Indução de AVC Isquêmico Agudo em Camundongos Usando a Técnica de Oclusão Distal da Artéria Média

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para estabelecer um modelo de oclusão da artéria cerebral média distal (dMCAO) por meio de eletrocoagulação transcraniana em camundongos C57BL/6J e avaliar o comportamento neurológico subsequente e as características histopatológicas.

Resumo

O AVC isquêmico continua sendo a causa predominante de mortalidade e comprometimento funcional entre as populações adultas em todo o mundo. Apenas uma minoria dos pacientes com AVC isquêmico é elegível para receber trombólise intravascular ou terapia de trombectomia mecânica dentro da janela de tempo ideal. Entre os sobreviventes de AVC, cerca de dois terços sofrem disfunções neurológicas por um período prolongado. O estabelecimento de um modelo experimental de AVC isquêmico estável e repetível é extremamente significativo para investigar ainda mais os mecanismos fisiopatológicos e desenvolver estratégias terapêuticas eficazes para o AVC isquêmico. A artéria cerebral média (ACM) representa a localização predominante do AVC isquêmico em humanos, com a oclusão da ACM servindo como o modelo frequentemente empregado de isquemia cerebral focal. Neste protocolo, descrevemos a metodologia de estabelecimento do modelo de oclusão distal da ACM (dMCAO) por meio de eletrocoagulação transcraniana em camundongos C57BL/6. Como o local de oclusão está localizado no ramo cortical da ACM, esse modelo gera uma lesão infartada moderada restrita ao córtex. A caracterização neurológica, comportamental e histopatológica demonstrou disfunção motora visível, degeneração neuronal e ativação pronunciada de microglia e astrócitos neste modelo. Assim, este modelo de camundongo dMCAO fornece uma ferramenta valiosa para investigar o acidente vascular cerebral de isquemia e vale a pena popularização.

Introdução

O acidente vascular cerebral é uma doença cerebrovascular aguda comum, caracterizada por altas incidências de incapacidade e^fatalidade1. De todos os casos de AVC, quase 80% pertencem ao AVC isquêmico². Até agora, a trombólise intravenosa continua sendo uma de um número limitado de abordagens produtivas para o tratamento do AVC isquêmico agudo. No entanto, a eficácia do tratamento trombolítico é restrita pela estreita janela de tempo efetiva e pela ocorrência de transformação hemorrágica³. Na fase de reabilitação a longo prazo após um acidente vascular cerebral isquêmico, um número considerável de pacientes provavelmente apresentará disfunções neurológicas duráveis⁴. Mais investigações são urgentemente necessárias para desvendar os mecanismos fisiopatológicos subjacentes do AVC isquêmico, bem como para facilitar o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas direcionadas ao AVC isquêmico. O estabelecimento de um modelo confiável e replicável de AVC isquêmico é crucial para a pesquisa básica, bem como para a pesquisa translacional subsequente no campo do AVC isquêmico.

Em 1981, Tamura et al. desenvolveram um modelo de isquemia cerebral focal empregando eletrocoagulação transcraniana no local proximal da artéria cerebral média (ACM)⁵. Desde então, vários pesquisadores utilizaram várias metodologias, como ligadura, compressão ou clipagem, para induzir a oclusão distal da ACM (dMCAO) para estabelecer modelos de AVC isquêmico transitório ou permanente ^6,7,8. Comparado ao modelo de filamento, o modelo dMCAO apresenta vantagens notáveis, como menor tamanho de infarto e maior taxa de sobrevida, tornando-o mais adequado para investigar a recuperação funcional a longo prazo após acidente vascular cerebral isquêmico⁹. Além disso, o modelo dMCAO demonstra uma maior taxa de sobrevivência em roedores idosos em comparação com o modelo de filamento, tornando-se uma ferramenta vantajosa para investigar AVC isquêmico em modelos animais idosos e comórbidos¹⁰. O modelo de AVC fototrombótico (TP) demonstrou possuir as características de menor invasividade cirúrgica e uma taxa de mortalidade significativamente baixa. No entanto, o modelo TP exibe um maior grau de necrose celular e edema tecidual em comparação com o modelo dMCAO, levando à ausência de circulação colateral¹¹. Além disso, vale ressaltar que as lesões isquêmicas observadas no modelo TP decorrem predominantemente da oclusão microvascular, o que difere substancialmente da isquemia cerebral induzida por embolia de grandes vasos no modelo^dMCAO12.

Neste artigo, apresentamos a metodologia para induzir o modelo murino dMCAO coagulando a ACM distal via craniotomia de pequena janela óssea. Além disso, realizamos exames histológicos e avaliações comportamentais para caracterizar de forma abrangente os insultos isquêmicos e os resultados do AVC neste modelo experimental. Nosso objetivo é familiarizar os pesquisadores com esse modelo e facilitar novas investigações sobre os mecanismos patológicos do AVC isquêmico.

Protocolo

O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Jianghan e foi conduzido de acordo com as Diretrizes Éticas de Animais Experimentais emitidas pelo Centro de Controle de Doenças da China. Camundongos C57BL/6J machos adultos, com 10 semanas de idade, pesando 24-26 g, foram utilizados neste protocolo. Todos os camundongos foram alojados em um ambiente controlado de ciclo claro/escuro de 12 horas com comida e água ad libitum.

1. Preparo pré-operatório

NOTA: Os principais instrumentos e equipamentos necessários para este protocolo são mostrados na Figura 1.

1. Antes do procedimento, esterilize os instrumentos cirúrgicos em autoclavagem.
2. Administre meloxicam por via subcutânea na dose de 5 mg/kg para analgesia 60 min antes da cirurgia.
3. Anestesiar o camundongo com isoflurano a 5% em uma câmara de indução.
4. Limpe a placa de cirurgia de aquecimento com etanol a 75% e ative o interruptor de aquecimento com a temperatura ajustada para 37 °C. Em seguida, posicione o mouse em uma posição lateral esquerda no tabuleiro, com a cabeça posicionada longe do cirurgião e a cauda voltada para o cirurgião.
5. Anexe uma máscara ao rosto do mouse que forneça um suprimento constante de isoflurano a 2% e oxigênio a 0,3 L/min para anestesia de manutenção. Aplique a pomada para os olhos na córnea para protegê-la do ressecamento durante o procedimento.
6. Raspe o pelo da órbita esquerda para o canal auditivo esquerdo com um barbeador. Use cremes depilatórios para remover o pelo restante para esterilização.
7. Preparar a área cirúrgica aplicando desinfetante iodopovidona e etanol 75% três vezes.

2. Modelo MCAO distal

1. Verifique se o mouse está profundamente anestesiado, avaliando os reflexos da pinça do dedo do pé.
2. Faça uma incisão vertical entre a órbita esquerda e o canal auditivo esquerdo usando uma lâmina de bisturi estéril.
3. Retraia o tecido mole da pele com afastadores e exponha o músculo temporal.
4. Use micropinças retas para separar os segmentos apicais e dorsais do músculo temporal do crânio.
5. Identifique a bifurcação da ACM, que assume uma forma de "Y" abaixo do osso temporal com um viés em direção à base do crânio (Figura 2A).
   NOTA: Se a bifurcação da ACM não for visualmente discernível (devido a uma variação anatomicamente normal), verifique o vaso mais rostral.
6. Use uma broca craniana elétrica para afinar o crânio para fazer uma janela óssea (4 mm de diâmetro) até que a dura-máter, com sua textura translúcida, se torne visível.
   NOTA: Adicione intermitentemente gotas de solução salina normal ao crânio para evitar o superaquecimento durante este processo.
7. Remova a dura-máter acima da artéria com microfórceps curvos para expor o ramo MCA.
8. Ajuste o eletrocautério para 7 W. Coagule a artéria usando a pinça elétrica de coagulação nos locais proximal e distal à bifurcação da ACM (Figura 2A). Quando a bifurcação não for visível devido a uma variação anatômica, realizar a coagulação no ramo da ACM identificado com precisão (como mencionado acima) em dois locais separados por aproximadamente 1 mm¹³.
9. Monitore o fluxo sanguíneo do ramo cortical esquerdo da ACM utilizando um medidor de fluxo sanguíneo a laser.
   NOTA: Os camundongos que exibiram uma redução do fluxo sanguíneo inferior a 40% do valor basal após eletrocoagulação foram excluídos do estudo.
10. Suturar o músculo e a pele separadamente usando suturas de ácido poliglicólico 5-0. Aplique gel de diclofenaco sódico e pomada de mupirocina na incisão da pele usando um cotonete estéril.
11. Coloque o mouse em uma câmara de recuperação. Monitore todos os ratos até que estejam totalmente acordados. Forneça meloxicam (5 mg/kg, SC) para analgesia a cada 24 h até 72 h.

3. Operação simulada

1. Reproduza o mesmo procedimento mencionado acima, excluindo o processo de coagulação arterial.

4. Testes comportamentais

NOTA: Antes do dMCAO, os camundongos foram submetidos a treinamento comportamental duas vezes ao dia por 3 dias. No^3º dia pós-dMCAO, mova os camundongos para a sala de testes comportamentais para uma adaptação ambiental de 2 horas antes do teste.

1. Teste de força de preensão¹⁴
   NOTA: O medidor de força de preensão compreende um medidor de tensão push-pull e uma barra horizontal de metal.
   1. Segure a base da cauda do mouse. Abaixe gradualmente o mouse em direção à barra de metal até que ele segure a barra horizontal com as duas patas dianteiras (Figura 2B).
   2. Puxe o mouse para trás a uma velocidade constante de cerca de 2 cm/s e mantenha seu corpo na horizontal.
   3. Registre o pico de força em gramas (g) quando o mouse soltar as patas dianteiras da barra.
2. Teste de vara¹⁵
   1. Coloque o mouse no topo de um poste vertical de madeira (50 cm de altura, 1 cm de diâmetro) com a cabeça voltada para cima e deixe-o descer pelo poste (Figura 2B).
   2. Registre o tempo gasto pelo mouse para virar (T-turn) e o tempo total para descer o poste (T-total) com um tempo de corte de 60 s.
3. Teste de remoção de fita adesiva¹⁶
   1. Segure o mouse e prenda um pedaço de fita adesiva (2 × 2 mm) na pata dianteira direita do mouse (Figura 2B).
   2. Coloque o mouse de volta na gaiola de criação e deixe-o se mover livremente.
   3. Registre o tempo gasto pelo mouse para remover o adesivo com um limite de 60 s.
4. Ensaio do cilindro¹⁷
   1. Coloque o mouse em um cilindro de vidro transparente aberto (diâmetro: 14 cm; altura: 20 cm) e registre seu comportamento exploratório espontâneo em pé por 3 minutos usando uma câmera (Figura 2B).
      NOTA: Durante o procedimento experimental, dois espelhos foram posicionados ao lado do cilindro para garantir o registro ideal dos movimentos dos membros anteriores.
   2. Limpe o cilindro com etanol 75% para eliminar sinais olfativos residuais antes de testar o camundongo subsequente.
   3. Reduza a velocidade de reprodução do vídeo para 1/5 da velocidade real e conte o número de toques na parede com a pata dianteira esquerda (L) ou direita (R) ou o uso simultâneo de ambas as patas dianteiras (B). Calcule a taxa de uso da pata dianteira direita como (LR) / (L + R + B) × 100%.

5. Perfusão e preparação de amostras

1. Eutanasiar o camundongo por overdose de injeção peritoneal de pentobarbital (300 mg / kg). Posicione o rato em decúbito dorsal e imobilize os membros.
2. Faça uma incisão na linha média da pele, começando pela cavidade abdominal média e estendendo-se em direção à região superior do tórax.
3. Abra o tórax com uma tesoura cirúrgica e dobre o xifóide para cima com um hemostático. Remova cuidadosamente o pulmão e o diafragma para expor o coração.
4. Insira a ponta da agulha de perfusão no ventrículo esquerdo e puncione o átrio direito com uma tesoura. Perfundir o coração com 20 mL de solução salina normal através do ventrículo esquerdo.
5. Decapite o rato e corte o couro cabeludo ao longo da linha média entre os olhos. Corte o osso ao longo de ambos os lados, começando pela base do crânio e abrindo até a órbita ocular.
6. Levante a calvária e separe suavemente o cérebro da base do crânio usando uma pinça.
   NOTA: Os cérebros de metade dos camundongos foram submetidos à coloração com cloreto de 2,3,5-trifenil tetrazólio (TTC), enquanto os cérebros da outra metade foram submetidos a exame histológico.
7. Mergulhe os cérebros em solução de paraformaldeído a 4% durante a noite para análise histológica de acompanhamento.

6. Identificação do volume do infarto

1. Coloque o cérebro em um freezer a -20 °C da geladeira por 20 min.
2. Posicione o cérebro na matriz cerebral de 1 mm e corte o cérebro em seções coronárias com espessura de 2 mm usando lâminas de micrótomo.
3. Transfira as seções cerebrais para uma placa de cultura de 24 poços e adicione 2% de TTC para cobrir o tecido cerebral. Coloque a placa de cultura de 24 poços em um forno de temperatura constante por 30 min com a temperatura ajustada em 37 °C.
4. Levante cuidadosamente as seções cerebrais e fixe-as em solução de paraformaldeído a 4% por 15 min.
5. Realize a varredura óptica dessas seções cerebrais com uma resolução de 1200 x 1200 dpi por um scanister.
6. Meça o volume do infarto cerebral somando a área do infarto de cada seção (área do hemisfério direito menos a área não lesada do hemisfério esquerdo) usando o software Image J (https://imagej.net/software/imagej/index)¹⁸. Calcule a porcentagem do volume do infarto como volume do infarto/volume do hemisfério direito × 100%.

7. Análise histopatológica e imunofluorescente

1. Retire as amostras de cérebro da solução de paraformaldeído e lave-as com água corrente por 1 h.
2. Transfira as amostras cerebrais para a máquina de desidratação de tecidos automatizados. Inicie o programa predefinido para desidratação, vitrificação e imersão em cera. Incorpore as amostras de cérebro desidratado em parafina e corte-as em seções de 5 μm de espessura por um micrótomo.
3. Coloração de hematoxilina e eosina (H&E)
   1. Desparafine as seções com xileno 3 vezes por 8 min cada.
   2. Reidrate as seções imergindo sucessivamente em etanol gradiente (100%, 95%, 90%, 80%, 70%) e água destilada por 5 min de cada vez.
   3. Manchar as secções com a solução de hematoxilina durante 5 min.
   4. Enxágue as seções com água destilada para lavar o resíduo de hematoxilina e, em seguida, mergulhe-as em álcool de ácido clorídrico a 5% para uma diferenciação de 5 s. Lave as seções com água destilada por 2 min.
   5. Manchar as secções com solução de eosina durante 30 s e enxaguar o excesso de líquido de coloração com água destilada.
   6. Mergulhe as seções em etanol 90%, etanol 95%, etanol 100% e xileno (2 vezes) sucessivamente por 5 min de cada vez. Monte as seções com um meio de montagem de bálsamo neutro.
4. Coloração de imunofluorescência
   1. Desparafine as seções com xileno 3 vezes por 8 minutos de cada vez.
   2. Reidrate as seções imergindo sucessivamente em etanol gradiente (100%, 95%, 90%, 80%, 70%) e água destilada por 5 min de cada vez.
   3. Pré-aqueça a solução de recuperação de antígeno citrato para ferver no microondas. Mergulhe as seções na solução de recuperação de antígeno. Reaqueça o tampão de recuperação de antígeno com baixa potência (20 W) por 20 min.
   4. Desligue o micro-ondas e deixe o tampão de recuperação de antígeno esfriar até a temperatura ambiente (RT).
   5. Lave as seções três vezes com solução salina tamponada com fosfato 0.1 mM (PBS) por 5 min de cada vez.
   6. Incubar os cortes com uma solução de bloqueio (albumina de soro bovino a 5%) em RT durante 1 h para bloquear a ligação não específica da imunoglobulina.
   7. Incubar as secções com anticorpo anti-NeuN de coelho (1: 300), anticorpo anti-Iba-1 de coelho (1: 500) e anticorpo anti-GFAP de ratinho (1: 500) a 4 ° C durante a noite.
   8. Lave as seções três vezes com 0.1 mM PBS por 5 min de cada vez.
   9. Incube as seções com IgG conjugado com Alexa 594 anti-coelho de cabra (1:500) ou IgG conjugado com Alexa 488 anti-camundongo de cabra (1:500) por 1 h em RT.
   10. Lave as seções com 0.1 mM PBS e monte-as com um meio de montagem antidesbotamento contendo 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI).
   11. Tire imagens de três campos microscópicos (300 μm × 300 μm) dentro da penumbra isquêmica usando um microscópio fluorescente a 594 nm e 488 nm, respectivamente.
   12. Usando o software ImageJ (https://imagej.net/software/imagej/index), estime a densidade celular corada positivamente pela média das contagens na penumbra isquêmica¹⁹.

Resultados

Os principais instrumentos utilizados para realizar o dMCAO são o conjunto de instrumentos microcirúrgicos, o vaporizador de isoflurano e o gerador de eletrocoagulação microcirúrgica monopolar mostrado na Figura 1. O procedimento experimental deste estudo está ilustrado na Figura 2. Em resumo, uma pequena craniotomia de janela óssea foi empregada para expor a ACM distal, que foi posteriormente coagulada para induzir isquemia cerebral focal permanente em ...

Discussão

No presente protocolo do modelo dMCAO de eletrocoagulação de craniotomia, os procedimentos cirúrgicos são conduzidos com o mínimo de invasividade, em que apenas uma porção do músculo temporal é separada para mitigar os efeitos adversos na função mastigatória. Todos os camundongos se recuperaram bem após o procedimento, sem casos observados de dificuldades de alimentação. A ACM pode ser facilmente discernida no osso temporal do camundongo, facilitando assim a identificação precisa dos locais adequados da ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride (TTC)	Sigma-Aldrich	108380	Dye for TTC staining
24-well culture plate	Corning (USA)	CLS3527	Vessel for TTC staining
4% paraformaldehyde	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.	G1101	Tissue fixation
5% bovine serum albumin	Wuhan BOSTER Bio Co., Ltd.	AR004	Non-specific antigen blocking
5-0 Polyglycolic acid suture	Jinhuan Medical Co., Ltd	KCR531	Material for surgery
Anesthesia machine	Midmark Corporation	VMR	Anesthetized animal
Antifade mounting medium	Beyotime Biotech	P0131	Seal for IF staining
Automation-tissue-dehydrating  machine	Leica Biosystems (Germany)	TP1020	Dehydrate tissue
Depilatory cream	Veet (France)	20220328	Material for surgery
Diclofenac sodium gel	Wuhan Ma Yinglong Pharmaceutical  Co., Ltd.	H10950214	Analgesia for animal
Drill tip (0.8 mm)	Rwd Life Science Co., Ltd.		Equipment for surgery
Eosin staining solution	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.	G1001	Dye for H&E staining
Eye ointment	Guangzhou Pharmaceutical Co., Ltd	H44023098	Material for surgery
Fluorescence microscope	Olympus (Japan)	BX51	Image acquisition
GFAP Mouse monoclonal antibody	Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA)	3670	Primary antibody for IF staining
Goat anti-mouse Alexa 488-conjugated IgG	Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA)	4408	Second antibody for IF staining
Goat anti-rabbit Alexa 594-conjugated IgG	Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA)	8889	Second antibody for IF staining
Grip strength meter	Shanghai Xinruan Information Technology Co., Ltd.	XR501	Equipment for behavioral test
Hematoxylin staining solution	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.	G1004	Dye for H&E staining
Iba1 Rabbit monoclonal antibody	Abcam	ab178846	Primary antibody for IF staining
Isoflurane	Rwd Life Science Co., Ltd.	R510-22-10	Anesthetized animal
Laser doppler blood flow meter	Moor Instruments (UK)	moorVMS	Blood flow monitoring
Meloxicam	Boehringer-Ingelheim	J20160020	Analgesia for animal
Microdrill	Rwd Life Science Co., Ltd.	78001	Equipment for surgery
Microsurgical instruments set	Rwd Life Science Co., Ltd.	SP0009-R	Equipment for surgery
Microtome	Thermo Fisher Scientific (USA)	HM325	Tissue section production
Microtome blade	Leica Biosystems (Germany)	819	Tissue section production
Monopolar electrocoagulation generator	Spring Scenery Medical Instrument Co., Ltd.	CZ0001	Equipment for surgery
Mupirocin ointment	Tianjin Smith Kline & French Laboratories Ltd.	H10930064	Anti-infection for animal
NeuN Rabbit monoclonal antibody	Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA)	24307	Primary antibody for IF staining
Neutral balsam	Absin Bioscience	abs9177	Seal for H&E staining
Paraffin embedding center	Thermo Fisher Scientific (USA)	EC 350	Produce paraffin blocks
Pentobarbital sodium	Sigma-Aldrich	P3761	Euthanized animal
Phosphate buffered saline	Shanghai Beyotime Biotech Co., Ltd	C0221A	Rinsing for tissue section
Shaver	Shenzhen Codos Electrical Appliances Co.,Ltd.	CP-9200	Equipment for surgery
Sodium citrate solution	Shanghai Beyotime Biotech Co., Ltd.	P0083	Antigen retrieval for IF staining