원위 중동맥 폐색 기법을 사용한 마우스의 급성 허혈성 뇌졸중 유도

요약

여기에서는 C57BL/6J 마우스에서 경두개 전기응고를 통해 원위 중뇌동맥 폐색(dMCAO) 모델을 확립하고 후속 신경학적 행동 및 조직병리학적 특징을 평가하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

초록

허혈성 뇌졸중은 전 세계 성인 인구의 사망률과 기능 장애의 주요 원인으로 남아 있습니다. 소수의 허혈성 뇌졸중 환자만이 최적의 시간 창 내에 혈관 내 혈전용해 또는 기계적 혈전 절제술을 받을 수 있습니다. 이러한 뇌졸중 생존자 중 약 3분의 2는 장기간에 걸쳐 신경 기능 장애를 겪습니다. 안정적이고 반복 가능한 실험적 허혈성 뇌졸중 모델을 확립하는 것은 병태생리학적 메커니즘을 추가로 조사하고 허혈성 뇌졸중에 대한 효과적인 치료 전략을 개발하는 데 매우 중요합니다. 중뇌동맥(MCA)은 인간에서 허혈성 뇌졸중의 주요 위치를 나타내며, MCA 폐색은 국소 대뇌 허혈의 자주 사용되는 모델 역할을 합니다. 이 프로토콜에서는 C57BL/6 마우스에서 경두개 전기 응고를 통해 원위 MCA 폐색(dMCAO) 모델을 설정하는 방법론을 설명합니다. 폐색 부위가 MCA의 대뇌 피질 가지에 위치하기 때문에 이 모델은 피질에 국한된 중등도의 경색 병변을 생성합니다. 신경학적 행동 및 조직병리학적 특성 분석은 이 모델에서 눈에 띄는 운동 기능 장애, 뉴런 퇴행, 미세아교세포 및 성상교세포의 뚜렷한 활성화를 보여주었습니다. 따라서 이 dMCAO 마우스 모델은 허혈 뇌졸중과 대중화의 가치를 조사하는 데 유용한 도구를 제공합니다.

서문

뇌졸중은 흔한 급성 뇌혈관 질환으로 장애와 사망률이 높은 것이 특징이다¹. 모든 뇌졸중 사례 중 거의 80%가 허혈성 뇌졸중에 속합니다². 현재까지 정맥 혈전용해술은 급성 허혈성 뇌졸중 치료를 위한 제한적이고 생산적인 접근법 중 하나로 남아 있습니다. 그러나, 혈전용해 치료의 효과는 효과적인 기간이 좁고 출혈성 변형의 발생에 의해 제한된다³. 허혈성 뇌졸중 후 장기 재활 단계에서 상당수의 환자가 지속적인 신경기능 장애를 경험할 가능성이 높다⁴. 허혈성 뇌졸중의 근본적인 병태생리학적 기전을 밝히고 허혈성 뇌졸중을 표적으로 하는 새로운 치료 전략의 개발을 촉진하기 위해 추가 연구가 시급히 필요합니다. 허혈성 뇌졸중의 신뢰할 수 있고 재현 가능한 모델을 확립하는 것은 허혈성 뇌졸중 분야의 기초 연구뿐만 아니라 후속 중개 연구에도 중요합니다.

1981년 Tamura et al.은 중뇌동맥(MCA)의 근위 부위에서 경두개 전기응고를 사용하여 국소 대뇌 허혈 모델을 개발했습니다.⁵. 그 이후로 수많은 연구자들이 일과적 또는 영구적 허혈성 뇌졸중 모델을 확립하기 위해 원위 MCA 폐색(dMCAO)을 유도하기 위해 결찰, 압박 또는 클리핑과 같은 다양한 방법론을 활용했습니다 ^6,7,8. 필라멘트 모델과 비교했을 때, dMCAO 모델은 경색 크기가 작고 생존율이 높다는 등의 주목할 만한 장점을 보여주며, 허혈성 뇌졸중⁹ 이후 장기적인 기능 회복을 조사하는 데 더 적합하다. 또한, dMCAO 모델은 필라멘트 모델에 비해 고령 설치류에서 더 높은 생존율을 보여주며, 이는 노인 및 동반 질환 동물 모델에서 허혈성 뇌졸중을 조사하는 데 유리한 도구가 된다¹⁰. 광혈전(PT) 뇌졸중 모델은 외과적 침습성이 적고 사망률이 현저히 낮은 특성을 가지고 있는 것으로 입증되었습니다. 그러나, PT 모델은 dMCAO 모델에 비해 더 큰 정도의 세포 괴사 및 조직 부종을 나타내며, 이로 인해 측부 순환이 부재하다¹¹. 또한, PT 모델에서 관찰된 허혈성 병변은 주로 미세혈관 폐색에 의해 발생하며, 이는 dMCAO 모델¹²에서 대혈관 색전증에 의해 유발된 대뇌 허혈과 실질적으로 다르다는 점에 주목할 만하다.

본 논문에서는 소골창 개두술을 통해 원위 MCA를 응고하여 쥐 dMCAO 모델을 유도하는 방법론을 제시한다. 또한, 이 실험 모델에서 허혈성 모욕과 뇌졸중 결과를 종합적으로 특성화하기 위해 조직학적 검사와 행동 평가를 수행했습니다. 우리는 연구자들에게 이 모델을 알리고 허혈성 뇌졸중의 병리학적 메커니즘에 대한 추가 연구를 촉진하는 것을 목표로 합니다.

프로토콜

실험 프로토콜은 Jianghan University의 Institutional Animal Care and Use Committee의 승인을 받았으며 중국 질병 통제 센터에서 발행한 실험 동물 윤리 지침에 따라 수행되었습니다. 이 프로토콜에는 10주령의 24-26g의 성인 수컷 C57BL/6J 마우스가 사용되었습니다. 모든 마우스는 음식과 물이 포함된 12시간 빛/어두운 주기 제어 환경에서 수용되었습니다 .

1. 수술 전 준비

참고: 이 프로토콜에 필요한 주요 기기 및 장비는 그림 1에 나와 있습니다.

1. 시술 전에 고압멸균으로 수술 기구를 멸균하십시오.
2. 수술 60분 전에 진통을 위해 5mg/kg의 용량으로 멜록시캠을 피하 투여합니다.
3. 유도 챔버에서 5% 이소플루란으로 마우스를 마취합니다.
4. 가열 수술 보드를 75% 에탄올로 닦고 온도를 37°C로 설정한 상태에서 가열 스위치를 활성화합니다. 그런 다음 머리는 외과 의사로부터 멀리 배치하고 꼬리는 외과 의사를 향하도록 하여 마우스를 보드의 왼쪽 측면 위치에 놓습니다.
5. 유지 마취를 위해 2% 이소플루란과 0.3L/min 산소를 지속적으로 공급하는 마스크를 마우스 얼굴에 부착합니다. 시술 중 각막이 건조해지는 것을 방지하기 위해 각막에 눈 연고를 바르십시오.
6. 면도기로 왼쪽 안와에서 왼쪽 외이도까지의 털을 면도합니다. 제모 크림을 사용하여 살균을 위해 남아 있는 털을 제거하십시오.
7. 포비돈-요오드 소독제와 75% 에탄올을 3회 도포하여 수술 부위를 준비합니다.

2. 원위 MCAO 모델

1. 발가락 꼬집음의 반사 신경을 평가하여 쥐가 깊이 마취되었는지 확인하십시오.
2. 멸균 메스 칼날을 사용하여 왼쪽 안와와 왼쪽 외이도 사이를 수직으로 절개합니다.
3. 견인기로 피부의 연조직을 수축시키고 측두근을 노출시킵니다.
4. 직선 마이크로 겸자를 사용하여 두개골에서 측두근의 정점 및 등쪽 부분을 분리합니다.
5. 두개골 기저부를 향해 편향된 측두골 아래의 "Y" 모양을 가정하는 MCA의 분기를 식별합니다(그림 2A).
   알림: MCA의 분기가 시각적으로 식별할 수 없는 경우(해부학적으로 정상적인 변화로 인해) 가장 회전적인 혈관을 확인하십시오.
6. 전기 두개골 드릴을 사용하여 두개골을 얇게 만들어 반투명 질감의 경막이 보일 때까지 뼈 창(직경 4mm)을 만듭니다.
   알림: 이 과정에서 과열을 방지하기 위해 두개골에 생리식염수를 간헐적으로 떨어뜨리십시오.
7. 구부러진 마이크로 겸자로 동맥 위의 경막을 제거하여 MCA 가지를 노출시킵니다.
8. 전기 소작을 7W로 설정합니다. MCA의 분기점에 대한 근위 및 원위 부위에서 전기 응고 겸자를 사용하여 동맥을 응고시킵니다(그림 2A). 해부학적 변이로 인해 분기가 보이지 않는 경우, 약 1mm 떨어진 두 개의 분리된 위치에서 정확하게 식별된 MCA 분기(위에서 언급한 바와 같이)에 대한 응고를 수행한다(¹³).
9. 레이저 스페클 혈류 측정기를 사용하여 왼쪽 MCA 피질 가지의 혈류를 모니터링합니다.
   참고: 전기 응고 후 기준선 값의 40% 미만의 혈류 감소를 보이는 마우스는 연구에서 제외되었습니다.
10. 5-0 폴리글리콜산 봉합사를 사용하여 근육과 피부를 별도로 봉합합니다. 멸균 면봉을 사용하여 디클로페낙 나트륨 젤과 무피로신 연고를 피부 절개 부위에 바릅니다.
11. 마우스를 회수 챔버에 넣습니다. 완전히 깨어날 때까지 모든 쥐를 모니터링하십시오. 진통을 위해 멜록시캠(5mg/kg, SC)을 24시간마다 최대 72시간마다 제공합니다.

3. 가짜 운영

1. 동맥 응고 과정을 제외하고 위에서 언급한 것과 동일한 절차를 재현합니다.

4. 행동 테스트

참고: dMCAO 이전에 마우스는 3일 동안 하루에 두 번 행동 훈련을 받았습니다. dMCAO 후 3일^째 되는 날, 실험 전에 2시간 환경 적응을 위해 쥐를 행동 검사실로 옮깁니다.

1. 그립 강도 테스트¹⁴
   참고: 그립 강도 미터는 푸시-풀 스트레인 게이지와 금속 수평 막대로 구성됩니다.
   1. 쥐 꼬리의 바닥을 잡습니다. 양쪽 앞발로 수평 막대를 잡을 때까지 마우스를 금속 그립 바 쪽으로 서서히 내립니다(그림 2B).
   2. 약 2cm/s의 일정한 속도로 마우스를 뒤로 당기고 몸체를 수평으로 유지합니다.
   3. 마우스가 바에서 앞발을 뗄 때의 최대 힘을 그램(g) 단위로 기록합니다.
2. 극 테스트¹⁵
   1. 머리가 위를 향하게 하여 수직 나무 기둥(높이 50cm, 지름 1cm) 위에 마우스를 놓고 기둥을 타고 내려갈 수 있도록 합니다(그림 2B).
   2. 마우스가 회전하는 데 걸린 시간(T-turn)과 기둥을 내려가는 데 걸린 총 시간(T-total)을 60초의 컷오프 시간으로 기록합니다.
3. 접착 테이프 제거 테스트¹⁶
   1. 마우스를 잡고 접착 테이프 패치(2 × 2mm)를 마우스의 오른쪽 앞발에 부착합니다(그림 2B).
   2. 마우스를 사육 케이지에 다시 넣고 자유롭게 움직일 수 있도록 합니다.
   3. 마우스가 접착제를 제거하는 데 걸린 시간을 60초 제한으로 기록합니다.
4. 실린더 테스트¹⁷
   1. 상단이 열린 투명 유리 실린더(지름: 14cm, 높이: 20cm)에 마우스를 놓고 카메라를 사용하여 3분 동안 자발적으로 서 있는 탐색 행동을 기록합니다(그림 2B).
      참고: 실험 절차 중에는 앞다리 움직임을 최적으로 기록할 수 있도록 두 개의 거울이 실린더를 따라 배치되었습니다.
   2. 후속 마우스를 테스트하기 전에 잔류 후각 신호를 제거하기 위해 실린더를 75% 에탄올로 닦습니다.
   3. 비디오 재생 속도를 실제 속도의 1/5로 줄이고 왼쪽(L) 또는 오른쪽 앞발(R)로 벽을 터치하거나 두 앞발을 동시에 사용(B)한 횟수를 계산합니다. 오른쪽 앞발의 사용률을 (L-R)/(L + R + B) × 100%로 계산합니다.

5. 관류 및 시료 전처리

1. 펜토바르비탈(pentobarbital)의 복막 주사 과다 투여(300mg/kg)로 마우스를 안락사시킨다. 마우스를 누운 자세로 놓고 팔다리를 움직이지 못하게 합니다.
2. 복부 중앙강에서 시작하여 가슴 위쪽 부위로 뻗어 있는 피부의 정중선을 절개합니다.
3. 수술용 가위를 사용하여 가슴을 열고 지혈제를 사용하여 시포를 위쪽으로 접습니다. 폐와 횡격막을 조심스럽게 제거하여 심장을 노출시킵니다.
4. 관류 바늘 끝을 좌심실에 삽입하고 가위로 우심방을 뚫습니다. 좌심실을 통해 20mL의 생리식염수를 심장에 관류합니다.
5. 쥐의 목을 베고 눈 사이의 정중선을 따라 두피를 잘라냅니다. 두개골 기저부에서 시작하여 안와까지 양쪽을 따라 뼈를 자릅니다.
6. 종아리움을 들어 올리고 집게를 사용하여 두개골 기저부에서 뇌를 부드럽게 분리합니다.
   참고 : 마우스의 절반의 뇌는 2,3,5- 트리 페닐 테트라 졸륨 클로라이드 (TTC) 염색을 받았고, 다른 절반의 뇌는 조직 학적 검사를 받았습니다.
7. 후속 조직학적 분석을 위해 4% 파라포름알데히드 용액에 뇌를 하룻밤 동안 담그십시오.

6. 경색의 용적 파악

1. 뇌를 -20 °C 냉장고의 냉동실에 20분 동안 넣습니다.
2. 뇌를 1mm의 뇌 기질에 위치시키고 마이크로톰 블레이드를 사용하여 뇌를 2mm 두께의 관상동맥 절편으로 절단합니다.
3. 뇌 절편을 24웰 배양 플레이트로 옮기고 2% TTC를 추가하여 뇌 조직을 덮습니다. 24웰 배양 플레이트를 30°C로 설정된 상태에서 37분 동안 항온 오븐에 넣습니다.
4. 뇌 부분을 조심스럽게 들어 올려 4% 파라포름알데히드 용액에 15분 동안 고정합니다.
5. 스캐니스터를 통해 1200 x 1200 dpi의 해상도로 이러한 뇌 절편의 광학 스캔을 수행합니다.
6. Image J 소프트웨어 (https://imagej.net/software/imagej/index)를 사용하여 각 섹션의 경색 영역(우반구 면적에서 좌반구의 손상되지 않은 영역을 뺀 값)을 합산하여 대뇌경색 부피를 측정합니다()¹⁸. 경색 부피 백분율을 경색 부피/우반구의 부피 × 100%로 계산합니다.

7. 조직병리학 및 면역형광 염색 분석

1. 파라포름알데히드 용액에서 뇌 샘플을 채취하여 흐르는 물로 1시간 동안 씻어냅니다.
2. 뇌 샘플을 자동화 조직 탈수 기계로 옮깁니다. 탈수, 유리화 및 왁스 침수를 위한 사전 설정 프로그램을 시작합니다. 탈수된 뇌 샘플을 파라핀에 넣고 마이크로톰으로 5μm 두께의 절편으로 자릅니다.
3. 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색
   1. 자일렌으로 절편을 3분 동안 각각 8번 왁스를 제거합니다.
   2. 그래디언트 에탄올(100%, 95%, 90%, 80%, 70%)과 증류수에 매번 5분 동안 연속적으로 담가 섹션을 재수화합니다.
   3. 헤마톡실린 용액으로 섹션을 5분 동안 염색합니다.
   4. 증류수로 섹션을 헹구어 잔류 물 헤마 톡실린 (hematoxylin)을 세척 한 다음 5 % 염산 알코올에 담그어 5-s 분화를합니다. 증류수로 섹션을 2분 동안 세척합니다.
   5. 에오신 용액으로 섹션을 30초 동안 염색하고 증류수를 사용하여 과도한 염색액을 헹굽니다.
   6. 90% 에탄올, 95% 에탄올, 100% 에탄올 및 크실렌(2회)에 매번 5분 동안 연속적으로 섹션을 담급니다. 중성 발삼 장착 매체로 섹션을 장착합니다.
4. 면역형광 염색
   1. 매번 3분 동안 크실렌으로 섹션을 8번 왁스를 제거합니다.
   2. 그라디언트 에탄올(100%, 95%, 90%, 80%, 70%)과 증류수에 매번 5분 동안 연속적으로 담가 섹션을 재수화합니다.
   3. 구연산염 항원 회수 용액을 예열하여 전자레인지에서 끓입니다. 항원 회수 용액에 섹션을 담그십시오. 항원 회수 버퍼를 저전력(20W)으로 20분 동안 재가열합니다.
   4. 전자레인지를 끄고 항원 검색 버퍼를 실온(RT)으로 식힙니다.
   5. 매번 0.1mM 인산염 완충 식염수(PBS)로 섹션을 5분 동안 세 번 세척합니다.
   6. 면역글로불린의 비특이적 결합을 차단하기 위해 차단 용액(5% 소 혈청 알부민)으로 절편을 RT에서 1시간 동안 배양합니다.
   7. 토끼 항-NeuN 항체(1:300), 토끼 항-Iba-1 항체(1:500) 및 마우스 항-GFAP 항체(1:500)로 절편을 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
   8. 매번 0.1mM PBS로 5분 동안 섹션을 세 번 세척합니다.
   9. 염소 항 토끼 Alexa 594 접합 IgG (1 : 500) 또는 염소 항 마우스 Alexa 488 접합 IgG (1 : 500)로 절편을 RT에서 1 시간 동안 배양합니다.
   10. 0.1mM PBS로 섹션을 세척하고 4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)이 포함된 페이드 방지 장착 미디어로 장착합니다.
   11. 각각 594 nm 및 488 nm에서 형광 현미경을 사용하여 허혈성 반음부 내의 3개의 미세한 필드(300 μm × 300 μm)의 이미지를 촬영합니다.
   12. ImageJ 소프트웨어(https://imagej.net/software/imagej/index)를 사용하여 허혈성 반그림자¹⁹의 수를 평균화하여 양성으로 염색된 세포 밀도를 추정합니다.

결과

dMCAO를 수행하는 데 사용되는 주요 기기는 그림 1과 같이 미세수술 기기 세트, 이소플루란 기화기 및 단극성 미세수술 전기응고 발생기입니다. 이 연구의 실험 절차는 그림 2와 같습니다. 간단히 말해서, 원위 MCA를 노출시키기 위해 작은 뼈 창 개두술을 사용했으며, 이후 응고되어 C57BL/6 마우스에서 영구적인 국소 대뇌 허혈을 유발했습니다. 또한, dMCAO ?...

토론

개두술 전기응고 dMCAO 모델의 현재 프로토콜에서, 수술 절차는 최소한의 침습성으로 수행되며, 여기서 측두근의 일부만 분리하여 저작 기능에 대한 부작용을 완화합니다. 생쥐들은 모두 시술 후 잘 회복되었으며, 섭식에 어려움을 겪는 사례는 관찰되지 않았다. MCA는 마우스의 측두골에서 쉽게 식별할 수 있으므로 적절한 개두술 위치를 정확하게 식별할 수 있습니다. 이 dMCAO 모델에 의한 허혈성 병...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride (TTC)	Sigma-Aldrich	108380	Dye for TTC staining
24-well culture plate	Corning (USA)	CLS3527	Vessel for TTC staining
4% paraformaldehyde	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.	G1101	Tissue fixation
5% bovine serum albumin	Wuhan BOSTER Bio Co., Ltd.	AR004	Non-specific antigen blocking
5-0 Polyglycolic acid suture	Jinhuan Medical Co., Ltd	KCR531	Material for surgery
Anesthesia machine	Midmark Corporation	VMR	Anesthetized animal
Antifade mounting medium	Beyotime Biotech	P0131	Seal for IF staining
Automation-tissue-dehydrating  machine	Leica Biosystems (Germany)	TP1020	Dehydrate tissue
Depilatory cream	Veet (France)	20220328	Material for surgery
Diclofenac sodium gel	Wuhan Ma Yinglong Pharmaceutical  Co., Ltd.	H10950214	Analgesia for animal
Drill tip (0.8 mm)	Rwd Life Science Co., Ltd.		Equipment for surgery
Eosin staining solution	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.	G1001	Dye for H&E staining
Eye ointment	Guangzhou Pharmaceutical Co., Ltd	H44023098	Material for surgery
Fluorescence microscope	Olympus (Japan)	BX51	Image acquisition
GFAP Mouse monoclonal antibody	Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA)	3670	Primary antibody for IF staining
Goat anti-mouse Alexa 488-conjugated IgG	Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA)	4408	Second antibody for IF staining
Goat anti-rabbit Alexa 594-conjugated IgG	Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA)	8889	Second antibody for IF staining
Grip strength meter	Shanghai Xinruan Information Technology Co., Ltd.	XR501	Equipment for behavioral test
Hematoxylin staining solution	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.	G1004	Dye for H&E staining
Iba1 Rabbit monoclonal antibody	Abcam	ab178846	Primary antibody for IF staining
Isoflurane	Rwd Life Science Co., Ltd.	R510-22-10	Anesthetized animal
Laser doppler blood flow meter	Moor Instruments (UK)	moorVMS	Blood flow monitoring
Meloxicam	Boehringer-Ingelheim	J20160020	Analgesia for animal
Microdrill	Rwd Life Science Co., Ltd.	78001	Equipment for surgery
Microsurgical instruments set	Rwd Life Science Co., Ltd.	SP0009-R	Equipment for surgery
Microtome	Thermo Fisher Scientific (USA)	HM325	Tissue section production
Microtome blade	Leica Biosystems (Germany)	819	Tissue section production
Monopolar electrocoagulation generator	Spring Scenery Medical Instrument Co., Ltd.	CZ0001	Equipment for surgery
Mupirocin ointment	Tianjin Smith Kline & French Laboratories Ltd.	H10930064	Anti-infection for animal
NeuN Rabbit monoclonal antibody	Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA)	24307	Primary antibody for IF staining
Neutral balsam	Absin Bioscience	abs9177	Seal for H&E staining
Paraffin embedding center	Thermo Fisher Scientific (USA)	EC 350	Produce paraffin blocks
Pentobarbital sodium	Sigma-Aldrich	P3761	Euthanized animal
Phosphate buffered saline	Shanghai Beyotime Biotech Co., Ltd	C0221A	Rinsing for tissue section
Shaver	Shenzhen Codos Electrical Appliances Co.,Ltd.	CP-9200	Equipment for surgery
Sodium citrate solution	Shanghai Beyotime Biotech Co., Ltd.	P0083	Antigen retrieval for IF staining