원위 중동맥 폐색 기법을 사용한 마우스의 급성 허혈성 뇌졸중 유도

요약

여기에서는 C57BL/6J 마우스에서 경두개 전기응고를 통해 원위 중뇌동맥 폐색(dMCAO) 모델을 확립하고 후속 신경학적 행동 및 조직병리학적 특징을 평가하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

초록

허혈성 뇌졸중은 전 세계 성인 인구의 사망률과 기능 장애의 주요 원인으로 남아 있습니다. 소수의 허혈성 뇌졸중 환자만이 최적의 시간 창 내에 혈관 내 혈전용해 또는 기계적 혈전 절제술을 받을 수 있습니다. 이러한 뇌졸중 생존자 중 약 3분의 2는 장기간에 걸쳐 신경 기능 장애를 겪습니다. 안정적이고 반복 가능한 실험적 허혈성 뇌졸중 모델을 확립하는 것은 병태생리학적 메커니즘을 추가로 조사하고 허혈성 뇌졸중에 대한 효과적인 치료 전략을 개발하는 데 매우 중요합니다. 중뇌동맥(MCA)은 인간에서 허혈성 뇌졸중의 주요 위치를 나타내며, MCA 폐색은 국소 대뇌 허혈의 자주 사용되는 모델 역할을 합니다. 이 프로토콜에서는 C57BL/6 마우스에서 경두개 전기 응고를 통해 원위 MCA 폐색(dMCAO) 모델을 설정하는 방법론을 설명합니다. 폐색 부위가 MCA의 대뇌 피질 가지에 위치하기 때문에 이 모델은 피질에 국한된 중등도의 경색 병변을 생성합니다. 신경학적 행동 및 조직병리학적 특성 분석은 이 모델에서 눈에 띄는 운동 기능 장애, 뉴런 퇴행, 미세아교세포 및 성상교세포의 뚜렷한 활성화를 보여주었습니다. 따라서 이 dMCAO 마우스 모델은 허혈 뇌졸중과 대중화의 가치를 조사하는 데 유용한 도구를 제공합니다.

서문

뇌졸중은 흔한 급성 뇌혈관 질환으로 장애와 사망률이 높은 것이 특징이다¹. 모든 뇌졸중 사례 중 거의 80%가 허혈성 뇌졸중에 속합니다². 현재까지 정맥 혈전용해술은 급성 허혈성 뇌졸중 치료를 위한 제한적이고 생산적인 접근법 중 하나로 남아 있습니다. 그러나, 혈전용해 치료의 효과는 효과적인 기간이 좁고 출혈성 변형의 발생에 의해 제한된다³. 허혈성 뇌졸중 후 장기 재활 단계에서 상당수의 환자가 지속적인 신경기능 장애를 경험할 가능성이 높다⁴. 허혈성 뇌졸중의 근본적인 병태생리학적 기전을 밝히고 허혈성 뇌졸중을 표적으로 하는 새로운 치료 전략의 개발을 촉진하기 위해 추가 연구가 시급히 필요합니다. 허혈성 뇌졸중의 신뢰할 수 있고 재현 가능한 모델을 확립하는 것은 허혈성 뇌졸중 분야의 기초 연구뿐만 아니라 후속 중개 연구에도 중요합니다.

1981년 Tamura et al.은 중뇌동맥(MCA)의 근위 부위에서 경두개 전기응고를 사용하여 국소 대뇌 허혈 모델을 개발했습니다.⁵. 그 이후로 수많은 연구자들이 일과적 또는 영구적 허혈성 뇌졸....

프로토콜

실험 프로토콜은 Jianghan University의 Institutional Animal Care and Use Committee의 승인을 받았으며 중국 질병 통제 센터에서 발행한 실험 동물 윤리 지침에 따라 수행되었습니다. 이 프로토콜에는 10주령의 24-26g의 성인 수컷 C57BL/6J 마우스가 사용되었습니다. 모든 마우스는 음식과 물이 포함된 12시간 빛/어두운 주기 제어 환경에서 수용되었습니다 .

1. 수술 전 준비

참고: 이 프로토콜에 필요한 주요 기기 및 장비는 그림 1에 나와 있습니다.

1. 시술 전에 고압멸균으로 수술 기구를 멸균하십시오.
2. 수술 60분 전에 진통을 위해 5mg/kg의 용량으로 멜록시캠을 피하 투여합니다.
3. 유도 챔버에서 5% 이소플루란으로 마우스를 마취합니다.
4. 가열 수술 보드를 75% 에탄올로 닦고 온도를 37°C로 설정한 상태에서 가열 스위치를 활성화합니다. 그런 다음 머리는 외과 의사로부터 멀리 배치하고 꼬리는 외과 의사를 향하도록 하여 마우스를 보드의 왼쪽 측면 위치에 놓습니다.
....

토론

개두술 전기응고 dMCAO 모델의 현재 프로토콜에서, 수술 절차는 최소한의 침습성으로 수행되며, 여기서 측두근의 일부만 분리하여 저작 기능에 대한 부작용을 완화합니다. 생쥐들은 모두 시술 후 잘 회복되었으며, 섭식에 어려움을 겪는 사례는 관찰되지 않았다. MCA는 마우스의 측두골에서 쉽게 식별할 수 있으므로 적절한 개두술 위치를 정확하게 식별할 수 있습니다. 이 dMCAO 모델에 의한 허혈성 병.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride (TTC)	Sigma-Aldrich	108380	Dye for TTC staining
24-well culture plate	Corning (USA)	CLS3527	Vessel for TTC staining
4% paraformaldehyde	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.	G1101	Tissue fixation
5% bovine serum albumin	Wuhan BOSTER Bio Co., Ltd.	AR004	Non-specific antigen blocking
5-0 Polyglycolic acid suture	Jinhuan Medical Co., Ltd	KCR531	Material for surgery
Anesthesia machine	Midmark Corporation	VMR	Anesthetized animal
Antifade mounting medium	Beyotime Biotech	P0131	Seal for IF staining
Automation-tissue-dehydrating  machine	Leica Biosystems (Germany)	TP1020	Dehydrate tissue
Depilatory cream	Veet (France)	20220328	Material for surgery
Diclofenac sodium gel	Wuhan Ma Yinglong Pharmaceutical  Co., Ltd.	H10950214	Analgesia for animal
Drill tip (0.8 mm)	Rwd Life Science Co., Ltd.		Equipment for surgery
Eosin staining solution	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.	G1001	Dye for H&E staining
Eye ointment	Guangzhou Pharmaceutical Co., Ltd	H44023098	Material for surgery
Fluorescence microscope	Olympus (Japan)	BX51	Image acquisition
GFAP Mouse monoclonal antibody	Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA)	3670	Primary antibody for IF staining
Goat anti-mouse Alexa 488-conjugated IgG	Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA)	4408	Second antibody for IF staining
Goat anti-rabbit Alexa 594-conjugated IgG	Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA)	8889	Second antibody for IF staining
Grip strength meter	Shanghai Xinruan Information Technology Co., Ltd.	XR501	Equipment for behavioral test
Hematoxylin staining solution	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.	G1004	Dye for H&E staining
Iba1 Rabbit monoclonal antibody	Abcam	ab178846	Primary antibody for IF staining
Isoflurane	Rwd Life Science Co., Ltd.	R510-22-10	Anesthetized animal
Laser doppler blood flow meter	Moor Instruments (UK)	moorVMS	Blood flow monitoring
Meloxicam	Boehringer-Ingelheim	J20160020	Analgesia for animal
Microdrill	Rwd Life Science Co., Ltd.	78001	Equipment for surgery
Microsurgical instruments set	Rwd Life Science Co., Ltd.	SP0009-R	Equipment for surgery
Microtome	Thermo Fisher Scientific (USA)	HM325	Tissue section production
Microtome blade	Leica Biosystems (Germany)	819	Tissue section production
Monopolar electrocoagulation generator	Spring Scenery Medical Instrument Co., Ltd.	CZ0001	Equipment for surgery
Mupirocin ointment	Tianjin Smith Kline & French Laboratories Ltd.	H10930064	Anti-infection for animal
NeuN Rabbit monoclonal antibody	Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA)	24307	Primary antibody for IF staining
Neutral balsam	Absin Bioscience	abs9177	Seal for H&E staining
Paraffin embedding center	Thermo Fisher Scientific (USA)	EC 350	Produce paraffin blocks
Pentobarbital sodium	Sigma-Aldrich	P3761	Euthanized animal
Phosphate buffered saline	Shanghai Beyotime Biotech Co., Ltd	C0221A	Rinsing for tissue section
Shaver	Shenzhen Codos Electrical Appliances Co.,Ltd.	CP-9200	Equipment for surgery
Sodium citrate solution	Shanghai Beyotime Biotech Co., Ltd.	P0083	Antigen retrieval for IF staining