HINWEIS: Die wichtigsten Instrumente und Geräte, die für dieses Protokoll erforderlich sind, sind in Abbildung 1 dargestellt.

1. Sterilisieren Sie die chirurgischen Instrumente vor dem Eingriff durch Autoklavieren.
2. Verabreichen Sie Meloxicam subkutan in einer Dosis von 5 mg/kg zur Analgesie 60 Minuten vor der Operation.
3. Betäuben Sie die Maus mit 5% Isofluran in einer Induktionskammer.
4. Wischen Sie das Heizungsbrett mit 75 % Ethanol ab und aktivieren Sie den Heizschalter bei einer Temperatur von 37 °C. Positionieren Sie dann die Maus in einer linken Seitenposition auf dem Brett, wobei der Kopf vom Chirurgen weg und der Schwanz zum Chirurgen zeigt.
5. Befestigen Sie eine Maske am Mausgesicht, die eine konstante Versorgung mit 2 % Isofluran und 0,3 l/min Sauerstoff für die Erhaltungsanästhesie bietet. Tragen Sie die Augensalbe auf die Hornhaut auf, um sie während des Eingriffs vor dem Austrocknen zu schützen.
6. Rasieren Sie das Fell von der linken Augenhöhle bis zum linken Gehörgang mit einem Rasierer. Verwenden Sie Enthaarungscremes, um das restliche Fell für die Sterilisation zu entfernen.
7. Bereiten Sie den Operationsbereich vor, indem Sie dreimal Povidon-Jod-Desinfektionsmittel und 75% Ethanol auftragen.

2. Distales MCAO-Modell

1. Überprüfen Sie, ob die Maus tief betäubt ist, indem Sie die Reflexe des Zehenkneifens beurteilen.
2. Machen Sie mit einer sterilen Skalpellklinge einen vertikalen Schnitt zwischen der linken Augenhöhle und dem linken Gehörgang.
3. Ziehen Sie das Weichgewebe der Haut mit Retraktoren zurück und legen Sie den Schläfenmuskel frei.
4. Trennen Sie mit einer geraden Mikrozange das apikale und das dorsale Segment des Schläfenmuskels vom Schädel.
5. Identifizieren Sie die Bifurkation des MCA, die unter dem Schläfenbein eine "Y"-Form mit einer Tendenz zur Schädelbasis annimmt (Abbildung 2A).
   HINWEIS: Wenn die Bifurkation von MCA visuell nicht erkennbar ist (aufgrund einer anatomisch normalen Variation), bestimmen Sie das rostralste Gefäß.
6. Verwenden Sie einen elektrischen Schädelbohrer, um den Schädel auszudünnen, um ein Knochenfenster (4 mm Durchmesser) zu erstellen, bis die Dura mater mit ihrer durchscheinenden Textur sichtbar wird.
   HINWEIS: Geben Sie regelmäßig Tropfen normaler Kochsalzlösung in den Schädel, um eine Überhitzung während dieses Vorgangs zu vermeiden.
7. Entfernen Sie die Dura mater oberhalb der Arterie mit einer gebogenen Mikrozange, um den MCA-Ast freizulegen.
8. Stellen Sie den Elektrokauter auf 7 W ein. Koagulieren Sie die Arterie mit der elektrischen Gerinnungszange an den Stellen proximal und distal der Bifurkation von MCA (Abbildung 2A). Wenn die Bifurkation aufgrund einer anatomischen Variation nicht sichtbar ist, führen Sie die Koagulation an dem genau identifizierten MCA-Ast (wie oben erwähnt) an zwei getrennten Stellen im Abstand von etwa 1 mm durch¹³.
9. Überwachen Sie den Blutfluss des linken kortikalen MCA-Astes mit einem Laser-Speckle-Blutflussmesser.
   HINWEIS: Mäuse, die nach der Elektrokoagulation eine Verringerung des Blutflusses um weniger als 40 % des Ausgangswerts zeigten, wurden von der Studie ausgeschlossen.
10. Nähen Sie den Muskel und die Haut getrennt mit 5-0 Polyglykolsäure-Nähten. Tragen Sie Diclofenac-Natriumgel und Mupirocin-Salbe mit einem sterilen Wattestäbchen auf den Hautschnitt auf.
11. Platzieren Sie die Maus in einer Auffangkammer. Überwachen Sie alle Mäuse, bis sie vollständig wach sind. Meloxicam (5 mg/kg, s.c.) zur Analgesie alle 24 h bis zu 72 h verabreichen.

3. Scheinoperation

1. Reproduzieren Sie das gleiche Verfahren wie oben beschrieben, ohne den Prozess der arteriellen Gerinnung.

4. Verhaltenstests

HINWEIS: Vor der dMCAO wurden die Mäuse 3 Tage lang zweimal täglich einem Verhaltenstraining unterzogen. Bringen Sie die Mäuse am 3^. Tag nach der dMCAO in den Verhaltenstestraum für eine 2-stündige Umweltanpassung, bevor Sie testen.

1. Prüfung der Griffkraft¹⁴
   HINWEIS: Das Grifffestigkeitsmessgerät besteht aus einem Push-Pull-Dehnungsmessstreifen und einer horizontalen Metallstange.
   1. Fassen Sie die Basis des Mausschwanzes. Senken Sie die Maus allmählich in Richtung der Metallgriffstange, bis sie die horizontale Stange mit beiden Vorderpfoten umklammert (Abbildung 2B).
   2. Ziehen Sie die Maus mit einer konstanten Geschwindigkeit von ca. 2 cm/s nach hinten und halten Sie das Gehäuse waagerecht.
   3. Notieren Sie die Spitzenkraft in Gramm (g), wenn die Maus ihre Vorderpfoten von der Stange löst.
2. Stangentest¹⁵
   1. Platzieren Sie die Maus mit dem Kopf nach oben auf der Spitze eines senkrechten Holzpfahls (50 cm hoch, 1 cm Durchmesser) und lassen Sie sie den Mast herunterklettern (Abbildung 2B).
   2. Notieren Sie die Zeit, die die Maus benötigt, um sich umzudrehen (T-Drehung) und die Gesamtzeit, um die Stange herunterzuklettern (T-Summe) mit einer Cut-Off-Zeit von 60 Sekunden.
3. Test zum Entfernen von Klebeband¹⁶
   1. Halten Sie die Maus fest und befestigen Sie ein Stück Klebeband (2 × 2 mm) an der rechten Vorderpfote der Maus (Abbildung 2B).
   2. Setzen Sie die Maus wieder in den Aufzuchtkäfig ein und lassen Sie sie frei bewegen.
   3. Notieren Sie die Zeit, die die Maus benötigt, um den Klebstoff zu entfernen, mit einem Limit von 60 s.
4. Zylinder Test¹⁷
   1. Platzieren Sie die Maus in einem oben offenen, klaren Glaszylinder (Durchmesser: 14 cm; Höhe: 20 cm) und zeichnen Sie ihr spontanes Erkundungsverhalten im Stand für 3 min mit einer Kamera auf (Abbildung 2B).
      HINWEIS: Während des experimentellen Verfahrens wurden zwei Spiegel neben dem Zylinder positioniert, um eine optimale Aufzeichnung der Bewegungen der Vordergliedmaßen zu gewährleisten.
   2. Wischen Sie den Zylinder mit 75 % Ethanol ab, um verbleibende Geruchsreize zu beseitigen, bevor Sie die nachfolgende Maus testen.
   3. Reduzieren Sie die Wiedergabegeschwindigkeit des Videos auf 1/5 der tatsächlichen Geschwindigkeit und zählen Sie die Anzahl der Wandberührungen mit der linken (L) oder rechten Vorderpfote (R) oder der gleichzeitigen Verwendung beider Vorderpfoten (B). Berechnen Sie die Nutzungsrate der rechten Vorderpfote als (L-R)/(L + R + B) × 100%.

5. Perfusion und Probenvorbereitung

1. Euthanasieren Sie die Maus durch Peritonealinjektion, Überdosierung von Pentobarbital (300 mg/kg). Positionieren Sie die Maus in Rückenlage und legen Sie die Gliedmaßen ruhig.
2. Machen Sie einen Schnitt in der Mittellinie der Haut, der von der mittleren Bauchhöhle bis zur oberen Brustregion reicht.
3. Öffnen Sie den Brustkorb mit einer chirurgischen Schere und klappen Sie das Xiphoid mit einem Hämostatat nach oben. Entfernen Sie vorsichtig die Lunge und das Zwerchfell, um das Herz freizulegen.
4. Führen Sie die Perfusionsnadelspitze in die linke Herzkammer ein und stechen Sie den rechten Vorhof mit einer Schere ein. Perfundieren Sie das Herz mit 20 ml normaler Kochsalzlösung über den linken Ventrikel.
5. Enthaupte die Maus und schneide die Kopfhaut entlang der Mittellinie zwischen den Augen auf. Schneiden Sie den Knochen an beiden Seiten ab, beginnend an der Schädelbasis und bis zur Augenhöhle öffnend.
6. Hebe das Schädeldach an und löse das Gehirn vorsichtig mit einer Pinzette von der Schädelbasis.
   HINWEIS: Die Gehirne der Hälfte der Mäuse wurden einer 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)-Färbung unterzogen, während die Gehirne der anderen Hälfte histologisch untersucht wurden.
7. Weichen Sie das Gehirn über Nacht in 4%iger Paraformaldehydlösung für die histologische Nachuntersuchung ein.

6. Identifizierung des Infarktvolumens

1. Legen Sie das Gehirn für 20 min in ein -20 °C heißes Gefrierfach des Kühlschranks.
2. Positionieren Sie das Gehirn in der 1 mm großen Hirnmatrix und schneiden Sie das Gehirn mit Hilfe von Mikrotomklingen in Koronarschnitte mit einer Dicke von 2 mm.
3. Übertragen Sie die Gehirnabschnitte auf eine 24-Well-Kulturplatte und fügen Sie 2 % TTC hinzu, um das Hirngewebe zu bedecken. Die 24-Well-Kulturplatte für 30 Minuten bei konstanter Temperatur auf 37 °C in einen Ofen mit konstanter Temperatur stellen.
4. Heben Sie die Gehirnabschnitte vorsichtig heraus und fixieren Sie sie 15 Minuten lang in 4%iger Paraformaldehydlösung.
5. Führen Sie eine optische Abtastung dieser Hirnschnitte mit einer Auflösung von 1200 x 1200 dpi mit einem Scanister durch.
6. Messen Sie das Hirninfarktvolumen, indem Sie die Infarktfläche jedes Abschnitts (Fläche der rechten Hemisphäre abzüglich unverletzter Fläche der linken Hemisphäre) mit der Software Image J (https://imagej.net/software/imagej/index)¹⁸ summieren. Berechnen Sie den Prozentsatz des Infarktvolumens als Infarktvolumen/Volumen der rechten Hemisphäre × 100%.

7. Histopathologische und Immunfluoreszenz-Färbeanalyse

1. Entnehmen Sie die Gehirnproben aus der Paraformaldehyd-Lösung und spülen Sie sie 1 h lang mit fließendem Wasser aus.
2. Übertragen Sie die Gehirnproben in die Automatisierungs-Gewebe-Dehydratisierungsmaschine. Starten Sie das voreingestellte Programm für Dehydratisierung, Vitrifikation und Eintauchen in das Wachs. Betten Sie die dehydrierten Gehirnproben in Paraffin ein und schneiden Sie sie mit einem Mikrotom in 5 μm dicke Abschnitte.
3. Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E)
   1. Entwachsen Sie die Abschnitte 3 Mal für jeweils 8 min mit Xylol.
   2. Rehydrieren Sie die Abschnitte, indem Sie nacheinander jeweils 5 Minuten lang in Gradientenethanol (100 %, 95 %, 90 %, 80 %, 70 %) und destilliertes Wasser eintauchen.
   3. Färben Sie die Schnitte 5 Minuten lang mit der Hämatoxylinlösung.
   4. Spülen Sie die Abschnitte mit destilliertem Wasser ab, um die Hämatoxylinrückstände zu waschen, und tauchen Sie sie dann in 5%igen Salzsäurealkohol, um eine 5-s-Differenzierung zu erreichen. Waschen Sie die Abschnitte 2 Minuten lang mit destilliertem Wasser.
   5. Die Abschnitte 30 s lang mit Eosinlösung färben und überschüssige Färbeflüssigkeit mit destilliertem Wasser abspülen.
   6. Tauchen Sie die Abschnitte jeweils 5 Minuten lang nacheinander in 90 % Ethanol, 95 % Ethanol, 100 % Ethanol und Xylol (2 Mal). Montieren Sie die Abschnitte mit einem neutralen Balsam-Einbettmedium.
4. Immunfluoreszenz-Färbung
   1. Entwachsen Sie die Abschnitte 3 Mal für jeweils 8 min mit Xylol.
   2. Rehydrieren Sie die Abschnitte, indem Sie nacheinander jeweils 5 Minuten lang in Gradientenethanol (100 %, 95 %, 90 %, 80 %, 70 %) und destilliertes Wasser eintauchen.
   3. Die Citrat-Antigen-Rückgewinnungslösung in der Mikrowelle zum Kochen vorheizen. Tauchen Sie die Schnitte in die Antigen-Entnahmelösung. Erhitzen Sie den Antigen-Retrieval-Puffer mit geringer Leistung (20 W) für 20 Minuten.
   4. Schalten Sie die Mikrowelle aus und lassen Sie den Antigen-Retrieval-Puffer auf Raumtemperatur (RT) abkühlen.
   5. Waschen Sie die Schnitte dreimal mit 0,1 mM phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für jeweils 5 Minuten.
   6. Die Schnitte werden 1 h lang mit einer Blockierungslösung (5 % Rinderserumalbumin) bei RT inkubiert, um die unspezifische Bindung von Immunglobulin zu blockieren.
   7. Inkubieren Sie die Schnitte mit Kaninchen-Anti-NeuN-Antikörper (1: 300), Kaninchen-Anti-Iba-1-Antikörper (1: 500) und Maus-Anti-GFAP-Antikörper (1: 500) bei 4 °C über Nacht.
   8. Waschen Sie die Abschnitte dreimal mit 0,1 mM PBS für jeweils 5 Minuten.
   9. Inkubieren Sie die Abschnitte mit Ziegen-Anti-Kaninchen-Alexa 594-konjugiertem IgG (1:500) oder Ziegen-Anti-Maus-Alexa 488-konjugiertem IgG (1:500) für 1 h bei RT.
   10. Waschen Sie die Abschnitte mit 0,1 mM PBS und montieren Sie sie mit einem Antifading-Einbettmedium, das 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) enthält.
   11. Nehmen Sie Bilder von drei mikroskopischen Feldern (300 μm × 300 μm) innerhalb des ischämischen Halbschattens mit einem Fluoreszenzmikroskop bei 594 nm bzw. 488 nm auf.
   12. Schätzen Sie mit der ImageJ-Software (https://imagej.net/software/imagej/index) die positiv gefärbte Zelldichte durch Mittelung der Zählungen in der ischämischen Halbschärfe¹⁹.

Ergebnisse

Die wichtigsten Instrumente, die zur Durchführung der dMCAO verwendet werden, sind das mikrochirurgische Instrumentarium, der Isofluran-Vaporizer und der monopolare mikrochirurgische Elektrokoagulationsgenerator, der in Abbildung 1 gezeigt ist. Das experimentelle Vorgehen dieser Studie ist in Abbildung 2 dargestellt. Kurz gesagt, wurde eine kleine Knochenfensterkraniotomie eingesetzt, um die distale MCA freizulegen, die anschließend koaguliert wurde, um bei C...

Diskussion

In dem vorliegenden Protokoll des Kraniotomie-Elektrokoagulations-dMCAO-Modells werden die chirurgischen Eingriffe mit minimalinvasiver Häufigkeit durchgeführt, wobei nur ein Teil des Schläfenmuskels abgetrennt wird, um die nachteiligen Auswirkungen auf die Kaufunktion zu mildern. Die Mäuse erholten sich alle gut nach dem Eingriff, ohne dass es zu Fütterungsschwierigkeiten kam. Die MCA ist im Schläfenbein der Maus leicht zu erkennen, was eine genaue Identifizierung geeigneter Kraniotomiestellen ermöglicht. Diese d...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride (TTC)	Sigma-Aldrich	108380	Dye for TTC staining
24-well culture plate	Corning (USA)	CLS3527	Vessel for TTC staining
4% paraformaldehyde	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.	G1101	Tissue fixation
5% bovine serum albumin	Wuhan BOSTER Bio Co., Ltd.	AR004	Non-specific antigen blocking
5-0 Polyglycolic acid suture	Jinhuan Medical Co., Ltd	KCR531	Material for surgery
Anesthesia machine	Midmark Corporation	VMR	Anesthetized animal
Antifade mounting medium	Beyotime Biotech	P0131	Seal for IF staining
Automation-tissue-dehydrating  machine	Leica Biosystems (Germany)	TP1020	Dehydrate tissue
Depilatory cream	Veet (France)	20220328	Material for surgery
Diclofenac sodium gel	Wuhan Ma Yinglong Pharmaceutical  Co., Ltd.	H10950214	Analgesia for animal
Drill tip (0.8 mm)	Rwd Life Science Co., Ltd.		Equipment for surgery
Eosin staining solution	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.	G1001	Dye for H&E staining
Eye ointment	Guangzhou Pharmaceutical Co., Ltd	H44023098	Material for surgery
Fluorescence microscope	Olympus (Japan)	BX51	Image acquisition
GFAP Mouse monoclonal antibody	Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA)	3670	Primary antibody for IF staining
Goat anti-mouse Alexa 488-conjugated IgG	Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA)	4408	Second antibody for IF staining
Goat anti-rabbit Alexa 594-conjugated IgG	Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA)	8889	Second antibody for IF staining
Grip strength meter	Shanghai Xinruan Information Technology Co., Ltd.	XR501	Equipment for behavioral test
Hematoxylin staining solution	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.	G1004	Dye for H&E staining
Iba1 Rabbit monoclonal antibody	Abcam	ab178846	Primary antibody for IF staining
Isoflurane	Rwd Life Science Co., Ltd.	R510-22-10	Anesthetized animal
Laser doppler blood flow meter	Moor Instruments (UK)	moorVMS	Blood flow monitoring
Meloxicam	Boehringer-Ingelheim	J20160020	Analgesia for animal
Microdrill	Rwd Life Science Co., Ltd.	78001	Equipment for surgery
Microsurgical instruments set	Rwd Life Science Co., Ltd.	SP0009-R	Equipment for surgery
Microtome	Thermo Fisher Scientific (USA)	HM325	Tissue section production
Microtome blade	Leica Biosystems (Germany)	819	Tissue section production
Monopolar electrocoagulation generator	Spring Scenery Medical Instrument Co., Ltd.	CZ0001	Equipment for surgery
Mupirocin ointment	Tianjin Smith Kline & French Laboratories Ltd.	H10930064	Anti-infection for animal
NeuN Rabbit monoclonal antibody	Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA)	24307	Primary antibody for IF staining
Neutral balsam	Absin Bioscience	abs9177	Seal for H&E staining
Paraffin embedding center	Thermo Fisher Scientific (USA)	EC 350	Produce paraffin blocks
Pentobarbital sodium	Sigma-Aldrich	P3761	Euthanized animal
Phosphate buffered saline	Shanghai Beyotime Biotech Co., Ltd	C0221A	Rinsing for tissue section
Shaver	Shenzhen Codos Electrical Appliances Co.,Ltd.	CP-9200	Equipment for surgery
Sodium citrate solution	Shanghai Beyotime Biotech Co., Ltd.	P0083	Antigen retrieval for IF staining