Induzione di ictus ischemico acuto nei topi utilizzando la tecnica di occlusione dell'arteria media distale

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per stabilire un modello di occlusione dell'arteria cerebrale media distale (dMCAO) attraverso l'elettrocoagulazione transcranica in topi C57BL/6J e valutare il successivo comportamento neurologico e le caratteristiche istopatologiche.

Abstract

L'ictus ischemico rimane la causa predominante di mortalità e compromissione funzionale tra le popolazioni adulte a livello globale. Solo una minoranza di pazienti con ictus ischemico è idonea a ricevere la trombolisi intravascolare o la terapia di trombectomia meccanica entro la finestra temporale ottimale. Tra i sopravvissuti all'ictus, circa due terzi soffrono di disfunzioni neurologiche per un periodo prolungato. La creazione di un modello sperimentale stabile e ripetibile di ictus ischemico è estremamente importante per indagare ulteriormente i meccanismi fisiopatologici e sviluppare strategie terapeutiche efficaci per l'ictus ischemico. L'arteria cerebrale media (MCA) rappresenta la posizione predominante dell'ictus ischemico nell'uomo, con l'occlusione MCA che funge da modello frequentemente impiegato di ischemia cerebrale focale. In questo protocollo, descriviamo la metodologia per stabilire il modello di occlusione MCA distale (dMCAO) attraverso l'elettrocoagulazione transcranica in topi C57BL/6. Poiché il sito di occlusione si trova nel ramo corticale dell'MCA, questo modello genera una lesione infartuale moderata limitata alla corteccia. In questo modello, la caratterizzazione neurologica, comportamentale e istopatologica ha dimostrato una visibile disfunzione motoria, degenerazione neuronale e pronunciata attivazione di microglia e astrociti. Pertanto, questo modello murino dMCAO fornisce uno strumento prezioso per indagare sull'ischemiaictus e merita la popolarità.

Introduzione

L'ictus è una comune malattia cerebrovascolare acuta caratterizzata da un'elevata incidenza di disabilità e mortalità¹. Di tutti i casi di ictus, quasi l'80% appartiene all'ictus ischemico². Fino ad ora, la trombolisi endovenosa rimane uno dei pochi approcci produttivi per il trattamento dell'ictus ischemico acuto. Tuttavia, l'efficacia del trattamento trombolitico è limitata dalla ristretta finestra temporale effettiva e dal verificarsi di trasformazione emorragica³. Nella fase di riabilitazione a lungo termine a seguito di un ictus ischemico, è probabile che un numero considerevole di pazienti manifesti disfunzioni neurologiche durature⁴. Sono urgentemente necessarie ulteriori indagini per svelare i meccanismi fisiopatologici alla base dell'ictus ischemico, nonché per facilitare lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche mirate all'ictus ischemico. La creazione di un modello affidabile e replicabile di ictus ischemico è fondamentale per la ricerca di base e per la successiva ricerca traslazionale nel campo dell'ictus ischemico.

Nel 1981, Tamura et al. hanno sviluppato un modello di ischemia cerebrale focale impiegando l'elettrocoagulazione transcranica nel sito prossimale dell'arteria cerebrale media (MCA)⁵. Da allora, numerosi ricercatori hanno utilizzato varie metodologie come la legatura, la compressione o il clipping per indurre l'occlusione MCA distale (dMCAO) per stabilire modelli di ictus ischemico transitorio o permanente ^6,7,8. Rispetto al modello a filamento, il modello dMCAO presenta notevoli vantaggi come dimensioni dell'infarto più piccole e un tasso di sopravvivenza più elevato, che lo rendono più adatto per studiare il recupero funzionale a lungo termine dopo l'ictus ischemico⁹. Inoltre, il modello dMCAO dimostra un tasso di sopravvivenza più elevato nei roditori anziani rispetto al modello a filamento, rendendolo uno strumento vantaggioso per studiare l'ictus ischemico in modelli animali anziani e in comorbidità¹⁰. È stato dimostrato che il modello di ictus fototrombotico (PT) possiede le caratteristiche di una minore invasività chirurgica e di un tasso di mortalità significativamente basso. Tuttavia, il modello PT mostra un grado maggiore di necrosi cellulare ed edema tissutale rispetto al modello dMCAO, portando all'assenza di circolazione collaterale¹¹. Inoltre, è interessante notare che le lesioni ischemiche osservate nel modello PT derivano prevalentemente dall'occlusione microvascolare, che differisce sostanzialmente dall'ischemia cerebrale indotta da embolia dei grandi vasi nel modello dMCAO¹².

In questo articolo, presentiamo la metodologia per indurre il modello murino di dMCAO coagulando l'MCA distale tramite craniotomia a finestra ossea piccola. Inoltre, abbiamo condotto esami istologici e valutazioni comportamentali per caratterizzare in modo completo gli insulti ischemici e gli esiti dell'ictus in questo modello sperimentale. Il nostro obiettivo è quello di far conoscere ai ricercatori questo modello e facilitare ulteriori indagini sui meccanismi patologici dell'ictus ischemico.

Protocollo

Il protocollo sperimentale è stato approvato dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università di Jianghan ed è stato condotto in conformità con le Linee Guida Etiche per gli Animali da Esperimento emesse dal Centro per il Controllo delle Malattie della Cina. In questo protocollo sono stati utilizzati topi maschi adulti C57BL/6J, di 10 settimane, del peso di 24-26 g. Tutti i topi sono stati alloggiati in un ambiente controllato con ciclo luce/buio di 12 ore con cibo e acqua ad libitum.

1. Preparazione preoperatoria

NOTA: Gli strumenti e le apparecchiature chiave necessari per questo protocollo sono mostrati nella Figura 1.

1. Prima della procedura, sterilizzare gli strumenti chirurgici mediante autoclave.
2. Somministrare meloxicam per via sottocutanea alla dose di 5 mg/kg per analgesia 60 minuti prima dell'intervento chirurgico.
3. Anestetizzare il topo con isoflurano al 5% in una camera di induzione.
4. Pulire la tavola chirurgica con etanolo al 75% e azionare l'interruttore del riscaldamento con la temperatura impostata a 37 °C. Quindi, posiziona il mouse in una posizione laterale sinistra sulla tavola, con la testa posizionata lontano dal chirurgo e la coda rivolta verso il chirurgo.
5. Applicare una maschera al viso del topo che fornisca un apporto costante del 2% di isoflurano e 0,3 L/min di ossigeno per l'anestesia di mantenimento. Applicare l'unguento per gli occhi sulla cornea per proteggerla dalla secchezza durante la procedura.
6. Radi il pelo dall'orbita sinistra al condotto uditivo sinistro con un rasoio. Utilizzare creme depilatorie per rimuovere il pelo rimanente per la sterilizzazione.
7. Preparare l'area chirurgica applicando tre volte il disinfettante a base di iodio povidone ed etanolo al 75%.

2. Modello MCAO distale

1. Controlla se il topo è profondamente anestetizzato valutando i riflessi del pizzicamento del dito del piede.
2. Praticare un'incisione verticale tra l'orbita sinistra e il condotto uditivo sinistro utilizzando una lama di bisturi sterile.
3. Ritrarre i tessuti molli della pelle con i divaricatori ed esporre il muscolo temporale.
4. Usa micropinze diritte per separare i segmenti apicale e dorsale del muscolo temporale dal cranio.
5. Identificare la biforcazione dell'MCA, che assume una forma a "Y" sotto l'osso temporale con una tendenza verso la base del cranio (Figura 2A).
   NOTA: Se la biforcazione dell'MCA non è visivamente distinguibile (a causa di una variazione anatomicamente normale), accertare il vaso più rostrale.
6. Usa un trapano cranico elettrico per assottigliare il cranio per creare una finestra ossea (4 mm di diametro) fino a quando la dura madre, con la sua consistenza traslucida, diventa visibile.
   NOTA: Aggiungere in modo intermittente gocce di soluzione fisiologica normale al cranio per evitare il surriscaldamento durante questo processo.
7. Rimuovere la dura madre sopra l'arteria con una micro pinza curva per esporre il ramo MCA.
8. Impostare l'elettrocauterizzazione a 7 W. Coagulare l'arteria utilizzando la pinza elettrica per coagulazione nei siti prossimali e distali rispetto alla biforcazione dell'MCA (Figura 2A). Quando la biforcazione non è visibile a causa di una variazione anatomica, eseguire la coagulazione sul ramo MCA accuratamente identificato (come menzionato sopra) in due posizioni separate a circa 1 mm di distanza¹³.
9. Monitora il flusso sanguigno del ramo corticale sinistro dell'MCA utilizzando un misuratore di flusso sanguigno a macchie laser.
   NOTA: I topi che presentavano una riduzione del flusso sanguigno inferiore al 40% del valore basale dopo l'elettrocoagulazione sono stati esclusi dallo studio.
10. Sutura il muscolo e la pelle separatamente utilizzando suture di acido poliglicolico 5-0. Applicare il gel di diclofenac sodico e l'unguento alla mupirocina sull'incisione cutanea utilizzando un batuffolo di cotone sterile.
11. Posiziona il mouse in una camera di recupero. Monitora tutti i topi fino a quando non sono completamente svegli. Somministrare meloxicam (5 mg/kg, SC) per l'analgesia ogni 24 ore fino a 72 ore.

3. Operazione fittizia

1. Riprodurre la stessa procedura sopra menzionata, escluso il processo di coagulazione arteriosa.

4. Test comportamentali

NOTA: Prima del dMCAO, i topi sono stati sottoposti a training comportamentale due volte al giorno per 3 giorni. Il 3^{° giorno dopo} il dMCAO, spostare i topi nella sala dei test comportamentali per un adattamento ambientale di 2 ore prima del test.

1. Test di forza di presa¹⁴
   NOTA: Il misuratore della forza di presa comprende un estensimetro push-pull e una barra orizzontale in metallo.
   1. Afferra la base della coda del topo. Abbassare gradualmente il mouse verso la barra di presa in metallo fino a quando non afferra la barra orizzontale con entrambe le zampe anteriori (Figura 2B).
   2. Tirare il mouse all'indietro a una velocità costante di circa 2 cm/s e mantenere il corpo orizzontale.
   3. Registra la forza di picco in grammi (g) quando il topo rilascia le zampe anteriori dalla barra.
2. Prova con i bastoncini¹⁵
   1. Posiziona il topo sulla cima di un palo di legno verticale (50 cm di altezza, 1 cm di diametro) con la testa rivolta verso l'alto e lascialo scendere dal palo (Figura 2B).
   2. Registra il tempo impiegato dal mouse per girarsi (inversione a T) e il tempo totale per scendere dal palo (T-total) con un tempo limite di 60 secondi.
3. Test di rimozione del nastro adesivo¹⁶
   1. Tenere il mouse e applicare un cerotto di nastro adesivo (2 × 2 mm) alla zampa anteriore destra del mouse (Figura 2B).
   2. Rimetti il topo nella gabbia di allevamento e lascialo muovere liberamente.
   3. Registra il tempo impiegato dal mouse per rimuovere l'adesivo con un limite di 60 s.
4. Prova cilindro¹⁷
   1. Posizionare il topo in un cilindro di vetro trasparente aperto (diametro: 14 cm; altezza: 20 cm) e registrare il suo comportamento esplorativo spontaneo in piedi per 3 minuti utilizzando una telecamera (Figura 2B).
      NOTA: Durante la procedura sperimentale, due specchi sono stati posizionati lungo il cilindro per garantire una registrazione ottimale dei movimenti degli arti anteriori.
   2. Pulire il cilindro con etanolo al 75% per eliminare i segnali olfattivi residui prima di testare il mouse successivo.
   3. Riduci la velocità di riproduzione del video a 1/5 della velocità effettiva e conta il numero di tocchi con la zampa anteriore sinistra (L) o destra (R) o l'uso simultaneo di entrambe le zampe anteriori (B). Calcola il tasso di utilizzo della zampa anteriore destra come (L-R)/(L + R + B) × 100%.

5. Perfusione e preparazione del campione

1. Eutanasia del topo mediante sovradosaggio di pentobarbital per iniezione peritoneale (300 mg/kg). Posizionare il mouse in posizione supina e immobilizzare gli arti.
2. Praticare un'incisione sulla linea mediana sulla pelle, partendo dalla cavità medio-addominale ed estendendosi verso la regione superiore del torace.
3. Apri il torace usando le forbici chirurgiche e piega lo xifoide verso l'alto usando un emostato. Rimuovere con cautela il polmone e il diaframma per esporre il cuore.
4. Inserire la punta dell'ago di perfusione nel ventricolo sinistro e perforare l'atrio destro con le forbici. Perfondere il cuore con 20 ml di soluzione fisiologica normale attraverso il ventricolo sinistro.
5. Decapita il topo e taglia il cuoio capelluto lungo la linea mediana tra gli occhi. Taglia l'osso lungo entrambi i lati, partendo dalla base del cranio e aprendoti fino all'orbita.
6. Solleva il calvario e stacca delicatamente il cervello dalla base del cranio usando una pinza.
   NOTA: I cervelli di metà dei topi sono stati sottoposti a colorazione con 2,3,5-trifenil tetrazolio cloruro (TTC), mentre i cervelli dell'altra metà sono stati sottoposti a esame istologico.
7. Immergere il cervello in una soluzione di paraformaldeide al 4% durante la notte per l'analisi istologica di follow-up.

6. Identificazione del volume dell'infarto

1. Mettere il cervello in uno scomparto congelatore a -20 °C del frigorifero per 20 minuti.
2. Posizionare il cervello nella matrice cerebrale di 1 mm e tagliare il cervello in sezioni coronariche con uno spessore di 2 mm utilizzando lame per microtomo.
3. Trasferire le sezioni cerebrali in una piastra di coltura a 24 pozzetti e aggiungere il 2% di TTC per coprire il tessuto cerebrale. Mettere la piastra di coltura a 24 pozzetti in un forno a temperatura costante per 30 minuti con la temperatura impostata a 37 °C.
4. Sollevare con cautela le sezioni cerebrali e fissarle in una soluzione di paraformaldeide al 4% per 15 minuti.
5. Eseguire la scansione ottica di queste sezioni cerebrali con una risoluzione di 1200 x 1200 dpi con una scandina.
6. Misurare il volume dell'infarto cerebrale sommando l'area dell'infarto di ciascuna sezione (area dell'emisfero destro meno l'area illesa dell'emisfero sinistro) utilizzando il software Image J (https://imagej.net/software/imagej/index)¹⁸. Calcolare la percentuale di volume dell'infarto come volume/volume dell'infarto dell'emisfero destro × 100%.

7. Analisi istopatologica e immunofluorescente

1. Prelevare i campioni di cervello dalla soluzione di paraformaldeide e sciacquarli con acqua corrente per 1 ora.
2. Trasferire i campioni di cervello nella macchina di disidratazione dei tessuti di automazione. Avvia il programma preimpostato per la disidratazione, la vetrificazione e l'immersione in cera. Incorporare i campioni di cervello disidratato nella paraffina e tagliarli in sezioni spesse 5 μm con un microtomo.
3. Colorazione con ematossilina ed eosina (H&E)
   1. Decerare le sezioni con xilene 3 volte per 8 minuti ciascuna.
   2. Reidratare le sezioni immergendole successivamente in etanolo a gradiente (100%, 95%, 90%, 80%, 70%) e acqua distillata per 5 minuti ogni volta.
   3. Colorare le sezioni con la soluzione di ematossilina per 5 minuti.
   4. Sciacquare le sezioni con acqua distillata per lavare il residuo di ematossilina, quindi immergerle in alcol di acido cloridrico al 5% per una differenziazione di 5 secondi. Lavare le sezioni con acqua distillata per 2 minuti.
   5. Colorare le sezioni con una soluzione di eosina per 30 s e risciacquare il liquido colorante in eccesso con acqua distillata.
   6. Immergere le sezioni in etanolo al 90%, etanolo al 95%, etanolo al 100% e xilene (2 volte) in successione per 5 minuti ogni volta. Montare le sezioni con un mezzo di montaggio balsamico neutro.
4. Colorazione in immunofluorescenza
   1. Decerare le sezioni con xilene 3 volte per 8 minuti ogni volta.
   2. Reidratare le sezioni immergendole successivamente in etanolo a gradiente (100%, 95%, 90%, 80%, 70%) e acqua distillata per 5 minuti ogni volta.
   3. Preriscaldare la soluzione di recupero dell'antigene citrato per farla bollire nel microonde. Immergere le sezioni nella soluzione di recupero dell'antigene. Riscaldare il tampone di recupero dell'antigene a bassa potenza (20 W) per 20 minuti.
   4. Spegni il microonde e lascia raffreddare il tampone di recupero dell'antigene a temperatura ambiente (RT).
   5. Lavare le sezioni tre volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 0,1 mM per 5 minuti ogni volta.
   6. Incubare le sezioni con una soluzione bloccante (albumina sierica bovina al 5%) a RT per 1 ora per bloccare il legame non specifico dell'immunoglobulina.
   7. Incubare le sezioni con anticorpi anti-NeuN di coniglio (1: 300), anticorpi anti-Iba-1 di coniglio (1: 500) e anticorpi anti-GFAP di topo (1: 500) a 4°C per una notte.
   8. Lavare le sezioni tre volte con 0,1 mM di PBS per 5 minuti ogni volta.
   9. Incubare le sezioni con IgG coniugate Alexa 594 anti-coniglio di capra (1:500) o IgG coniugate Alexa 488 anti-topo di capra (1:500) per 1 ora a RT.
   10. Lavare le sezioni con 0,1 mM di PBS e montarle con un supporto di montaggio antisbiadimento contenente 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI).
   11. Acquisire immagini di tre campi microscopici (300 μm × 300 μm) all'interno della penombra ischemica utilizzando un microscopio a fluorescenza rispettivamente a 594 nm e 488 nm.
   12. Utilizzando il software ImageJ (https://imagej.net/software/imagej/index), stimare la densità cellulare colorata positivamente facendo la media dei conteggi nella penombra ischemica¹⁹.

Risultati

Gli strumenti chiave utilizzati per eseguire il dMCAO sono il set di strumenti microchirurgici, il vaporizzatore di isoflurano e il generatore di elettrocoagulazione microchirurgica monopolare mostrato nella Figura 1. La procedura sperimentale di questo studio è illustrata nella Figura 2. In breve, è stata impiegata una craniotomia a finestra ossea piccola per esporre l'MCA distale, che è stato successivamente coagulato per indurre un'ischemia cerebrale foca...

Discussione

Nell'attuale protocollo del modello dMCAO per elettrocoagulazione per craniotomia, le procedure chirurgiche sono condotte con un'invasività minima, in cui solo una parte del muscolo temporale viene separata per mitigare gli effetti avversi sulla funzione masticatoria. Tutti i topi si sono ripresi bene dopo la procedura, senza che siano stati osservati casi di difficoltà alimentari. L'MCA può essere facilmente individuato nell'osso temporale del topo, facilitando così l'identificazione precisa delle posizioni idonee p...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride (TTC)	Sigma-Aldrich	108380	Dye for TTC staining
24-well culture plate	Corning (USA)	CLS3527	Vessel for TTC staining
4% paraformaldehyde	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.	G1101	Tissue fixation
5% bovine serum albumin	Wuhan BOSTER Bio Co., Ltd.	AR004	Non-specific antigen blocking
5-0 Polyglycolic acid suture	Jinhuan Medical Co., Ltd	KCR531	Material for surgery
Anesthesia machine	Midmark Corporation	VMR	Anesthetized animal
Antifade mounting medium	Beyotime Biotech	P0131	Seal for IF staining
Automation-tissue-dehydrating  machine	Leica Biosystems (Germany)	TP1020	Dehydrate tissue
Depilatory cream	Veet (France)	20220328	Material for surgery
Diclofenac sodium gel	Wuhan Ma Yinglong Pharmaceutical  Co., Ltd.	H10950214	Analgesia for animal
Drill tip (0.8 mm)	Rwd Life Science Co., Ltd.		Equipment for surgery
Eosin staining solution	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.	G1001	Dye for H&E staining
Eye ointment	Guangzhou Pharmaceutical Co., Ltd	H44023098	Material for surgery
Fluorescence microscope	Olympus (Japan)	BX51	Image acquisition
GFAP Mouse monoclonal antibody	Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA)	3670	Primary antibody for IF staining
Goat anti-mouse Alexa 488-conjugated IgG	Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA)	4408	Second antibody for IF staining
Goat anti-rabbit Alexa 594-conjugated IgG	Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA)	8889	Second antibody for IF staining
Grip strength meter	Shanghai Xinruan Information Technology Co., Ltd.	XR501	Equipment for behavioral test
Hematoxylin staining solution	Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.	G1004	Dye for H&E staining
Iba1 Rabbit monoclonal antibody	Abcam	ab178846	Primary antibody for IF staining
Isoflurane	Rwd Life Science Co., Ltd.	R510-22-10	Anesthetized animal
Laser doppler blood flow meter	Moor Instruments (UK)	moorVMS	Blood flow monitoring
Meloxicam	Boehringer-Ingelheim	J20160020	Analgesia for animal
Microdrill	Rwd Life Science Co., Ltd.	78001	Equipment for surgery
Microsurgical instruments set	Rwd Life Science Co., Ltd.	SP0009-R	Equipment for surgery
Microtome	Thermo Fisher Scientific (USA)	HM325	Tissue section production
Microtome blade	Leica Biosystems (Germany)	819	Tissue section production
Monopolar electrocoagulation generator	Spring Scenery Medical Instrument Co., Ltd.	CZ0001	Equipment for surgery
Mupirocin ointment	Tianjin Smith Kline & French Laboratories Ltd.	H10930064	Anti-infection for animal
NeuN Rabbit monoclonal antibody	Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA)	24307	Primary antibody for IF staining
Neutral balsam	Absin Bioscience	abs9177	Seal for H&E staining
Paraffin embedding center	Thermo Fisher Scientific (USA)	EC 350	Produce paraffin blocks
Pentobarbital sodium	Sigma-Aldrich	P3761	Euthanized animal
Phosphate buffered saline	Shanghai Beyotime Biotech Co., Ltd	C0221A	Rinsing for tissue section
Shaver	Shenzhen Codos Electrical Appliances Co.,Ltd.	CP-9200	Equipment for surgery
Sodium citrate solution	Shanghai Beyotime Biotech Co., Ltd.	P0083	Antigen retrieval for IF staining